Immunomoduleerivad metaboliidid on kasvaja mikrokeskkonna (TME) võtmeelement, kuid mõne erandiga on nende identiteet suures osas teadmata. Selles uuringus analüüsisime kõrge astme seroosse kartsinoomi (HGSC) patsientide kasvajatest ja astsiidist pärinevaid kasvajaid ja T-rakke, et paljastada nende erinevate TME-kompartmentide metaboliit. Astsiidil ja kasvajarakkudel on ulatuslikud metaboliitide erinevused. Võrreldes astsiidiga on kasvajasse infiltreeruvad T-rakud 1-metüülnikotiinamiidi (MNA) poolest oluliselt rikastatud. Kuigi MNA tase T-rakkudes on kõrgem, piirdub nikotiinamiid-N-metüültransferaasi (ensüüm, mis katalüüsib metüülrühmade ülekannet S-adenosüülmetioniinist nikotiinamiidile) ekspressioon fibroblastide ja kasvajarakkudega. Funktsionaalselt indutseerib MNA T-rakke kasvajat soodustava tsütokiini tuumorinekroosifaktor alfa eritamiseks. Seega aitab TME-st saadud MNA kaasa T-rakkude immuunregulatsioonile ja kujutab endast potentsiaalset immunoteraapia sihtmärki inimese vähi ravis.
Kasvajast pärinevatel metaboliitidel võib olla tugev pärssiv toime kasvajavastasele immuunsusele ning üha rohkem tõendeid näitab, et need võivad olla ka haiguse progresseerumise peamiseks liikumapanevaks jõuks (1). Lisaks Warburgi efektile on hiljuti alustatud tööd kasvajarakkude metaboolse seisundi ja selle seose iseloomustamiseks kasvaja mikrokeskkonna (TME) immuunseisundiga. Uuringud hiiremudelite ja inimese T-rakkudega on näidanud, et glutamiini metabolism (2), oksüdatiivne metabolism (3) ja glükoosi metabolism (4) võivad erinevatele immuunrakkude alarühmadele sõltumatult mõjuda. Mitmed metaboliidid nendes radades pärsivad T-rakkude kasvajavastast funktsiooni. On tõestatud, et koensüüm tetrahüdrobiopteriini (BH4) blokeerimine võib kahjustada T-rakkude proliferatsiooni ja BH4 suurenemine organismis võib suurendada CD4 ja CD8 vahendatud kasvajavastast immuunvastust. Lisaks saab künureniini immunosupressiivset toimet BH4 manustamisega taastada (5). Isotsitraatdehüdrogenaasi (IDH) mutantses glioblastoomis pärsib enantiometaboolse (R)-2-hüdroksüglutaraadi (R-2-HG) sekretsioon T-rakkude aktivatsiooni, proliferatsiooni ja tsütolüüsi aktiivsust (6). Hiljuti on näidatud, et metüülglüoksaali, glükolüüsi kõrvalprodukti, toodavad müeloidset päritolu supressorrakud ja metüülglüoksaali ülekanne T-rakkudesse võib pärssida efektor-T-rakkude funktsiooni. Ravis võib metüülglüoksaali neutraliseerimine ületada müeloidist pärinevate supressorrakkude (MDSC) aktiivsuse ja sünergistlikult võimendada kontrollpunktide blokeerimise ravi hiiremudelites (7). Need uuringud rõhutavad ühiselt TME-st pärinevate metaboliitide võtmerolli T-rakkude funktsiooni ja aktiivsuse reguleerimisel.
T-rakkude düsfunktsiooni on munasarjavähi korral laialdaselt kirjeldatud (8). See on osaliselt tingitud hüpoksiale ja kasvaja ebanormaalsele veresoonkonnale omastest metaboolsetest omadustest (9), mille tulemuseks on glükoosi ja trüptofaani muundumine kõrvalproduktideks, nagu piimhape ja künureniin. Liigne rakuväline laktaat vähendab interferoon-γ (IFN-γ) tootmist ja soodustab müelosupressiivsete alarühmade diferentseerumist (10, 11). Trüptofaani tarbimine pärsib otseselt T-rakkude proliferatsiooni ja pärsib T-rakkude retseptori signaaliülekannet (12-14). Vaatamata neile tähelepanekutele tehti palju immuunmetabolismiga seotud tööd in vitro T-rakkude kultuuris, kasutades optimeeritud söötmeid, või piirdudes homoloogsete hiiremudelitega in vivo, millest kumbki ei kajasta täielikult inimese vähkide heterogeensust ega füsioloogilist makro- ja mikrokeskkonda.
Munasarjavähi levinud tunnus on levik kõhukelmesse ja astsiidi teke. Rakkude vedeliku kogunemine astsiidis on seotud kaugelearenenud haiguse ja halva prognoosiga (15). Aruannete kohaselt on see ainulaadne sektsioon hüpoksiline, selles on kõrge vaskulaarse endoteeli kasvufaktori (VEGF) ja indoleamiin-2,3-dioksügenaasi (IDO) tase ning seda infiltreerivad T-regulatoorsed rakud ja müeloidsed inhibeerivad rakud (15–18). Astsiidi metaboolne keskkond võib erineda kasvaja enda omast, seega on T-rakkude ümberprogrammeerimine kõhukelmeruumis ebaselge. Lisaks võivad kasvaja keskkonnas esinevate astsiidi ja metaboliitide peamised erinevused ja heterogeensus takistada immuunrakkude infiltratsiooni ja nende funktsiooni kasvajates ning vaja on täiendavaid uuringuid.
Nende probleemide lahendamiseks töötasime välja tundliku rakkude eraldamise ja vedelikkromatograafia tandem-massispektromeetria (LC-MS/MS) meetodi, et uurida erinevat tüüpi rakke (sealhulgas CD4+ ja CD8+ T-rakke) ning kasvajate sees ja nende vahel. Selle metaboliidid hõlmavad rakke samas astsiidi ja kasvaja keskkonnas, kus on ka patsient. Kasutame seda meetodit koos kõrgmõõtmelise voolutsütomeetria ja üherakulise RNA sekveneerimisega (scRNA-seq), et saada nende võtmepopulatsioonide metaboolse seisundi kohta kõrge eraldusvõimega pilt. See meetod näitas 1-metüülnikotiinamiidi (MNA) taseme olulist suurenemist kasvaja T-rakkudes ning in vitro katsed näitasid, et MNA immunomoduleeriv toime T-rakkude funktsioonile oli varem teadmata. Üldiselt näitab see meetod kasvajate ja immuunrakkude vastastikuseid metaboolseid interaktsioone ning annab ainulaadse ülevaate immuunregulatsiooni metaboliitidest, mis võivad olla kasulikud T-rakkudel põhineva munasarjavähi immunoteraapia ravis. Ravivõimalused.
Kasutasime kõrgmõõtmelist voolutsütomeetriat, et samaaegselt kvantifitseerida glükoosi omastamist [2-(N-(7-nitrofenüül-2-oksa-1,3-diasa-4-üül)amino)-2-deoksüglükoos (2-NBDG) ja mitokondriaalset aktiivsust [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20)], mis on kõrvuti asetsevad tüüpilised markerid, mis eristavad immuunrakke ja kasvajarakkude populatsioone (tabel S2 ja joonis S1A). See analüüs näitas, et võrreldes T-rakkudega on astsiidil ja kasvajarakkudel kõrgem glükoosi omastamise tase, kuid mitokondriaalse aktiivsuse erinevused on väiksemad. Kasvajarakkude keskmine glükoosi omastamine [CD45-EpCAM (EpCAM)+] on kolm kuni neli korda suurem kui T-rakkudel ja CD4+ T-rakkude keskmine glükoosi omastamine on 1,2 korda suurem kui CD8+ T-rakkudel, mis näitab, et kasvajasse infiltreeruvatel lümfotsüütidel (TIL) on erinevad metaboolsed vajadused isegi samas TME-s (joonis 1A). Seevastu on kasvajarakkude mitokondriaalne aktiivsus sarnane CD4+ T-rakkude omaga ning mõlema rakutüübi mitokondriaalne aktiivsus on kõrgem kui CD8+ T-rakkudel (joonis 1B). Üldiselt näitavad need tulemused metaboolset taset. Kasvajarakkude metaboolne aktiivsus on kõrgem kui CD4+ T-rakkudel ja CD4+ T-rakkude metaboolne aktiivsus on kõrgem kui CD8+ T-rakkudel. Vaatamata neile mõjudele rakutüüpide vahel ei ole CD4+ ja CD8+ T-rakkude metaboolses seisundis ega nende suhtelises osakaalus astsiidis võrreldes kasvajatega järjepidevat erinevust (joonis 1C). Seevastu CD45-rakkude fraktsioonis suurenes EpCAM+ rakkude osakaal kasvajas võrreldes astsiidiga (joonis 1D). Samuti täheldasime selget metaboolset erinevust EpCAM+ ja EpCAM- rakkude komponentide vahel. EpCAM+ (kasvaja)rakkudel on suurem glükoosi omastamine ja mitokondriaalne aktiivsus kui EpCAM- rakkudel, mis on palju kõrgem kui fibroblastide metaboolne aktiivsus kasvajarakkudes TME korral (joonis 1, E ja F).
(A ja B) Glükoosi omastamise mediaanne fluorestsentsi intensiivsus (MFI) (2-NBDG) (A) ja CD4+ T-rakkude mitokondriaalne aktiivsus (MitoTracker tumepunane) (B) Tüüpilised graafikud (vasakul) ja tabelina esitatud andmed (paremal), CD8+ T-rakud ja EpCAM+CD45-kasvajarakud astsiidist ja kasvajast. (C) CD4+ ja CD8+ rakkude (CD3+ T-rakkude) suhe astsiidis ja kasvajas. (D) EpCAM+ kasvajarakkude osakaal astsiidis ja kasvajas (CD45−). (E ja F) EpCAM+CD45-kasvaja ja EpCAM-CD45-maatriksi glükoosi omastamine (2-NBDG) (E) ja mitokondriaalne aktiivsus (MitoTracker tumepunane) (F) Tüüpilised graafikud (vasakul) ja tabelina esitatud andmed (paremal) Astsiit ja kasvajarakud. (G) CD25, CD137 ja PD1 ekspressiooni tüüpilised graafikud voolutsütomeetria abil. (H ja I) CD25, CD137 ja PD1 ekspressioon CD4+ T-rakkudel (H) ja CD8+ T-rakkudel (I). (J ja K) Naiivsed, tsentraalse mäluga (Tcm), efektormäluga (Teff) ja efektormäluga (Tem) fenotüübid, mis põhinevad CCR7 ja CD45RO ekspressioonil. CD4+ T-rakkude (J) ja CD8+ T-rakkude (K) representatiivsed pildid (vasakul) ja tabelandmed (paremal) astsiidis ja kasvajates. P-väärtused määrati paarilise t-testi abil (*P<0,05, **P<0,01 ja ***P<0,001). Joon tähistab sobitatud patsiente (n = 6). FMO, fluorestsents miinus üks; MFI, fluorestsentsi intensiivsuse mediaan.
Edasine analüüs näitas teisi olulisi erinevusi kõrgelt eraldatud T-rakkude fenotüübilise staatuse vahel. Aktiveeritud (joonis 1, G kuni I) ja efektormälu (joonis 1, J ja K) kasvajates esinevad palju sagedamini kui astsiit (CD3+ T-rakkude osakaal). Samamoodi näitas fenotüübi analüüs aktivatsioonimarkerite (CD25 ja CD137) ja ammendumismarkerite [programmeeritud rakusurma valk 1 (PD1)] ekspressiooni alusel, et kuigi nende populatsioonide metaboolsed omadused on erinevad (joonis S1, B kuni E), ei täheldatud naiivsete, efektor- või mälualamhulkade vahel järjepidevalt olulisi metaboolseid erinevusi (joonis S1, F kuni I). Neid tulemusi kinnitati masinõppe meetodite abil rakkude fenotüüpide automaatseks määramiseks (21), mis näitas lisaks suure hulga luuüdirakkude (CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+) olemasolu patsiendi astsiidis (joonis S2A). Kõigist tuvastatud rakutüüpidest näitas see müeloidrakkude populatsioon kõrgeimat glükoosi omastamist ja mitokondriaalset aktiivsust (joonis S2, B kuni G). Need tulemused toovad esile tugevad metaboolsed erinevused HGSC patsientidel astsiidis ja kasvajates leiduvate mitmete rakutüüpide vahel.
TIL-i metabonoomiliste omaduste mõistmise peamine väljakutse on vajadus isoleerida kasvajatest piisava puhtuse, kvaliteedi ja kvantiteediga T-rakkude proovid. Hiljutised uuringud on näidanud, et voolutsütomeetrial põhinevad sorteerimis- ja pärlitega rikastamise meetodid võivad viia muutusteni rakkude metaboliitprofiilides (22-24). Selle probleemi lahendamiseks optimeerisime pärlitega rikastamise meetodit, et isoleerida ja isoleerida TIL kirurgiliselt eemaldatud inimese munasarjavähist enne LC-MS/MS analüüsi (vt Materjalid ja meetodid; joonis 2A). Selle protokolli üldise mõju hindamiseks metaboliitide muutustele võrdlesime tervete doonorite poolt pärast ülaltoodud pärlitega eraldamise etappi aktiveeritud T-rakkude metaboliitprofiile rakkudega, mida pärlitega ei eraldatud, vaid mis jäid jääle. See kvaliteedikontrolli analüüs näitas, et nende kahe tingimuse vahel on kõrge korrelatsioon (r = 0,77) ja 86 metaboliidi rühma tehnilisel korratavusel on kõrge korduvus (joonis 2B). Seega suudavad need meetodid teostada täpset metaboliitide analüüsi rakkudes, mis läbivad rakutüübi rikastamist, pakkudes seega esimest kõrgresolutsiooniga platvormi spetsiifiliste metaboliitide tuvastamiseks HGSC-s, võimaldades inimestel seeläbi sügavamalt mõista rakkude spetsiifilisust (seksuaalse metabolismi programm).
(A) Magnetpärlitega rikastamise skemaatiline diagramm. Enne LC-MS/MS analüüsi läbivad rakud kolm järjestikust magnetpärlitega rikastamise vooru või jäävad jääle. (B) Rikastamise tüübi mõju metaboliitide arvukusele. Iga rikastamise tüübi kolme mõõtmise keskmine ± SE. Hall joon tähistab suhet 1:1. Korduvate mõõtmiste klassisisene korrelatsioon (ICC) on näidatud teljemärgistusel. NAD, nikotiinamiidadeniindinukleotiid. (C) Patsiendi metaboliitide analüüsi töövoo skemaatiline diagramm. Patsientidelt kogutakse astsiit või kasvajad ja krüokonserveeritakse. Igast proovist analüüsiti väikest osa voolutsütomeetria abil, ülejäänud proovid läbisid kolm rikastamisvooru CD4+, CD8+ ja CD45- rakkude osas. Neid rakufraktsioone analüüsiti LC-MS/MS abil. (D) Standardiseeritud metaboliitide arvukuse soojuskaart. Dendrogramm kujutab Wardi klastrite süsteemi proovidevaheliste eukleidiliste vahemaade kohta. (E) Proovi metaboliitide kaardi peakomponentide analüüs (PCA), mis näitab iga proovi kolme kordust, samalt patsiendilt võetud proovid on ühendatud joonega. (F) Patsiendil konditsioneeritud proovi metaboliidiprofiili PCA (st osalise redundantsuse abil); proovi tüüpi piirab kumer kest. PC1, põhikomponent 1; PC2, põhikomponent 2.
Järgmisena rakendasime seda rikastamismeetodit, et analüüsida 99 metaboliiti kuue HGSC patsiendi primaarse astsiidi ja kasvajate CD4+, CD8+ ja CD45-rakkude fraktsioonides (joonis 2C, joonis S3A ning tabel S3 ja S4). Huvipakkuv populatsioon moodustab 2–70% elusrakkude algsest suurest proovist ning rakkude osakaal varieerub patsientidel oluliselt. Pärast pärlite eraldamist moodustab huvipakkuv rikastatud fraktsioon (CD4+, CD8+ või CD45-) keskmiselt üle 85% kõigist proovi elusrakkudest. See rikastamismeetod võimaldab meil analüüsida inimese kasvajakoe metabolismi rakupopulatsioone, mida on suurte proovide puhul võimatu teha. Selle protokolli abil tegime kindlaks, et l-künureniini ja adenosiini, nende kahe hästi iseloomustatud immunosupressiivse metaboliidi, sisaldus oli kasvaja T-rakkudes või kasvajarakkudes kõrgenenud (joonis S3, B ja C). Seega näitavad need tulemused meie rakkude eraldamise ja massispektromeetria tehnoloogia täpsust ja võimet leida patsientide kudedest bioloogiliselt olulisi metaboliite.
Meie analüüs näitas ka rakutüüpide tugevat metaboolset eraldatust nii patsientide sees kui ka nende vahel (joonis 2D ja joonis S4A). Eelkõige võrreldes teiste patsientidega näitasid patsiendil 70 erinevaid metaboolseid omadusi (joonis 2E ja joonis S4B), mis viitab võimalikule olulisele metaboolsele heterogeensusele patsientide vahel. Tasub märkida, et võrreldes teiste patsientidega (1,2 kuni 2 liitrit; tabel S1) oli patsiendil 70 kogutud astsiidi koguhulk (80 ml) väiksem. Patsientidevahelise heterogeensuse kontrollimine põhikomponentide analüüsi ajal (näiteks osalise redundantsuse analüüsi abil) näitab rakutüüpide vahel järjepidevaid muutusi ning rakutüübid ja/või mikrokeskkond on metaboliidi profiili järgi selgelt agregeeritud (joonis 2F). Üksikute metaboliitide analüüs rõhutas neid mõjusid ja näitas olulisi erinevusi rakutüüpide ja mikrokeskkonna vahel. Tasub märkida, et kõige äärmuslikum täheldatud erinevus on MNA, mis on tavaliselt rikastatud CD45- rakkudega ning kasvajasse infiltreeruvate CD4+ ja CD8+ rakkudega (joonis 3A). CD4+ rakkude puhul on see efekt kõige ilmsem ja ka CD8+ rakkude MNA-d näib keskkond tugevalt mõjutavat. See pole aga oluline, sest ainult kolmel kuuest patsiendist saab hinnata kasvaja CD8+ skoori. Lisaks MNA-le on astsiidi ja kasvajate erinevat tüüpi rakkudes ka teisi metaboliite, mida TIL-is halvasti iseloomustatakse, erinevalt rikkad (joonis S3 ja S4). Seega näitavad need andmed paljulubavat immunomoduleerivate metaboliitide komplekti edasiseks uurimiseks.
(A) MNA normaliseeritud sisaldus astsiidi ja kasvaja CD4+, CD8+ ja CD45- rakkudes. Kastidiagramm näitab mediaani (joon), kvartiilidevahelist vahemikku (raami hinge) ja andmevahemikku kuni 1,5 korda kvartiilidevahelist vahemikku (raami vurru). Nagu on kirjeldatud patsiendi materjalides ja meetodites, kasutage P-väärtuse määramiseks patsiendi limma väärtust (*P<0,05 ja **P<0,01). (B) MNA metabolismi skemaatiline diagramm (60). Metaboliidid: S-adenosüül-1-metioniin; SAH, S-adenosiin-1-homotsüsteiin; NA, nikotiinamiid; MNA, 1-metüülnikotiinamiid; 2-PY, 1-metüül-2-püridoon-5-karboksamiid; 4-PY, 1-metüül-4-püridoon-5-karboksamiid; NR, nikotiinamiidriboos; NMN, nikotiinamiidmononukleotiid. Ensüümid (roheline): NNMT, nikotiinamiid-N-metüültransferaas; SIRT, sirtuiinid; NAMPT, nikotiinamiidfosforibosüültransferaas; AOX1, aldehüüdoksüdaas 1; NRK, nikotiinamiidribosiidkinaas; NMNAT, nikotiinamiidmononukleotiidadenylaattransferaas; Pnp1, puriini nukleosiidfosforülaas. (C) Astsiidi (hall) ja kasvaja (punane; n = 3 patsienti) scRNA-seq t-SNE. (D) NNMT ekspressioon erinevates rakupopulatsioonides, mis on identifitseeritud scRNA-seq abil. (E) NNMT ja AOX1 ekspressioon SK-OV-3-s, inimese embrüonaalse neeru (HEK) 293T-s, T-rakkudes ja MNA-ga töödeldud T-rakkudes. Volditud ekspressioon on näidatud SK-OV-3 suhtes. Näidatud on ekspressioonimuster SEM-iga (n = 6 tervet doonorit). Ct väärtusi üle 35 peetakse tuvastamatuks (UD). (F) SLC22A1 ja SLC22A2 ekspressioon SK-OV-3, HEK293T, T-rakkudes ja 8mM MNA-ga töödeldud T-rakkudes. Volditud ekspressioon on näidatud SK-OV-3 suhtes. Näidatud on ekspressioonimuster SEM-iga (n = 6 tervet doonorit). Ct väärtusi üle 35 peetakse tuvastamatuks (UD). (G) Rakkude MNA sisaldus aktiveeritud tervete doonori T-rakkudes pärast 72-tunnist inkubeerimist MNA-ga. Näidatud on ekspressioonimuster SEM-iga (n = 4 tervet doonorit).
MNA-d toodetakse metüülrühma ülekandmisel S-adenosüül-1-metioniinist (SAM) nikotiinamiidile (NA) nikotiinamiid-N-metüültransferaasi (NNMT; joonis 3B) abil. NNMT-d ekspresseeritakse üle mitmesugustes inimese vähivormides ning see on seotud proliferatsiooni, invasiooni ja metastaasidega (25–27). Et paremini mõista MNA allikat TME T-rakkudes, kasutasime scRNA-seq-i, et iseloomustada NNMT ekspressiooni eri rakutüüpides kolme HGSC patsiendi astsiidis ja kasvajates (tabel S5). Ligikaudu 6500 raku analüüs näitas, et astsiidis ja kasvajakeskkonnas piirdus NNMT ekspressioon eeldatava fibroblastide ja kasvajarakkude populatsiooniga (joonis 3, C ja D). Väärib märkimist, et üheski PTPRC-d (CD45+) ekspresseerivas populatsioonis ei ole ilmset NNMT ekspressiooni (joonis 3D ja joonis S5A), mis näitab, et metaboliidi spektris tuvastatud MNA on viidud T-rakkudesse. Aldehüüdoksüdaas 1 (AOX1) ekspressioon muundab MNA 1-metüül-2-püridoon-5-karboksamiidiks (2-PYR) või 1-metüül-4-püridoon-5-karboksamiidiks (4-PYR); joonis 3B) piirdub samuti COL1A1 ekspresseerivate fibroblastide populatsiooniga (joonis S5A), mis kokkuvõttes näitavad, et T-rakkudel puudub tavapärase MNA metabolismi võime. Nende MNA-ga seotud geenide ekspressioonimustrit kontrolliti HGSC patsientide astsiidist saadud teise sõltumatu rakuandmekogumi abil (joonis S5B; n = 6) (16). Lisaks näitas MNA-ga töödeldud tervete doonor-T-rakkude kvantitatiivne polümeraasi ahelreaktsiooni (qPCR) analüüs, et võrreldes kontroll-SK-OV-3 munasarjavähi rakkudega ei ekspresseeritud NNMT-d ega AOX1-d peaaegu üldse (joonis 3E). Need ootamatud tulemused näitavad, et MNA-d võib TME korral erituda fibroblastidest või kasvajatest külgnevatesse T-rakkudesse.
Kuigi kandidaatide hulka kuulub orgaaniliste katioontransporterite 1 kuni 3 perekond (OCT1, OCT2 ja OCT3), mida kodeerib lahustuva kandja 22 (SLC22) perekond (SLC22A1, SLC22A2 ja SLC22A3), on MNA potentsiaalsed transporterid endiselt määratlemata (28). Tervetelt doonor-T-rakkudelt pärineva mRNA QPCR näitas SLC22A1 madalat ekspressioonitaset, kuid SLC22A2 tuvastamatut taset, mis kinnitas, et sellest on varem kirjanduses teatatud (joonis 3F) (29). Seevastu munasarjavähi rakuliin SK-OV-3 ekspresseeris mõlemat transporterit kõrgel tasemel (joonis 3F).
Et testida T-rakkude võimet absorbeerida võõrast MNA-d, kultiveeriti terveid doonor-T-rakke 72 tundi MNA erinevate kontsentratsioonide juuresolekul. Eksogeense MNA puudumisel ei ole MNA rakuline sisaldus tuvastatav (joonis 3G). Eksogeense MNA-ga töödeldud aktiveeritud T-rakkudel täheldati aga MNA sisalduse annusest sõltuvat suurenemist rakkudes kuni 6 mM MNA-ni (joonis 3G). See tulemus näitab, et hoolimata transporteri madalast ekspressioonitasemest ja peamise rakusisese MNA metabolismi eest vastutava ensüümi puudumisest, suudab TIL siiski MNA-d omastada.
Patsientide T-rakkudes leiduvate metaboliitide spekter ja in vitro MNA absorptsioonikatsed suurendavad võimalust, et vähiga seotud fibroblastid (CAF) sekreteerivad MNA-d ja kasvajarakud võivad reguleerida TIL-i fenotüüpi ja funktsiooni. MNA mõju määramiseks T-rakkudele aktiveeriti tervete doonori T-rakud in vitro MNA juuresolekul või puudumisel ning hinnati nende proliferatsiooni ja tsütokiinide tootmist. Pärast 7-päevast MNA lisamist suurimas annuses vähenes populatsiooni kahekordistumise arv mõõdukalt, samas kui elujõud säilis kõigi annuste korral (joonis 4A). Lisaks suurendas eksogeense MNA-ga töötlemine tuumorinekroosifaktorit α (TNFα; joonis 4B) ekspresseerivate CD4+ ja CD8+ T-rakkude osakaalu. Seevastu IFN-γ rakusisene tootmine vähenes oluliselt CD4+ T-rakkudes, kuid mitte CD8+ T-rakkudes, ja interleukiin 2 (IL-2; joonis 4, C ja D) osas olulisi muutusi ei täheldatud. Seega näitas nende MNA-ga töödeldud T-rakkude kultuuride supernatantide ensüümseotud immunosorbentanalüüs (ELISA) olulist TNFα suurenemist, IFN-γ vähenemist ja IL-2 muutumatust (joonis 4, E kuni G). IFN-γ vähenemine näitab, et MNA-l võib olla roll T-rakkude kasvajavastase aktiivsuse pärssimisel. MNA mõju simuleerimiseks T-rakkude vahendatud tsütotoksilisusele toodetakse tervete doonorite perifeerse vere mononukleaarsete rakkude (PBMC) poolt kimäärsete antigeeni retseptori T-rakkude (FRα-CAR-T) ja rohelise fluorestseeruva valgu (GFP) poolt reguleeritud CAR-T (GFP) rakke. CAR-T-rakke kultiveeriti 24 tundi MNA juuresolekul ja seejärel kultiveeriti koos inimese SK-OV-3 munasarjavähi rakkudega, mis ekspresseerivad folaadiretseptorit α efektori ja sihtmärgi suhtega 10:1. MNA-ravi vähendas oluliselt FRα-CAR-T-rakkude tapmisaktiivsust, mis oli sarnane adenosiiniga töödeldud FRα-CAR-T-rakkude omaga (joonis 4H).
(A) Elujõuliste rakkude koguarv ja populatsiooni kahekordistumine (PD) otse kultuurist 7. päeval. Tulbadiagramm kujutab kuue terve doonori keskmist + SEM. Esitab andmeid vähemalt n = 3 sõltumatust katsel. (B kuni D) CD3/CD28 ja IL-2 kasutati T-rakkude aktiveerimiseks vastavates MNA kontsentratsioonides 7 päeva jooksul. Enne analüüsi stimuleeriti rakke PMA/ionomütsiiniga ja GolgiStopiga 4 tundi. TNFα (B) ekspressioon TNF-rakkudes. Näidispilt (vasakul) ja tabelina esitatud andmed (paremal) TNFα ekspressioonist elavates rakkudes. IFN-γ (C) ja IL-2 (D) ekspressioon T-rakkudes. Tsütokiinide ekspressiooni mõõdeti voolutsütomeetria abil. Tulbadiagramm kujutab keskmist (n = 6 tervet doonorit) + SEM. P-väärtuse määramiseks kasutage ühesuunalist dispersioonanalüüsi ja korduvaid mõõtmisi (*P<0,05 ja **P<0,01). Esitab andmeid vähemalt n = 3 sõltumatust katsel. (E kuni G) CD3/CD28 ja IL-2 kasutati T-rakkude aktiveerimiseks vastavates MNA kontsentratsioonides 7 päeva jooksul. Keskkond koguti enne ja pärast 4-tunnist PMA/ionomütsiini stimulatsiooni. TNFα (E), IFN-γ (F) ja IL-2 (G) kontsentratsioonid mõõdeti ELISA abil. Tulpdiagramm kujutab keskmist (n = 5 tervet doonorit) + standardvea. P-väärtus määrati ühesuunalise dispersioonanalüüsi ja korduvate mõõtmiste abil (*P<0,05). Katkendlik joon näitab detekteerimispiiri. (H) Rakkude lüüsi test. FRα-CAR-T või GFP-CAR-T rakke kohandati adenosiini (250 μM) või MNA-ga (10 mM) 24 tunniks või jäeti töötlemata (Ctrl). Mõõdeti SK-OV-3 rakkude hävimise protsent. P-väärtus määrati Welchi t-testiga (*P<0,5 ja **P<0,01).
MNA-sõltuva TNFα ekspressiooni regulatsiooni mehhanistliku mõistmise saamiseks hinnati MNA-ga töödeldud T-rakkude TNFα mRNA muutusi (joonis 5A). MNA-ga töödeldud tervetel doonor-T-rakkudel täheldati TNFα transkriptsioonitaseme kahekordset suurenemist, mis näitab, et MNA sõltub TNFα transkriptsiooni regulatsioonist. Selle võimaliku regulatiivse mehhanismi uurimiseks hinnati kahte teadaolevat TNFα-d reguleerivat transkriptsioonifaktorit, nimelt aktiveeritud T-rakkude tuumafaktorit (NFAT) ja spetsiifilist valku 1 (Sp1), vastusena MNA seondumisele proksimaalse TNFα promootoriga (30). TNFα promootor sisaldab 6 tuvastatud NFAT-i sidumissaiti ja 2 Sp1 sidumissaiti, mis kattuvad ühes kohas [-55 aluspaari (bp) 5'-korgist] (30). Kromatiini immunosadestamine (ChIP) näitas, et MNA-ga töödeldes suurenes Sp1 seondumine TNFα promootoriga kolmekordselt. Ka NFAT-i inkorporeerimine suurenes ja lähenes olulisusele (joonis 5B). Need andmed näitavad, et MNA reguleerib TNFα ekspressiooni Sp1 transkriptsiooni kaudu ja vähemal määral NFAT ekspressiooni.
(A) Võrreldes MNA-ta kultiveeritud T-rakkudega, on TNFα ekspressiooni muutus MNA-ga töödeldud T-rakkudes kordne. Näidatud on ekspressioonimuster SEM-iga (n = 5 tervet doonorit). Esitab andmeid vähemalt n = 3 sõltumatust katsel. (B) 8 mM MNA-ga töödeldud või ilma NFAT-i ja Sp1-ga töödeldud T-rakkude TNFα promootor kombineeriti (Ctrl) ja PMA/ionomütsiini stimulatsiooniga 4 tunni jooksul. Immunoglobuliin G (IgG) ja H3 kasutati vastavalt negatiivse ja positiivse kontrollina immunosadestamisel. ChIP kvantifitseerimine näitas, et Sp1 ja NFAT seondumine TNFα promootoriga MNA-ga töödeldud rakkudes suurenes mitu korda võrreldes kontrollrühmaga. Esitab andmeid vähemalt n = 3 sõltumatust katsel. P-väärtus määrati mitme t-testiga (*** P <0,01). (C) Võrreldes HGSC astsiidiga näitasid T-rakud (mitte-tsütotoksilised) TNF ekspressiooni suurenemist kasvajas. Värvid esindavad erinevaid patsiente. Kuvatud rakkudest on juhuslikult valitud 300 ja neid on ülejoonistamise piiramiseks väreletud (** Padj = 0,0076). (D) Munasarjavähi MNA kavandatud mudel. MNA-d toodetakse kasvajarakkudes ja TME fibroblastides ning seda omastavad T-rakud. MNA suurendab Sp1 seondumist TNFα promootoriga, mis viib TNFα transkriptsiooni ja TNFα tsütokiini tootmise suurenemiseni. MNA põhjustab ka IFN-γ vähenemist. T-rakkude funktsiooni pärssimine viib tapmisvõime vähenemiseni ja kasvaja kasvu kiirenemiseni.
Aruannete kohaselt on TNFα-l nii esi- kui ka tagapool sõltuv kasvajavastane ja kasvajavastane toime, kuid sellel on tuntud roll munasarjavähi kasvu ja metastaaside soodustamisel (31–33). Aruannete kohaselt on TNFα kontsentratsioon munasarjavähiga patsientidel astsiidis ja kasvajakoes kõrgem kui healoomulistes kudedes (34–36). Mehhanismi poolest saab TNFα reguleerida valgete vereliblede aktivatsiooni, funktsiooni ja proliferatsiooni ning muuta vähirakkude fenotüüpi (37, 38). Kooskõlas nende leidudega näitas diferentsiaalse geeniekspressiooni analüüs, et TNF oli kasvajakudedes T-rakkudes oluliselt ülesreguleeritud võrreldes astsiidiga (joonis 5C). TNF ekspressiooni suurenemine oli ilmne ainult mittetsütotoksilise fenotüübiga T-rakkude populatsioonides (joonis S5A). Kokkuvõttes toetavad need andmed seisukohta, et MNA-l on HGSC-s kahekordne immunosupressiivne ja kasvajat soodustav toime.
Voolutsütomeetrial põhinev fluorestsentsmärgistamine on muutunud peamiseks meetodiks TIL-i metabolismi uurimiseks. Need uuringud on näidanud, et võrreldes perifeerse vere lümfotsüütide või sekundaarsete lümfoidorganite T-rakkudega on hiire ja inimese TIL-il suurem kalduvus glükoosi omastamiseks (4, 39) ja mitokondriaalse funktsiooni järkjärguline kadu (19, 40). Kuigi selles uuringus oleme täheldanud sarnaseid tulemusi, on peamiseks arenguks kasvajarakkude ja samast resekteeritud kasvajakoest pärinevate TIL-i metabolismi võrdlemine. Kooskõlas mõnede nende varasemate aruannetega on astsiidist ja kasvajatest pärinevatel kasvajarakkudel (CD45-EpCAM+) suurem glükoosi omastamine kui CD8+ ja CD4+ T-rakkudel, mis toetab väidet, et kasvajarakkude kõrget glükoosi omastamist saab võrrelda T-rakkude omaga. T-rakkude konkurentsi kontseptsioon. TME. Kasvajarakkude mitokondriaalne aktiivsus on aga suurem kui CD8+ T-rakkudel, kuid mitokondriaalne aktiivsus on sarnane CD4+ T-rakkude omaga. Need tulemused kinnitavad esilekerkivat teemat, et oksüdatiivne metabolism on kasvajarakkude jaoks oluline (41, 42). Samuti viitavad nad sellele, et CD8+ T-rakud võivad olla oksüdatiivse düsfunktsiooni suhtes vastuvõtlikumad kui CD4+ T-rakud või et CD4+ T-rakud võivad mitokondriaalse aktiivsuse säilitamiseks kasutada glükoosist erinevaid süsinikuallikaid (43, 44). Tuleb märkida, et me ei täheldanud astsiidis glükoosi omastamises ega mitokondriaalses aktiivsuses erinevust CD4+ T-efektorrakkude, T-efektormälurakkude ja T-keskmälurakkude vahel. Samamoodi ei ole CD8+ T-rakkude diferentseerumisastmel kasvajates mingit pistmist glükoosi omastamise muutustega, mis rõhutab olulist erinevust in vitro kultiveeritud T-rakkude ja in vivo inimese TIL-rakkude vahel (22). Neid tähelepanekuid kinnitas ka erapooletu automaatse rakupopulatsiooni jaotamise kasutamine, mis näitas lisaks, et CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+ rakud, millel on suurem glükoosi omastamine ja mitokondriaalne aktiivsus kui kasvajarakkudel, on levinud, kuid neil on metaboolselt aktiivne rakkude populatsioon. See populatsioon võib esindada scRNA-seq analüüsis tuvastatud müeloidsete supressorrakkude või plasmatsütoidsete dendriitrakkude oletatavat alampopulatsiooni. Kuigi mõlemat neist on kirjeldatud inimese munasarjakasvajate puhul [45], vajavad nad selle müeloidse alampopulatsiooni kirjeldamiseks siiski täiendavat tööd.
Kuigi voolutsütomeetrial põhinevad meetodid suudavad selgitada glükoosi ja oksüdatiivse metabolismi üldisi erinevusi rakutüüpide vahel, ei ole TME-s mitokondriaalse metabolismi jaoks glükoosi või muude süsinikuallikate poolt toodetavaid täpseid metaboliite veel kindlaks määratud. Metaboliitide olemasolu või puudumise määramine antud TIL-i alamhulgale nõuab rakupopulatsiooni puhastamist eemaldatud koest. Seetõttu saab meie rakkude rikastamise meetod koos massispektromeetriaga anda ülevaate metaboliitidest, mis on T-rakkudes ja kasvajarakkude populatsioonides erinevalt rikastatud sobivates patsientide proovides. Kuigi sellel meetodil on eeliseid fluorestsents-aktiveeritud rakkude sorteerimise ees, võivad teatud metaboliitide teegid olla mõjutatud loomupärase stabiilsuse ja/või kiire käibekiiruse tõttu (22). Sellest hoolimata suutis meie meetod tuvastada kaks tunnustatud immunosupressiivset metaboliiti, adenosiini ja künureniini, kuna need varieeruvad proovitüüpide vahel oluliselt.
Meie kasvajate ja TIL-i alatüüpide metabonoomiline analüüs annab rohkem teavet metaboliitide rolli kohta munasarjade TME-s. Esiteks, voolutsütomeetria abil tuvastasime, et kasvajate ja CD4+ T-rakkude mitokondriaalses aktiivsuses ei olnud erinevust. LC-MS/MS analüüs näitas aga metaboliitide arvukuses olulisi muutusi nende populatsioonide vahel, mis näitab, et TIL-i metabolismi ja selle üldise metaboolse aktiivsuse kohta tehtud järeldused vajavad hoolikat tõlgendamist. Teiseks on MNA metaboliit, millel on suurim erinevus CD45-rakkude ja T-rakkude vahel astsiidis, mitte kasvajates. Seetõttu võivad kompartmentaliseerumine ja kasvaja asukoht avaldada TIL-i metabolismile erinevat mõju, mis rõhutab võimalikku heterogeensust antud mikrokeskkonnas. Kolmandaks piirdub MNA-d tootva ensüümi NNMT ekspressioon peamiselt CAF-iga, mis on vähemal määral kasvajarakud, kuid tuvastatavaid MNA tasemeid on täheldatud kasvajast pärinevates T-rakkudes. NNMT üleekspressioonil munasarjade CAF-is on teadaolev vähki soodustav toime, osaliselt tänu CAF-i metabolismi, kasvaja invasiooni ja metastaaside soodustamisele (27). Kuigi TIL-i üldine tase on mõõdukas, on NNMT ekspressioon CAF-is tihedalt seotud Cancer Genome Atlas (TCGA) mesenhümaalse alatüübiga, mis on seotud halva prognoosiga (27, 46, 47). Lõpuks piirdub ka MNA lagundamise eest vastutava ensüümi AOX1 ekspressioon CAF-i populatsiooniga, mis näitab, et T-rakkudel puudub võime MNA-d metaboliseerida. Need tulemused toetavad ideed, et kuigi selle leiu kinnitamiseks on vaja täiendavat tööd, võib MNA kõrge tase T-rakkudes viidata immunosupressiivse CAF-i mikrokeskkonna olemasolule.
Arvestades MNA transporterite madalat ekspressioonitaset ja MNA metabolismis osalevate võtmevalkude tuvastamatuid tasemeid, on MNA esinemine T-rakkudes ootamatu. Kahe sõltumatu kohordi scRNA-seq analüüsi ja suunatud qPCR abil ei suudetud tuvastada ei NNMT-d ega AOX1-d. Need tulemused näitavad, et MNA-d ei sünteesita T-rakkudes, vaid see imendub ümbritsevast TME-st. In vitro katsed näitavad, et T-rakud kipuvad akumuleerima eksogeenset MNA-d.
Meie in vitro uuringud on näidanud, et eksogeenne MNA indutseerib TNFα ekspressiooni TNFα rakkudes ja suurendab Sp1 seondumist TNFα promootoriga. Kuigi TNFα-l on nii kasvajavastane kui ka kasvajavastane toime, võib TNFα munasarjavähi korral soodustada munasarjavähi kasvu (31-33). TNFα neutraliseerimine munasarjavähi rakukultuuris või TNFα signaali elimineerimine hiiremudelites võib parandada TNFα-vahendatud põletikuliste tsütokiinide tootmist ja pärssida kasvaja kasvu (32, 35). Seega võib TME-st saadud MNA sel juhul toimida põletikulise metaboliidina TNFα-sõltuva mehhanismi kaudu autokriinse ahela kaudu, soodustades seeläbi munasarjavähi teket ja levikut (31). Selle võimaluse põhjal uuritakse TNFα blokaadi kui potentsiaalset munasarjavähi ravimit (37, 48, 49). Lisaks kahjustab MNA CAR-T-rakkude tsütotoksilisust munasarjavähi rakkudele, pakkudes täiendavaid tõendeid MNA-vahendatud immuunsupressiooni kohta. Kokkuvõttes viitavad need tulemused mudelile, kus kasvajad ja CAF-rakud sekreteerivad MNA-d rakuvälise TME-sse. (I) TNF-indutseeritud munasarjavähi kasvu stimuleerimise ja (ii) MNA-indutseeritud T-rakkude tsütotoksilise aktiivsuse pärssimise kaudu võib sellel olla kahekordne kasvajaefekt (joonis 5D).
Kokkuvõtteks võib öelda, et kiire rakkude rikastamise, üksikrakkude sekveneerimise ja metaboolse profileerimise kombinatsiooni rakendamisega paljastas see uuring HGSC patsientidel kasvajate ja astsiidirakkude vahel suuri immunometaboloomilisi erinevusi. See põhjalik analüüs näitas, et T-rakkude glükoosi omastamises ja mitokondriaalses aktiivsuses on erinevusi ning tuvastas MNA kui mitterakulise autonoomse immuunregulatoorse metaboliidi. Need andmed mõjutavad seda, kuidas TME mõjutab T-rakkude metabolismi inimese vähkkasvajates. Kuigi on teatatud otsesest konkurentsist toitainete pärast T-rakkude ja vähirakkude vahel, võivad metaboliidid toimida ka kaudsete regulaatoritena, mis soodustavad kasvaja progresseerumist ja võivad pärssida endogeenseid immuunvastuseid. Nende regulatiivsete metaboliitide funktsionaalse rolli edasine kirjeldus võib avada alternatiivseid strateegiaid kasvajavastase immuunvastuse tugevdamiseks.
Patsientide proovid ja kliinilised andmed saadi Kanada koehoidlate võrgustiku sertifitseeritud BC vähi kasvajakoe hoidla kaudu. Vastavalt BC vähiuuringute eetikakomitee ja Briti Columbia ülikooli poolt heakskiidetud protokollile (H07-00463) saadi kõigilt patsientide proovidelt ja kliinilistelt andmetelt teadlik kirjalik nõusolek või loobuti ametlikult oma nõusolekust. Proove säilitatakse sertifitseeritud biopangas (BRC-00290). Patsientide üksikasjalikud omadused on esitatud tabelites S1 ja S5. Krüokonserveerimiseks kasutatakse skalpelli patsiendi kasvajaproovi mehaaniliseks lagundamiseks ja seejärel läbi 100-mikronilise filtri surumiseks, et saada ühe raku suspensioon. Patsiendi astsiiti tsentrifuugiti kiirusel 1500 p/min 10 minutit temperatuuril 4 °C, et rakud sadestada ja supernatant eemaldada. Kasvajast ja astsiidist saadud rakud krüokonserveeriti 50% kuumusega inaktiveeritud inimese AB seerumis (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640-s (Thermo Fisher Scientific) ja 10% dimetüülsulfoksiidis. Need konserveeritud üksikrakkude suspensioonid sulatati ja kasutati allpool kirjeldatud metaboloomika ja metaboliitide määramiseks.
Täielik sööde koosneb 0,22 μm filtreeritud 50:50 rikastatud RPMI 1640:AimV-st. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamiinist (Thermo Fisher Scientific), millele on lisatud 10% kuumusega inaktiveeritud inimese AB seerumit (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes'it (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamiini (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x penitsilliini streptomütsiini (PenStrep) lahust (Thermo Fisher Scientific) ja 50 μMB-merkaptoetanooli. AimV-le (Invitrogen) on lisatud 20 mM Hepes'it (Thermo Fisher Scientific) ja 2 mM l-glutamiini (Thermo Fisher Scientific). Voolutsütomeetri värvimispuhver koosnes 0,22 μm filtreeritud fosfaatpuhverdatud soolalahusest (PBS; Invitrogen), millele on lisatud 3% kuumusega inaktiveeritud AB inimese seerumit (Sigma). Rakkude rikastamise puhver koosneb 0,22 μm filtreeritud PBS-ist ja sellele on lisatud 0,5% kuumusega inaktiveeritud inimese AB-seerumit (Sigma-Aldrich).
37 °C täissöötmes värviti rakke 10 nM MT DR ja 100 μM 2-NBDG-ga 30 minutit. Seejärel värviti rakke elujõulisust näitava värvainega eF506 temperatuuril 4 °C 15 minutit. Rakud resuspendeeriti FC Blockis (eBioscience) ja Brilliant Stain Bufferis (BD Biosciences), lahjendati voolutsütomeetri värvimispuhvris (vastavalt tootja juhistele) ja inkubeeriti 10 minutit toatemperatuuril. Värviti rakke antikehade komplektiga (tabel S2) voolutsütomeetria värvimispuhvris temperatuuril 4 °C 20 minutit. Enne analüüsi resuspendeeriti rakud voolutsütomeetria värvimispuhvris (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R konfiguratsioon). Rakkude loenduse andmete analüüsimiseks kasutati SpectroFlo ja FlowJo V10 ning andmete loomiseks GraphPad Prism 8. 2-NBDG ja MT DR mediaanne fluorestsentsi intensiivsus (MFI) logaritmiliselt normaliseeriti ja seejärel kasutati statistiliseks analüüsiks paaris-t-testi, et arvestada sobivate patsientidega. Eemaldage analüüsist kõik populatsioonid, millel on vähem kui 40 sündmust; sisestage enne statistilise analüüsi ja andmete visualiseerimise tegemist negatiivsete väärtuste korral MFI väärtuseks 1.
Ülaltoodud protsessipaneeli käsitsi väravdamise strateegia täiendamiseks kasutasime kuju piiramise puu (FAUST) (21) täielikku annotatsiooni, et määrata rakud automaatselt populatsioonile pärast surnud rakkude eemaldamist FlowJos. Haldame väljundit käsitsi, et ühendada populatsioonid, mis tunduvad valesti jaotatud (kombineerides PD1+ ja PD1-kasvajarakke), ja säilinud populatsioonid. Iga proov sisaldab keskmiselt üle 2% rakke, kokku 11 populatsiooni.
PBMC-de eraldamiseks leukotsüütide eraldusproduktidest kasutati Ficolli gradienditiheduse tsentrifuugimist (STEMCELL Technologies). CD8+ T-rakud eraldati PBMC-dest, kasutades CD8 mikropärleid (Miltenyi) ja laiendati täiskeskkonnas TransActiga (Miltenyi) 2 nädalat vastavalt tootja juhistele. Rakkudel lasti seista 5 päeva täiskeskkonnas, mis sisaldas IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), ja seejärel stimuleeriti neid uuesti TransActiga. 7. päeval, vastavalt tootja juhistele, rikastati rakke kolmes järjestikuses voorus inimese CD45 mikropärlitega (Miltenyi). Rakud jaotati alikvootideks voolutsütomeetria analüüsiks (nagu eespool kirjeldatud) ja üks miljon rakku jaotati kolm korda alikvootideks LC-MS/MS analüüsiks. Proove töödeldi LC-MS/MS abil allpool kirjeldatud viisil. Puuduva metaboliidi väärtust hinnati ioonide arvuga 1000. Iga proov normaliseeritakse koguioonide arvuga (TIC), teisendatakse logaritmiliselt ja normaliseeritakse automaatselt MetaboAnalystR-is enne analüüsi.
Iga patsiendi üksikrakkude suspensioon sulatati ja filtreeriti läbi 40 μm filtri täiskeskkonda (nagu eespool kirjeldatud). Tootja protokolli kohaselt rikastati proove CD8+, CD4+ ja CD45- rakkudega (jääl) kolme järjestikuse positiivse selektsiooni vooru magnethelmeste abil, kasutades MicroBeads'i (Miltenyi). Lühidalt, rakud resuspendeeritakse rakkude rikastuspuhvris (nagu eespool kirjeldatud) ja loendatakse. Rakke inkubeeriti inimese CD8 helmeste, inimese CD4 helmeste või inimese CD45 helmestega (Miltenyi) temperatuuril 4 °C 15 minutit ja seejärel pesti rakkude rikastuspuhvriga. Proov juhitakse läbi LS-kolonni (Miltenyi) ning positiivsed ja negatiivsed fraktsioonid kogutakse. Kestuse lühendamiseks ja rakkude taaskasutamisetapi maksimeerimiseks kasutatakse CD8-fraktsiooni seejärel CD4+ rikastamise teises voorus ja CD4-fraktsiooni järgnevas CD45 rikastamises. Hoidke lahust kogu eraldusprotsessi vältel jääl.
Metaboliitide analüüsiks proovide ettevalmistamiseks pesti rakke üks kord jääkülma soolalahusega ja igale proovile lisati 1 ml 80% metanooli, seejärel segati vorteksil ja külmutati kiirkülmutamisega vedelas lämmastikus. Proove töödeldi kolmel külmutamis-sulatamistsüklil ja tsentrifuugiti kiirusel 14 000 p/min 15 minutit temperatuuril 4 °C. Metaboliite sisaldav supernatant aurustati kuivaks. Metaboliidid lahustati uuesti 50 μl 0,03% sipelghappes, segati vorteksil ja seejärel tsentrifuugiti prahi eemaldamiseks.
Ekstraheerige metaboliidid nagu eespool kirjeldatud. Kandke supernatant metaboloomika uurimiseks kõrgefektiivse vedelikkromatograafia pudelisse. Kasutage juhuslikku töötlusprotokolli, et töödelda iga proovi sarnase arvu rakkudega, et vältida partiiefekte. Viisime läbi globaalsete metaboliitide kvalitatiivse hindamise, mis on varem avaldatud AB SCIEX QTRAP 5500 kolmekordse kvadrupoolmassispektromeetril (50). Kromatograafiline analüüs ja piigi pindala integreerimine viidi läbi MultiQuant versiooni 2.1 tarkvara abil (Applied Biosystems SCIEX).
Puuduva metaboliidi väärtuse hindamiseks kasutati ioonide arvu 1000 ja iga proovi TIC-d kasutati iga tuvastatud metaboliidi normaliseeritud piigi pindala arvutamiseks, et korrigeerida proovi töötlemisel instrumentaalse analüüsi käigus tekkinud muutusi. Pärast TIC-i normaliseerimist kasutatakse logaritmiliseks teisendamiseks ja automaatseks normjoone skaleerimiseks MetaboAnalystR(51) (vaikimisi parameeter). Proovitüüpide metaboliitide erinevuste uurimiseks kasutasime PCA-d koos vegan R paketiga ja patsientide analüüsimiseks kasutasime osalist redundantsuse analüüsi. Proovide vahelise eukleidilise kauguse klasterdamiseks kasutasime Wardi meetodit soojuskaardi dendrogrammi koostamiseks. Erinevalt külluslike metaboliitide tuvastamiseks kogu rakutüübi ja mikrokeskkonna lõikes kasutasime standardiseeritud metaboliitide arvukuse põhjal limma (52). Selgituse lihtsustamiseks kasutasime mudeli täpsustamiseks rühma keskmise parameetrit ja arvestasime mikrokeskkonna rakutüüpe iga rühmana (n = 6 rühma); olulisuse testi jaoks tegime iga metaboliidi kohta kolm korduvat mõõtmist. Vale replikatsiooni vältimiseks kaasati patsient limma kujunduses takistusena. Metaboliitide erinevuste kontrollimiseks erinevate patsientide vahel kohandasime limma mudelit, lisades patsiendid fikseeritud viisil. Esitame eelnevalt määratletud kontrasti olulisuse rakutüübi ja Padj <0,05 mikrokeskkonna vahel (Benjamini-Hochbergi korrektsioon).
Pärast elujõulisuse suurendamist Miltenyi surnud rakkude eemaldamise komplektiga (elujõudlus >80%) viidi läbi üksikrakuliste transkriptoomide sekveneerimine kõigi elusate külmutatud astsiidi ja kasvajaproovide põhjal, kasutades 10x 5'geeni ekspressiooniprotokolli. Analüüsiti viit juhtumit, kus kasvajad ja astsiit olid sarnased, kuigi ühe kasvajaproovi madal elujõulisus takistas selle kaasamist. Patsientide mitmekordse valiku saavutamiseks ühendasime iga patsiendi proovid 10x kroomi kontrolleri ridades ja analüüsisime astsiiti ja kasvajakohti eraldi. Pärast sekveneerimist [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paarisots (PE), Quebeci genoom; keskmiselt 73 488 ja 41 378 lugemist raku kohta vastavalt kasvaja ja astsiidi puhul]], kasutasime CellSNP ja Vireo (53) (põhinedes CellSNP-l, kuna GRCh38 poolt pakutav tavaline inimese SNP (VCF) on määratud doonori identiteetiga. Me kasutame SNPRelate'i, et järeldada patsiendi genotüübi staatuse (IBS) lähimat identiteeti (IBS), jättes välja määramata rakud ja dupleksidena identifitseeritud rakud ning sobitades doonoreid astsiidi ja kasvaja proovide vahel (54). Selle ülesande põhjal säilitasime allavoolu analüüsiks kolm juhtu, kus kasvajas ja astsiidis oli rikkalikult rakke. Pärast massfiltreerimisetapi läbiviimist scateri (55) ja scran (56) BioConductor pakendis saadi analüüsiks 6975 rakku (vastavalt 2792 ja 4183 rakku kasvajast ja astsiidist). Me kasutame igraph'i (57) Louvaini klasterdamist jagatud lähima naabri võrgustiku (SNN) kohta, mis põhineb Jaccardi kaugusel klastri rakkudest ekspressiooni järgi. Klastrid annoteeriti käsitsi oletatavate rakutüüpidega markergeeni ekspressiooni põhjal ja visualiseeriti t-SNE abil. Tsütotoksilisi T-rakke defineeritakse CD8A ja GZMA ekspressiooni järgi, välja arvatud alamklastrid, millel on madal ribosomaalsete valkude ekspressioon. Kasutasime Izari jt (16) avaldatud andmeid, sealhulgas nende t-SNE manustamist, mis suudab kontrollida immuunrakkude markerite ja NNMT ekspressiooni kattumist.
PBMC-d eraldati leukotsüütide eraldusproduktidest (STEMCELL Technologies) Ficolli gradienditiheduse tsentrifuugimise abil. CD3+ rakud eraldati PBMC-dest CD3 bead'ide (Miltenyi) abil. MNA juuresolekul või puudumisel aktiveeriti CD3+ rakud plaadile seotud CD3 (5 μg/ml), lahustuva CD28 (3 μg/ml) ja IL-2-ga (300 U/ml; Proleukin). Viimasel laiendamise päeval hinnati elujõulisust (fikseeritav elujõulisuse värvaine eFluor450, eBioscience) ja proliferatsiooni (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) voolutsütomeetria abil. Hinnake efektorfunktsiooni, stimuleerides rakke PMA-ga (20 ng/ml) ja ionomütsiiniga (1 μg/ml) GolgiStopi abil 4 tunni jooksul ning jälgige CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4, BioLegend) ja TNFα-fluorestseiinisotiotsüanaadi (FITC) (MAb11, BD) taset. Stimuleerige qPCR ja ChIP rakke PMA-ga (20 ng/ml) ja ionomütsiiniga (1 μg/ml) 4 tunni jooksul. ELISA supernatant koguti enne ja pärast stimuleerimist PMA-ga (20 ng/ml) ja ionomütsiiniga (1 μg/ml) 4 tunni jooksul.
RNA isoleerimiseks RNeasy Plus Mini Kiti (QIAGEN) abil järgige tootja protokolli. Proovi homogeniseerimiseks kasutage QIAshredderit (QIAGEN). Komplementaarse DNA (cDNA) sünteesimiseks kasutage suure mahutavusega RNA-cDNA komplekti (Thermo Fisher Scientific). Geeniekspressiooni kvantifitseerimiseks kasutage TaqMan Rapid Advanced Master Mixi (Thermo Fisher Scientific) (vastavalt tootja protokollile) järgmiste sondidega: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glütseraldehüüd-3-fosfaat vesinikust (GAPDH)] ja Hs01010726_m1 (SLC22A2). Proovid analüüsiti StepOnePlus reaalajas PCR-süsteemis (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) MicroAmp kiire optilise 96-süvendilise reaktsiooniplaadi (Applied Biosystems) abil, kasutades MicroAmp optilist kilet. Iga Ct-väärtus, mis ületab 35, loetakse avastamislävest kõrgemaks ja märgitakse mittetuvastatavaks.
Tehke ChIP nagu eelnevalt kirjeldatud (58). Lühidalt, rakke töödeldi formaldehüüdiga (lõppkontsentratsioon 1,42%) ja inkubeeriti toatemperatuuril 10 minutit. Kasutage rikastatud paisumispuhvrit (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl ja 0,1% NP-40) jääl 10 minutit, seejärel resuspendeerige immunosadestamise puhvris nagu kirjeldatud (58). Seejärel sonikeeriti proovi järgmiste tsüklitega: 10 tsüklit (20 1-sekundilist impulssi) ja staatiline aeg 40 sekundit. Inkubeerige ChIP-klassi immunoglobuliin G (Cell Signaling Technology; 1 μl), histoon H3 (Cell Signaling Technology; 3 μl), NFAT (Invitrogen; 3 μl) ja SP1 (Cell Signaling Technology; 3 μl) antikehi prooviga temperatuuril 4 °C ja loksutage üleöö. Inkubeerige proteiin A graanuleid (Thermo Fisher Scientific) prooviga temperatuuril 4 °C õrnalt loksutades 1 tund, seejärel rikastage DNA-d chelex graanulitega (Bio-Rad) ja kasutage valgu seedimiseks proteinaas K-d (Thermo Fisher). TNFα promootor tuvastati PCR-iga: otse, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; vastupidi, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207 bp pikkune produkt). Pildid valmistas Image Lab (Bio-Rad) ja kvantifitseeriti ImageJ tarkvara abil.
Rakukultuuri supernatant koguti eespool kirjeldatud viisil. Määramine viidi läbi vastavalt inimese TNFα ELISA komplekti (Invitrogen), inimese IL-2 ELISA komplekti (Invitrogen) ja inimese IFN-γ ELISA komplekti (Abcam) tootja protseduuridele. Tootja protokolli kohaselt lahjendati supernatanti TNFα ja IL-2 tuvastamiseks suhtega 1:100 ning IFN-γ tuvastamiseks suhtega 1:3. Neeldumise mõõtmiseks lainepikkusel 450 nm kasutati EnVision 2104 Multilabel Readerit (PerkinElmer).
PBMC-d eraldati leukotsüütide eraldusproduktidest (STEMCELL Technologies) Ficolli gradienditiheduse tsentrifuugimise abil. CD3+ rakud eraldati PBMC-dest CD3 bead'ide (Miltenyi) abil. MNA juuresolekul või puudumisel aktiveeriti CD3+ rakke plaadile seotud CD3 (5 μg/ml), lahustuva CD28 (3 μg/ml) ja IL-2-ga (300 U/ml; Proleukin) 3 päeva jooksul. 3 päeva pärast rakud koguti, pesti 0,9% soolalahusega ja pellet külmutati kiirkülmutamisega. Rakkude loendamine viidi läbi voolutsütomeetria abil (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R konfiguratsioon), kasutades 123count eBeads'e.
Ekstraheerige metaboliite nagu eespool kirjeldatud. Kuivatatud ekstrakt lahustati kontsentratsioonil 4000 rakuekvivalenti/μl. Analüüsige proovi pöördfaasikromatograafia abil (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ja CORTECS T3 kolonniga (2,1 × 150 mm, osakeste suurus 1,6 μm, pooride suurus 120 Å; #186008500, Waters). Polaarne massispektromeeter (6470, Agilent), milles elektropihustus-ionisatsioon töötab positiivses režiimis. Liikuv faas A on 0,1% sipelghapet (H2O-s), liikuv faas B on 90% atsetonitriil, 0,1% sipelghapet. LC gradient on 100% A puhul 0 kuni 2 minutit, 99% B puhul 2 kuni 7,1 minutit ja 99% B puhul 7,1 kuni 8 minutit. Seejärel tasakaalustage kolonn uuesti liikuva faasiga A voolukiirusel 0,6 ml/min 3 minuti jooksul. Voolukiirus on 0,4 ml/min ja kolonnikamber kuumutatakse temperatuurini 50 °C. Retentsiooniaja (RT) ja transformatsiooni (RT = 0,882 minutit, transformatsioon 1 = 137→94,1, transformatsioon 2 = 137→92, konversioon 3 = 137→78) määramiseks kasutage MNA puhast keemilist standardit (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanada). Kui kõik kolm üleminekut toimuvad õige retentsiooniajaga, kasutatakse spetsiifilisuse tagamiseks kvantifitseerimiseks üleminekut 1. MNA (Toronto Research Chemical Company) standardkõver genereeriti põhilahuse (1 mg/ml) kuue järjestikuse lahjenduse abil, et saada vastavalt 0,1, 1,0, 10 ja 100 ng/ml ning 1,0 ja 10 μg/ml vedeliku standardid. Avastamispiir on 1 ng/ml ja lineaarne vastus on vahemikus 10 ng/ml kuni 10 μg/ml. LC/MS analüüsiks kasutatakse iga kahe mikroliitri proovi ja standardi süstimist ning analüüsiplatvormi stabiilsuse tagamiseks tehakse iga kaheksa süstimise järel segatud kvaliteedikontrolli proovi. Kõigi MNA-ga töödeldud rakuproovide MNA vastused olid testi lineaarses vahemikus. Andmete analüüs tehti kvantitatiivse analüüsi tarkvara MassHunter abil (v9.0, Agilent).
Teise põlvkonna αFR-CAR konstruktsioon pärineb Song jt. tööst (59). Lühidalt öeldes sisaldab konstruktsioon järgmist: CD8a juhtjärjestus, inimese αFR-spetsiifiline üheahelaline varieeruv fragment, CD8a hinge- ja transmembraanne piirkond, CD27 rakusisene domeen ja CD3z rakusisene domeen. Täielik CAR järjestus sünteesiti GenScripti abil ja seejärel klooniti teise põlvkonna lentiviiruse ekspressioonivektorisse GFP ekspressioonikassetist ülesvoolu, mida kasutati transduktsiooni efektiivsuse hindamiseks.
Lentiviirust toodetakse HEK293T rakkude transfektsiooni teel [Ameerika Tüüpkultuuride Kollektsioon (ATCC); kasvatati Dulbecco modifitseeritud Eagle söötmes, mis sisaldab 10% veise loote seerumit (FBS) ja 1% PenStrepi, ning kasutati CAR-GFP vektorit ja pakkimisplasmiidid (psPAX2 ja pMD2.G, Addgene) kasutasid lipofektsiooniamiini (Sigma-Aldrich). Viirust sisaldav supernatant koguti 48 ja 72 tundi pärast transfektsiooni, filtreeriti ja kontsentreeriti ultratsentrifuugimise teel. Kontsentreeritud viirussupernatanti säilitati temperatuuril -80 °C kuni transduktsioonini.
Tervete doonorite leukotsüütide eraldusproduktidest (STEMCELL Technologies) eraldatakse PBMC-d Ficolli gradienditiheduse tsentrifuugimise abil. CD8+ rakkude eraldamiseks PBMC-st kasutage positiivse selektsiooniga CD8 mikrograanuleid (Miltenyi). Stimuleerige T-rakke TransActiga (Miltenyi) ja TexMACS söötmes [Miltenyi; rikastatud 3% kuumusega inaktiveeritud inimese seerumiga, 1% PenStrepiga ja IL-2-ga (300 U/ml)]. 24 tundi pärast stimulatsiooni transdutseeriti T-rakud lentiviirusega (10 μl kontsentreeritud viiruse supernatanti 106 raku kohta). 1 kuni 3 päeva pärast transduktsiooni Cytek Auroral (FSC (edasihajumine)/SSC (külghajumine), Singlet, GFP+) abil) hinnake rakkude GFP ekspressiooni, et näidata vähemalt 30% transduktsiooni efektiivsust.
CAR-T-rakke kultiveeriti 24 tundi Immunocult söötmes (STEMCELL Technologies; rikastatud 1% PenStrep'iga) järgmistel tingimustel: töötlemata, töödeldud 250 μM adenosiiniga või 10 mM MNA-ga. Pärast eeltöötlust pesti CAR-T-rakke PBS-iga ja kombineeriti 20 000 SK-OV-3 rakuga [ATCC; McCoy 5A söötmes (Sigma-Aldrich), millele oli rikastatud 10% FBS-i ja 1% PenStrep'i temperatuuril 10: Efektori ja sihtmärgi suhe 1 amplifitseeriti kolmes korduses rikastatud Immunocult söötmes. Negatiivse ja positiivse kontrollina kasutati vastavalt SK-OV-3 rakke ja digitaalise saponiiniga (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) lüüsitud SK-OV-3 rakke. Pärast 24-tunnist kooskultiveerimist koguti supernatant ja mõõdeti laktaatdehüdrogenaasi (LDH) vastavalt tootja juhistele (LDH Glo tsütotoksilisuse analüüsi komplekt, Promega). LDH supernatant lahjendati LDH puhvris vahekorras 1:50. Tapmise protsent mõõdeti järgmise valemi abil: tapmise protsent = korrektsiooni protsent / maksimaalne tapmismäär x 100%, kus korrektsiooni protsent = ainult T-rakkude kaaskultuur ja maksimaalne tapmismäär = positiivne kontroll-negatiivne kontroll.
Nagu tekstis või materjalides ja meetodites kirjeldatud, kasutage statistiliseks analüüsiks GraphPad Prism 8, Microsoft Exceli või R v3.6.0. Kui samalt patsiendilt kogutakse mitu proovi (näiteks astsiit ja kasvaja), kasutame paaris-t-testi või kaasame patsiendi juhusliku efektina lineaarsesse või üldistatud mudelisse vastavalt vajadusele. Metabolismianalüüsi puhul tehakse olulisuse test kolmes korduses.
Selle artikli lisamaterjalide saamiseks külastage palun veebilehte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1.
See on avatud juurdepääsuga artikkel, mis on levitatud Creative Commonsi litsentsi "Autorile viitamine + Mitteäriline eesmärk" tingimuste kohaselt, mis lubab kasutamist, levitamist ja reprodutseerimist mis tahes meediumis, kui lõppkasutus ei ole ärilise kasu saamiseks ja eelduseks on algse teose õigsus. Viide.
Märkus: Palume teil oma e-posti aadressi esitada ainult selleks, et lehele soovitatud inimene teaks, et soovite talle e-kirja näidata ja et see pole rämpspost. Me ei salvesta ühtegi e-posti aadressi.
Selle küsimuse abil kontrollitakse, kas olete külastaja, ja takistatakse automaatset rämpsposti saatmist.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J.B.R. De Bellard. G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA aitab kaasa T-rakkude immuunsupressioonile ja kujutab endast potentsiaalset immunoteraapia sihtmärki inimese vähi ravis.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J.B.R. De Bellard. G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA aitab kaasa T-rakkude immuunsupressioonile ja kujutab endast potentsiaalset immunoteraapia sihtmärki inimese vähi ravis.
©2021 American Association for the Advanced of Science of Science. kõik õigused kaitstud. AAAS on HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ja COUNTER partner. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.