Propioonhape (PPA), seenevastane aine ja levinud toidulisand, on näidanud, et see põhjustab hiirtel ebanormaalset neuroloogilist arengut, millega kaasneb seedetrakti talitlushäire, mis võib olla põhjustatud soole düsbioosist. On oletatud seost toidu PPA-ga kokkupuute ja soole mikrobioota düsbioosi vahel, kuid seda pole otseselt uuritud. Selles uuringus uurisime PPA-ga seotud muutusi soole mikrobioota koostises, mis võivad viia düsbioosini. Töötlemata dieediga (n = 9) ja PPA-ga rikastatud dieediga (n = 13) toidetud hiirte soole mikrobioomid sekveneeriti pika ulatusega metagenoomse sekveneerimise abil, et hinnata mikroobide koostise ja bakterite ainevahetusradade erinevusi. Toiduga PPA seostus oluliste taksonite arvukuse suurenemisega, sealhulgas mitmete Bacteroides, Prevotella ja Ruminococcus liikide arvukuse suurenemisega, mille liikmeid on varem seostatud PPA tootmisega. PPA-ga kokkupuutunud hiirte mikrobioomidel oli ka rohkem lipiidide metabolismi ja steroidhormoonide biosünteesiga seotud radasid. Meie tulemused näitavad, et PPA võib muuta soole mikrobiootat ja sellega seotud ainevahetusradasid. Need täheldatud muutused rõhutavad, et tarbimiseks ohutuks klassifitseeritud säilitusained võivad mõjutada soolestiku mikrobioota koostist ja seega ka inimeste tervist. Nende hulgast valitakse P, G või S, olenevalt analüüsitavast klassifikatsioonitasemest. Valepositiivsete klassifikatsioonide mõju minimeerimiseks kasutati minimaalset suhtelise arvukuse läve 1e-4 (1/10 000 lugemist). Enne statistilist analüüsi teisendati Brackeni teatatud suhtelised arvukused (fraktsioon_kogu_lugemised) tsentreeritud log-suhte (CLR) teisenduse abil (Aitchison, 1982). Andmete teisendamiseks valiti CLR-meetod, kuna see on skaalainvariantne ja piisav mittehõredate andmekogumite jaoks (Gloor jt, 2017). CLR-teisendus kasutab naturaallogaritmi. Brackeni esitatud loendusandmed normaliseeriti suhtelise logaritmi avaldise (RLE) abil (Anders ja Huber, 2010). Joonised genereeriti matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 ja järjestikuste logaritmide kombinatsiooni abil (Gloor jt, 2017). 0,12,2 ja stantanotatsioonid v. 0,5,0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier jt, 2022). Batsilluse/Bacteroidetese suhe arvutati iga proovi kohta normaliseeritud bakterite arvu abil. Tabelites esitatud väärtused on ümardatud nelja kümnendkohani. Simpsoni mitmekesisuse indeks arvutati KrakenTools v. 1.2 paketis oleva alpha_diversity.py skripti abil (Lu jt, 2022). Skriptis on esitatud Brackeni aruanne ja parameetri -an jaoks on esitatud Simpsoni indeks „Si“. Olulised arvukuse erinevused defineeriti kui keskmised CLR-i erinevused ≥ 1 või ≤ -1. Keskmine CLR-i erinevus ±1 näitab proovitüübi arvukuse 2,7-kordset suurenemist. Märk (+/-) näitab, kas takson on arvukam vastavalt PPA proovis ja kontrollproovis. Olulisus määrati Mann-Whitney U-testi abil (Virtanen jt, 2020). Kasutati Statsmodels v. 0.14 (Benjamini ja Hochberg, 1995; Seabold ja Perktold, 2010) ning mitmekordse testimise korrigeerimiseks rakendati Benjamini-Hochbergi protseduuri. Statistilise olulisuse määramise lävendina kasutati korrigeeritud p-väärtust ≤ 0,05.
Inimese mikrobioomi nimetatakse sageli „keha viimaseks organiks“ ja see mängib inimese tervises olulist rolli (Baquero ja Nombela, 2012). Eelkõige tuntakse soolestiku mikrobioomi selle süsteemse mõju ja rolli poolest paljudes olulistes funktsioonides. Kommensaalsed bakterid on soolestikus arvukad, hõivates mitmeid ökoloogilisi nišše, kasutades toitaineid ja konkureerides potentsiaalsete patogeenidega (Jandhyala jt, 2015). Soolestiku mikrobioota mitmekesised bakteriaalsed komponendid on võimelised tootma olulisi toitaineid, nagu vitamiinid, ja soodustama seedimist (Rowland jt, 2018). Samuti on näidatud, et bakteriaalsed metaboliidid mõjutavad kudede arengut ning parandavad ainevahetus- ja immuunsüsteeme (Heijtz jt, 2011; Yu jt, 2022). Inimese soolestiku mikrobioomi koostis on äärmiselt mitmekesine ja sõltub geneetilistest ja keskkonnateguritest, nagu toitumine, sugu, ravimid ja tervislik seisund (Kumbhare jt, 2019).
Ema toitumine on loote ja vastsündinu arengu kriitilise tähtsusega komponent ning oletatav allikas ühenditele, mis võivad arengut mõjutada (Bazer jt, 2004; Innis, 2014). Üks selline huvipakkuv ühend on propioonhape (PPA), lühikese ahelaga rasvhappe kõrvalsaadus, mis saadakse bakteriaalse kääritamise teel, ja toidulisand (den Besten jt, 2013). PPA-l on antibakteriaalsed ja seenevastased omadused ning seetõttu kasutatakse seda toidu säilitusainena ja tööstuslikes rakendustes hallituse ja bakterite kasvu pärssimiseks (Wemmenhove jt, 2016). PPA-l on erinevates kudedes erinev toime. Maksas on PPA-l põletikuvastane toime, mõjutades tsütokiinide ekspressiooni makrofaagides (Kawasoe jt, 2022). Seda regulatiivset toimet on täheldatud ka teistes immuunrakkudes, mis viib põletiku allareguleerimiseni (Haase jt, 2021). Ajus on aga täheldatud vastupidist mõju. Varasemad uuringud on näidanud, et PPA-ga kokkupuude kutsub hiirtel esile autismilaadse käitumise (El-Ansary jt, 2012). Teised uuringud on näidanud, et PPA võib esile kutsuda glioosi ja aktiveerida ajus põletikku soodustavaid radasid (Abdelli jt, 2019). Kuna PPA on nõrk hape, võib see difundeeruda läbi sooleepiteeli vereringesse ja seega ületada piiravaid barjääre, sealhulgas hematoentsefaalbarjääri ja platsentat (Stinson jt, 2019), mis rõhutab PPA olulisust bakterite toodetud regulatiivse metaboliidina. Kuigi PPA potentsiaalset rolli autismi riskitegurina praegu uuritakse, võib selle mõju autismiga inimestele ulatuda kaugemale neuraalse diferentseerumise esilekutsumisest.
Seedetrakti sümptomid, nagu kõhulahtisus ja kõhukinnisus, on neuroloogilise arenguhäiretega patsientidel tavalised (Cao jt, 2021). Varasemad uuringud on näidanud, et autismispektri häiretega (ASH) patsientide mikrobioom erineb tervete inimeste mikrobioomist, mis viitab soolemikrobioota düsbioosi esinemisele (Finegold jt, 2010). Samamoodi erinevad ka põletikuliste soolehaiguste, rasvumise, Alzheimeri tõvega jne patsientide mikrobioomi omadused tervete inimeste omast (Turnbaugh jt, 2009; Vogt jt, 2017; Henke jt, 2019). Siiski ei ole seni kindlaks tehtud põhjuslikku seost soolemikrobioomi ja neuroloogiliste haiguste või sümptomite vahel (Yap jt, 2021), kuigi arvatakse, et mõnes neist haigusseisunditest on rolli mänginud mitmed bakteriliigid. Näiteks Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio ja teised perekonnad on autismiga patsientide mikrobiootas arvukamalt esindatud (Tomova jt, 2015; Golubeva jt, 2017; Cristiano jt, 2018; Zurita jt, 2020). Märkimisväärselt on mõnede nende perekondade liikidel teadaolevalt PPA tootmisega seotud geenid (Reichardt jt, 2014; Yun ja Lee, 2016; Zhang jt, 2019; Baur ja Dürre, 2023). Arvestades PPA antimikroobseid omadusi, võib selle arvukuse suurendamine olla kasulik PPA-d tootvate bakterite kasvule (Jacobson jt, 2018). Seega võib PFA-rikas keskkond viia muutusteni soole mikrobiootas, sealhulgas seedetrakti patogeenides, mis võivad olla potentsiaalsed tegurid seedetrakti sümptomite tekkes.
Mikrobioomi uuringute keskseks küsimuseks on, kas mikroobide koostise erinevused on aluseks olevate haiguste põhjus või sümptom. Esimene samm toitumise, soolestiku mikrobioomi ja neuroloogiliste haiguste vahelise keerulise seose selgitamiseks on hinnata toitumise mõju mikroobide koostisele. Sel eesmärgil kasutasime pika loetavuse metagenoomilist sekveneerimist, et võrrelda PPA-rikka või PPA-vaese dieediga toidetud hiirte järglaste soolestiku mikrobioome. Järglastele anti sama toitu kui nende emadele. Meie hüpotees oli, et PPA-rikas dieet põhjustab muutusi soolestiku mikroobide koostises ja mikroobide funktsionaalsetes radades, eriti nendes, mis on seotud PPA metabolismi ja/või PPA tootmisega.
Selles uuringus kasutati FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J transgeenseid hiiri (Jackson Laboratories), kes üleekspresseerivad rohelist fluorestseeruvat valku (GFP) glia-spetsiifilise GFAP promootori kontrolli all, järgides Kesk-Florida Ülikooli Loomade Hoolduse ja Kasutuse Komitee (UCF-IACUC) suuniseid (loomade kasutamise loa number: PROTO202000002). Pärast võõrutamist paigutati hiired eraldi puuridesse, igas puuris 1–5 hiirt mõlemast soost. Hiiri toideti ad libitum kas puhastatud kontrolltoiduga (modifitseeritud avatud standardtoit, 16 kcal% rasva) või naatriumpropionaadiga rikastatud dieediga (modifitseeritud avatud standardtoit, 16 kcal% rasva, mis sisaldas 5000 ppm naatriumpropionaati). Kasutatud naatriumpropionaadi kogus vastas 5000 mg PFA-le/kg toidu kogukaalu kohta. See on PPA kõrgeim kontsentratsioon, mis on heaks kiidetud kasutamiseks toidu säilitusainena. Selle uuringu ettevalmistamiseks söödeti emasloomadele mõlemat dieeti 4 nädalat enne paaritumist ja seda jätkati kogu emaslooma tiinuse vältel. Järglased [22 hiirt, 9 kontrollrühma (6 isast, 3 emast) ja 13 PPA-hiirt (4 isast, 9 emast)] võõrutati ja jätkati seejärel sama dieediga mis emasloomad 5 kuud. Järglased surmati 5 kuu vanuselt ja nende soolestiku väljaheited koguti ning säilitati esialgu 1,5 ml mikrotsentrifuugituubides temperatuuril -20 °C ja seejärel viidi -80 °C sügavkülmikusse, kuni peremeesorganismi DNA oli ammendunud ja mikroobsed nukleiinhapped ekstraheeritud.
Peremeesorganismi DNA eemaldati modifitseeritud protokolli (Charalampous jt, 2019) kohaselt. Lühidalt, väljaheite sisu kanti 500 µl InhibitEX-i (Qiagen, kat. nr/ID: 19593) ja säilitati külmutatult. Töödelge maksimaalselt 1-2 väljaheitegraanulit ekstraheerimise kohta. Seejärel homogeniseeriti väljaheite sisu mehaaniliselt, kasutades katseklaasis olevat plastmassist nuia, et moodustada suspensioon. Tsentrifuugige proove kiirusel 10 000 RCF 5 minutit või kuni proovid on graanuliteks muutunud, seejärel imege supernatant välja ja resuspendeerige graanul 250 µl 1× PBS-is. Lisage proovile 250 µl 4,4% saponiini lahust (TCI, tootenumber S0019) pesuvahendina eukarüootsete rakkude membraanide lahtistamiseks. Proove segati õrnalt ühtlaseks massiks ja inkubeeriti toatemperatuuril 10 minutit. Seejärel lisati eukarüootsete rakkude lõhkumiseks proovile 350 μl nukleaasivaba vett, inkubeeriti 30 sekundit ja seejärel lisati 12 μl 5 M NaCl. Seejärel tsentrifuugiti proove kiirusel 6000 RCF 5 minutit. Supernatant aspireeriti ja pellet resuspendeeriti 100 μl 1X PBS-is. Peremeesorganismi DNA eemaldamiseks lisati 100 μl HL-SAN puhvrit (12,8568 g NaCl, 4 ml 1 MgCl2, 36 ml nukleaasivaba vett) ja 10 μl HL-SAN ensüümi (ArticZymes P/N 70910-202). Proove segati pipeteerimise teel hoolikalt ja inkubeeriti Eppendorf™ ThermoMixer C-l temperatuuril 37 °C 30 minutit kiirusel 800 p/min. Pärast inkubeerimist tsentrifuugiti 3 minutit kiirusel 6000 RCF ja pesti kaks korda 800 µl ja 1000 µl 1X PBS-iga. Lõpuks suspendeeriti pellet uuesti 100 µl 1X PBS-is.
Kogu bakteriaalne DNA eraldati New England Biolabs Monarch Genomic DNA Purification Kit'i abil (New England Biolabs, Ipswich, MA, katalooginumber T3010L). Komplektiga kaasasolevat standardset tööprotseduuri on veidi muudetud. Enne lõplikku elueerimist inkubeerige ja hoidke nukleaasivaba vett temperatuuril 60 °C. Lisage igale proovile 10 µl proteinaas K-d ja 3 µl RNase A-d. Seejärel lisage 100 µl rakkude lüüsipuhvrit ja segage õrnalt. Seejärel inkubeeriti proove Eppendorf™ ThermoMixer C-s temperatuuril 56 °C ja kiirusel 1400 p/min vähemalt 1 tund ja kuni 3 tundi. Inkubeeritud proove tsentrifuugiti kiirusel 12 000 RCF 3 minutit ja iga proovi supernatant viidi eraldi 1,5 ml mikrotsentrifuugituubi, mis sisaldas 400 µl sidumislahust. Seejärel segati tuube impulss-vorteksis 5–10 sekundit 1-sekundiliste intervallidega. Kandke iga proovi kogu vedel sisu (umbes 600–700 µL) filtrikassetti, mis on asetatud läbivoolukogumistorusse. Torusid tsentrifuugiti 1000 RCF juures 3 minutit, et võimaldada DNA esialgset seondumist, ja seejärel tsentrifuugiti 12 000 RCF juures 1 minut, et eemaldada järelejäänud vedelik. Proovikolonn viidi uude kogumistorusse ja pesti kaks korda. Esimeseks pesuks lisage igasse torusse 500 µL pesupuhvrit. Pöörake toru 3–5 korda ümber ja tsentrifuugige seejärel 12 000 RCF juures 1 minut. Eemaldage vedelik kogumistorust ja asetage filtrikassett tagasi samasse kogumistorusse. Teiseks pesuks lisage filtrisse 500 µL pesupuhvrit ilma seda ümber pööramata. Proove tsentrifuugiti 12 000 RCF juures 1 minut. Kandke filter 1,5 ml LoBind® torusse ja lisage 100 µL eelsoojendatud nukleaasivaba vett. Filtreid inkubeeriti toatemperatuuril 1 minut ja seejärel tsentrifuugiti 1 minut kiirusel 12 000 RCF. Elueeritud DNA-d säilitati temperatuuril -80 °C.
DNA kontsentratsiooni kvantifitseeriti Qubit™ 4.0 fluoromeetri abil. DNA valmistati ette Qubit™ 1X dsDNA kõrge tundlikkusega komplektiga (katalooginumber Q33231) vastavalt tootja juhistele. DNA fragmentide pikkuse jaotust mõõdeti Aglient™ 4150 või 4200 TapeStationi abil. DNA valmistati ette Agilent™ genoomse DNA reagentide (katalooginumber 5067-5366) ja genoomse DNA ekraanilindi (katalooginumber 5067-5365) abil. Teegi ettevalmistamine viidi läbi Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) kiire PCR vöötkoodimiskomplekti (SQK-RPB004) abil vastavalt tootja juhistele. DNA sekveneeriti ONT GridION™ Mk1 sekvenaatoriga ja Min106D voolurakuga (R 9.4.1). Sekveneerimise sätted olid: suure täpsusega aluste tuvastamine, minimaalne q väärtus 9, vöötkoodi seadistamine ja vöötkoodi kärpimine. Proove sekveneeriti 72 tundi, mille järel esitati baasikutsungi andmed edasiseks töötlemiseks ja analüüsiks.
Bioinformaatilist töötlemist teostati eelnevalt kirjeldatud meetodite abil (Greenman jt, 2024). Sekveneerimise teel saadud FASTQ-failid jagati iga proovi jaoks kataloogideks. Enne bioinformaatilist analüüsi töödeldi andmeid järgmise protsessi abil: esmalt liideti proovide FASTQ-failid üheks FASTQ-failiks. Seejärel filtreeriti alla 1000 bp pikkused lugemised, kasutades Filtlong v. 0.2.1, kusjuures ainus muudetud parameeter oli –min_length 1000 (Wick, 2024). Enne edasist filtreerimist kontrolliti lugemise kvaliteeti NanoPlot v. 1.41.3 abil järgmiste parameetritega: –fastq –plots dot –N50 -o
Taksonoomiliseks klassifitseerimiseks klassifitseeriti lugemised ja kokkupandud kontiigid Kraken2 v. 2.1.2 abil (Wood jt, 2019). Genereerige vastavalt lugemiste ja assemblerite aruanded ja väljundfailid. Lugemiste ja assemblerite analüüsimiseks kasutage valikut –use-names. Lugemissegmentide jaoks on määratud valikud –gzip-compressed ja –paired. Taksonite suhteline arvukus metagenoomides hinnati Bracken v. 2.8 abil (Lu jt, 2017). Esmalt lõime 1000 alust sisaldava kmer-andmebaasi, kasutades bracken-buildi järgmiste parameetritega: -d
Geeni annotatsioon ja suhtelise arvukuse hindamine viidi läbi Maranga jt (Maranga jt, 2023) kirjeldatud protokolli modifitseeritud versiooni abil. Esmalt eemaldati kõigist kooslustest alla 500 bp pikkused kontiigid, kasutades SeqKit v. 2.5.1 (Shen jt, 2016). Seejärel ühendati valitud kooslused pan-metagenoomiks. Avatud lugemisraamid (ORF) identifitseeriti Prodigal v. 1.0.1 abil (Prodigal v. 2.6.3 paralleelversioon) järgmiste parameetritega: -d
Geenid rühmitati esmalt vastavalt Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ortoloogide (KO) identifikaatoritele, mille määras eggNOG, et võrrelda geeniradade arvukust. Enne analüüsi eemaldati geenid, millel puudusid väljalülitused, või geenid, millel oli mitu väljalülitust. Seejärel arvutati iga KO keskmine arvukus proovi kohta ja teostati statistiline analüüs. PPA metabolismi geenid defineeriti kui mis tahes geen, millele määrati KEGG_Pathway veerus rida ko00640, mis näitab rolli propionaadi metabolismis vastavalt KEGG-le. PPA tootmisega seotud geenid on loetletud lisas tabelis 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Permutatsioonitestid viidi läbi, et tuvastada PPA metabolismi ja tootmise geene, mis olid igas proovitüübis oluliselt arvukamad. Iga analüüsitud geeni kohta tehti tuhat permutatsiooni. Statistilise olulisuse määramiseks kasutati piirväärtusena p-väärtust 0,05. Klastri üksikutele geenidele määrati funktsionaalsed annotatsioonid klastri representatiivsete geenide annotatsioonide põhjal. PPA metabolismi ja/või PPA tootmisega seotud taksoneid oli võimalik tuvastada, sobitades Kraken2 väljundfailides olevad kontigude ID-d samade kontigude ID-dega, mis säilitati funktsionaalse annotatsiooni ajal eggNOG abil. Olulisuse testimine viidi läbi eelnevalt kirjeldatud Mann-Whitney U-testi abil. Mitmekordse testimise korrektsioon viidi läbi Benjamini-Hochbergi protseduuri abil. Statistilise olulisuse määramiseks kasutati piirväärtusena p-väärtust ≤ 0,05.
Hiirte soolemikrobioomi mitmekesisust hinnati Simpsoni mitmekesisuse indeksi abil. Kontroll- ja PPA-proovide vahel ei täheldatud olulisi erinevusi perekonna ja liigi mitmekesisuse osas (perekonna p-väärtus: 0,18, liigi p-väärtus: 0,16) (joonis 1). Seejärel võrreldi mikroobide koostist peakomponentide analüüsi (PCA) abil. Joonis 2 näitab proovide klasterdumist nende hõimkondade kaupa, mis näitab, et PPA ja kontrollproovide mikrobioomide liigilises koostises oli erinevusi. See klasterdumine oli perekonna tasandil vähem väljendunud, mis viitab sellele, et PPA mõjutab teatud baktereid (lisajoonis 1).
Joonis 1. Perekondade alfa-mitmekesisuse ja hiire soolemikrobiomi liikide koosseisu jaotus. Kastidiagrammid, mis näitavad perekondade (A) ja liikide (B) Simpsoni mitmekesisuse indekseid PPA ja kontrollproovides. Olulisus määrati Mann-Whitney U testi abil ja mitmekordne korrektsioon viidi läbi Benjamini-Hochbergi protseduuri abil. ns, p-väärtus ei olnud statistiliselt oluline (p>0,05).
Joonis 2. Hiire soolestiku mikrobioomi koostise põhikomponentide analüüsi tulemused liigi tasandil. Põhikomponentide analüüsi graafik näitab proovide jaotust kahe esimese põhikomponendi vahel. Värvid näitavad proovi tüüpi: PPA-ga kokku puutunud hiired on lillad ja kontrollhiired kollased. Põhikomponendid 1 ja 2 on joonistatud vastavalt x-teljel ja y-teljel ning on väljendatud nende seletatud dispersioonisuhtena.
RLE teisendatud loendusandmete abil täheldati kontroll- ja PPA-hiirtel Bacteroidetes/Bacilli mediaansuhte olulist langust (kontroll: 9,66, PPA: 3,02; p-väärtus = 0,0011). See erinevus tulenes Bacteroidetes'i suuremast arvukusest PPA-hiirtel võrreldes kontrollrühmaga, kuigi erinevus ei olnud oluline (kontrollrühma keskmine CLR: 5,51, PPA keskmine CLR: 6,62; p-väärtus = 0,054), samas kui Bacteroidetes'i arvukus oli sarnane (kontrollrühma keskmine CLR: 7,76, PPA keskmine CLR: 7,60; p-väärtus = 0,18).
Soolestiku mikrobioomi taksonoomiliste liikmete arvukuse analüüs näitas, et 1 hõimkond ja 77 liiki erinesid PPA ja kontrollproovide vahel oluliselt (lisa tabel 2). 59 liigi arvukus PPA proovides oli oluliselt suurem kui kontrollproovides, samas kui ainult 16 liigi arvukus kontrollproovides oli suurem kui PPA proovides (joonis 3).
Joonis 3. Taksonite erinev arvukus PPA ja kontrollhiirte soolestiku mikrobioomis. Vulkaanidiagrammid näitavad perekondade (A) või liikide (B) arvukuse erinevusi PPA ja kontrollproovide vahel. Hallid täpid näitavad, et taksonite arvukuses ei ole olulist erinevust. Värvilised täpid näitavad olulisi arvukuse erinevusi (p-väärtus ≤ 0,05). Punase ja helesinisega (kontroll- ja PPA-proovid) on näidatud 20 suurima arvukuse erinevusega taksonit. Kollased ja lillad täpid olid kontroll- või PPA-proovides vähemalt 2,7 korda arvukamad kui kontrollproovides. Mustad täpid tähistavad taksoneid, millel on oluliselt erinev arvukus, keskmise CLR-i erinevusega vahemikus -1 kuni 1. P-väärtused arvutati Mann-Whitney U-testi abil ja korrigeeriti mitmekordse testimise jaoks Benjamini-Hochbergi protseduuri abil. Paksus kirjas keskmised CLR-i erinevused näitavad olulisi arvukuse erinevusi.
Pärast soolemikroobide koostise analüüsimist teostasime mikrobioomi funktsionaalse annotatsiooni. Pärast madala kvaliteediga geenide väljafiltreerimist tuvastati kõigis proovides kokku 378 355 unikaalset geeni. Nende geenide transformeeritud arvukust kasutati peakomponentide analüüsiks (PCA) ja tulemused näitasid proovitüüpide kõrget klasterdumise astet nende funktsionaalsete profiilide põhjal (joonis 4).
Joonis 4. PCA tulemused, kasutades hiire soolemikrobioomi funktsionaalset profiili. PCA graafik näitab proovide jaotust nende kahe esimese põhikomponendi vahel. Värvid näitavad proovi tüüpi: PPA-ga kokkupuutunud hiired on lillad ja kontrollhiired kollased. Põhikomponendid 1 ja 2 on joonistatud vastavalt x-teljel ja y-teljel ning on väljendatud nende seletatud dispersioonisuhtena.
Järgmisena uurisime KEGG geeni väljalülitamise arvukust erinevat tüüpi proovides. Kokku tuvastati 3648 unikaalset väljalülitamist, millest 196 olid kontrollproovides oluliselt ja 106 PPA proovides oluliselt rohkem (joonis 5). Kontrollproovides tuvastati kokku 145 geeni ja PPA proovides 61 geeni, kusjuures arvukus oli oluliselt erinev. Lipiidide ja aminosuhkrute metabolismiga seotud rajad olid PPA proovides oluliselt rohkem rikkad (lisa tabel 3). Lämmastiku metabolismi ja väävli releesüsteemidega seotud rajad olid kontrollproovides oluliselt rohkem rikkad (lisa tabel 3). Aminosuhkrute/nukleotiidide metabolismiga (ko:K21279) ja inositoolfosfaadi metabolismiga (ko:K07291) seotud geenide arvukus oli PPA proovides oluliselt suurem (joonis 5). Kontrollproovides oli oluliselt rohkem bensoaadi metabolismiga (ko:K22270), lämmastiku metabolismiga (ko:K00368) ja glükolüüsi/glükoneogeneesiga (ko:K00131) seotud geene (joonis 5).
Joon. 5. KO-de erinev arvukus PPA ja kontrollhiirte soolemikrobioomis. Vulkaanidiagramm kujutab funktsionaalrühmade (KO-de) arvukuse erinevusi. Hallid täpid näitavad KO-sid, mille arvukus ei erinenud proovitüüpide vahel oluliselt (p-väärtus > 0,05). Värvilised täpid näitavad olulisi erinevusi arvukuses (p-väärtus ≤ 0,05). Punase ja helesinisega on näidatud 20 KO-d, millel on suurimad arvukuse erinevused proovitüüpide vahel, mis vastavad vastavalt kontroll- ja PPA-proovidele. Kollased ja lillad täpid näitavad KO-sid, mis olid kontroll- ja PPA-proovides vähemalt 2,7 korda arvukamad. Mustad täpid näitavad KO-sid, millel on oluliselt erinev arvukus, mille keskmine CLR-i erinevus on vahemikus -1 kuni 1. P-väärtused arvutati Mann-Whitney U-testi abil ja korrigeeriti mitmekordseks võrdluseks Benjamini-Hochbergi protseduuri abil. NaN näitab, et KO ei kuulu KEGG raja juurde. Paksus kirjas keskmised CLR-i erinevuse väärtused näitavad olulisi erinevusi arvukuses. Üksikasjalikku teavet loetletud KO-de kuuluvate radade kohta leiate lisatabelist 3.
Annoteeritud geenide hulgas oli 1601 geenil valimi tüüpide vahel oluliselt erinev arvukus (p ≤ 0,05), kusjuures iga geen oli vähemalt 2,7 korda arvukam. Nendest geenidest oli 4 geeni kontrollproovides ja 1597 geeni PPA proovides rohkem. Kuna PPA-l on antimikroobsed omadused, uurisime PPA metabolismi ja produktsiooni geenide arvukust valimi tüüpide vahel. 1332 PPA metabolismiga seotud geeni hulgas oli 27 geeni kontrollproovides oluliselt rohkem ja 12 geeni PPA proovides rohkem. 223 PPA tootmisega seotud geeni hulgas oli 1 geen PPA proovides oluliselt rohkem. Joonis 6A näitab täiendavalt PPA metabolismis osalevate geenide suuremat arvukust, kusjuures kontrollproovides on arvukus oluliselt suurem ja efektid on suured, samas kui joonis 6B toob esile üksikud geenid, mille arvukus PPA proovides on oluliselt suurem.
Joon. 6. PPA-ga seotud geenide erinev arvukus hiire soolestiku mikrobioomis. Vulkaanidiagrammid kujutavad PPA metabolismi (A) ja PPA tootmisega (B) seotud geenide arvukuse erinevusi. Hallid täpid näitavad geene, mille arvukus ei erinenud valimitüüpide vahel oluliselt (p-väärtus > 0,05). Värvilised täpid näitavad olulisi arvukuse erinevusi (p-väärtus ≤ 0,05). 20 geeni, millel on suurimad arvukuse erinevused, on näidatud vastavalt punase ja helesinisega (kontroll- ja PPA-proovid). Kollaste ja lillade punktide arvukus oli kontroll- ja PPA-proovides vähemalt 2,7 korda suurem kui kontrollproovides. Mustad täpid tähistavad geene, millel on oluliselt erinev arvukus, keskmise CLR-i erinevusega vahemikus -1 kuni 1. P-väärtused arvutati Mann-Whitney U-testi abil ja korrigeeriti mitmekordsete võrdluste jaoks Benjamini-Hochbergi protseduuri abil. Geenid vastavad representatiivsetele geenidele mitteredundantse geenikataloogis. Geeninimed koosnevad KEGG sümbolist, mis tähistab KO geeni. Paksus kirjas keskmised CLR-i erinevused näitavad oluliselt erinevat arvukust. Kriips (-) näitab, et KEGG andmebaasis geeni sümbol puudub.
Taksonid, mille geenid on seotud PPA metabolismi ja/või tootmisega, identifitseeriti, sobitades kontigude taksonoomilise identiteedi geeni kontigu ID-ga. Perekonna tasandil leiti 130 perekonnal PPA metabolismiga seotud geene ja 61 perekonnal PPA tootmisega seotud geene (lisa tabel 4). Siiski ei näidanud ükski perekond olulisi erinevusi arvukuses (p > 0,05).
Liigi tasandil leiti 144 bakteriliigil PPA metabolismiga seotud geene ja 68 bakteriliigil PPA tootmisega seotud geene (lisa tabel 5). PPA metaboliseerijate seas näitas kaheksa bakteri arvukuse olulist suurenemist proovitüüpide vahel ja kõigil näitasid olulised muutused ka toimes (lisa tabel 6). Kõik tuvastatud PPA metaboliseerijad, kellel esines olulisi erinevusi arvukuses, olid PPA proovides arvukamad. Liigi tasemel klassifikatsioon näitas perekondade esindajaid, mis ei erinenud proovitüüpide vahel oluliselt, sealhulgas mitu Bacteroides ja Ruminococcus liiki, samuti Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus ja Alcaligenes polymorpha. PPA-d tootvate bakterite seas näitas neli bakterit proovitüüpide vahel olulisi erinevusi arvukuses. Liigid, mille arvukuses oli olulisi erinevusi, olid Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis ja Ruminococcus bovis.
Selles uuringus uurisime PPA-ga kokkupuute mõju hiirte soolestiku mikrobiootale. PPA võib bakterites esile kutsuda erinevaid reaktsioone, kuna seda toodavad teatud liigid, teised liigid kasutavad seda toiduallikana või sellel on antimikroobne toime. Seetõttu võib selle lisamine soolestiku keskkonda toidulisandite kaudu avaldada erinevat mõju sõltuvalt tolerantsusest, vastuvõtlikkusest ja võimest seda toitaineallikana kasutada. Tundlikud bakteriliigid võidakse elimineerida ja asendada nendega, mis on PPA suhtes resistentsemad või suudavad seda toiduallikana kasutada, mis viib muutusteni soolestiku mikrobioota koostises. Meie tulemused näitasid olulisi erinevusi mikroobide koostises, kuid mitte mõju üldisele mikroobide mitmekesisusele. Suurimad mõjud täheldati liikide tasandil, kusjuures üle 70 taksoni erines PPA ja kontrollproovide arvukuses oluliselt (lisa tabel 2). PPA-ga kokkupuutunud proovide koostise edasine hindamine näitas mikroobide liikide suuremat heterogeensust võrreldes kokku puutumata proovidega, mis viitab sellele, et PPA võib parandada bakterite kasvuomadusi ja piirata bakterite populatsioone, mis suudavad ellu jääda PPA-rikkas keskkonnas. Seega võib PPA selektiivselt esile kutsuda muutusi, mitte põhjustada soolestiku mikrobioota mitmekesisuse laialdast häirimist.
Varem on näidatud, et toidu säilitusained, näiteks PPA, muudavad soolestiku mikrobioomi komponentide arvukust, mõjutamata üldist mitmekesisust (Nagpal jt, 2021). Siin täheldasime kõige silmatorkavamaid erinevusi Bacteroidetes'i liikide vahel hõimkonnas Bacteroidetes (varem tuntud kui Bacteroidetes), mis oli PPA-ga kokku puutunud hiirtel oluliselt rikastatud. Bacteroides'i liikide suurenenud arvukus on seotud suurenenud lima lagunemisega, mis võib suurendada nakkusohtu ja soodustada põletikku (Cornick jt, 2015; Desai jt, 2016; Penzol jt, 2019). Ühes uuringus leiti, et Bacteroides fragilis'ega ravitud vastsündinud isastel hiirtel ilmnes autismispektri häirele (ASD) sarnane sotsiaalne käitumine (Carmel jt, 2023) ja teised uuringud on näidanud, et Bacteroides'i liigid võivad muuta immuunaktiivsust ja viia autoimmuunse põletikulise kardiomüopaatiani (Gil-Cruz jt, 2019). Perekondadesse Ruminococcus, Prevotella ja Parabacteroides kuuluvate liikide arv oli PPA-ga kokku puutunud hiirtel samuti märkimisväärselt suurenenud (Coretti jt, 2018). Teatud Ruminococcus'i liigid on seotud selliste haigustega nagu Crohni tõbi põletikku soodustavate tsütokiinide tootmise kaudu (Henke jt, 2019), samas kui Prevotella liigid, näiteks Prevotella humani, on seotud metaboolsete haigustega, nagu hüpertensioon ja insuliinitundlikkus (Pedersen jt, 2016; Li jt, 2017). Lõpuks leidsime, et Bacteroidetes'i (varem tuntud kui Firmicutes) ja Bacteroidetes'i suhe oli PPA-ga kokku puutunud hiirtel oluliselt madalam kui kontrollhiirtel, kuna Bacteroidetes'i liikide koguhulk oli suurem. Varem on näidatud, et see suhe on oluline soole homöostaasi näitaja ning selle suhte häireid on seostatud mitmesuguste haigusseisunditega (Turpin jt, 2016; Takezawa jt, 2021; An jt, 2023), sealhulgas põletikuliste soolehaigustega (Stojanov jt, 2020). Kokkuvõttes näib, et kõrgenenud PPA sisaldus toidus mõjutab kõige tugevamalt Bacteroidetes hõimkonna liike. See võib olla tingitud suuremast PPA-taluvusest või võimest kasutada PPA-d energiaallikana, mis on osutunud tõeks vähemalt ühe liigi, Hoylesella enocea, puhul (Hitch jt, 2022). Teise võimalusena võib ema PPA-ga kokkupuude soodustada loote arengut, muutes hiire järglaste soolestiku Bacteroidetes koloniseerimise suhtes vastuvõtlikumaks; meie uuringu ülesehitus ei võimaldanud aga sellist hindamist.
Metagenoomilise sisu hindamine näitas olulisi erinevusi PPA metabolismi ja tootmisega seotud geenide arvukuses, kusjuures PPA-ga kokku puutunud hiirtel oli suurem PPA tootmise eest vastutavate geenide arvukus, samas kui PPA-ga mitte kokku puutunud hiirtel oli suurem PAA metabolismi eest vastutavate geenide arvukus (joonis 6). Need tulemused viitavad sellele, et PPA mõju mikroobide koostisele ei pruugi tuleneda ainult selle kasutamisest, vastasel juhul oleks PPA metabolismiga seotud geenide arvukus pidanud PPA-ga kokku puutunud hiirte soolemikrobioomis olema suurem. Üks seletus on see, et PPA vahendab bakterite arvukust peamiselt oma antimikroobse toime kaudu, mitte aga bakterite poolt toitainena kasutamise kaudu. Varasemad uuringud on näidanud, et PPA pärsib Salmonella Typhimurium'i kasvu annusest sõltuval viisil (Jacobson jt, 2018). Kokkupuude PPA kõrgemate kontsentratsioonidega võib selekteerida baktereid, mis on resistentsed selle antimikroobsete omaduste suhtes ja ei pruugi tingimata olla võimelised seda metaboliseerima ega tootma. Näiteks näitasid mitmed Parabacteroides'i liigid PPA proovides oluliselt suuremat arvukust, kuid PPA metabolismi või tootmisega seotud geene ei tuvastatud (lisatabelid 2, 4 ja 5). Lisaks on PPA tootmine käärimise kõrvalproduktina laialt levinud erinevate bakterite seas (Gonzalez-Garcia jt, 2017). Suurem bakterite mitmekesisus võib olla põhjuseks PPA metabolismiga seotud geenide suuremale arvukusele kontrollproovides (Averina jt, 2020). Lisaks ennustati ainult 27 (2,14%) 1332 geenist olevat geenid, mis on seotud ainult PPA metabolismiga. Paljud PPA metabolismiga seotud geenid on seotud ka teiste ainevahetusradadega. See näitab veelgi, et PPA metabolismiga seotud geenide arvukus oli kontrollproovides suurem; need geenid võivad toimida radades, mis ei too kaasa PPA kasutamist ega moodustumist kõrvalproduktina. Sel juhul näitas ainult üks PPA genereerimisega seotud geen olulisi erinevusi proovitüüpide vahel. Erinevalt PPA metabolismiga seotud geenidest valiti PPA tootmise markergeenid, kuna need on otseselt seotud PPA tootmise bakteriaalse rajaga. PPA-ga kokkupuutunud hiirtel leiti, et kõigil liikidel oli oluliselt suurenenud PPA arvukus ja tootmisvõimsus. See toetab ennustust, et PPA-d valivad PPA tootjaid ja ennustavad seega PPA tootmisvõimsuse suurenemist. Geenide arvukus ei korreleeru aga tingimata geeniekspressiooniga; seega, kuigi PPA metabolismiga seotud geenide arvukus on kontrollproovides suurem, võib ekspressioonimäär olla erinev (Shi jt, 2014). PPA-d tootvate geenide levimuse ja PPA tootmise vahelise seose kinnitamiseks on vaja uurida PPA tootmises osalevate geenide ekspressiooni.
PPA ja kontrollmetagenoomide funktsionaalne annotatsioon näitas mõningaid erinevusi. Geenisisalduse PCA analüüs näitas PPA ja kontrollproovide vahel diskreetseid klastreid (joonis 5). Proovisisene klasterdamine näitas, et kontrollgeenide sisaldus oli mitmekesisem, samas kui PPA proovid klasterdusid. Geenisisalduse järgi klasterdamine oli võrreldav liikide koostise järgi klasterdamisega. Seega on radade arvukuse erinevused kooskõlas muutustega konkreetsete liikide ja tüvede arvukuses nendes. PPA proovides olid kaks oluliselt suurema arvukusega rada seotud aminosuhkru/nukleotiidi suhkru metabolismiga (ko:K21279) ja mitme lipiidide metabolismi rajaga (ko:K00647, ko:K03801; lisatabel 3). Ko:K21279-ga seotud geenid on teadaolevalt seotud perekonnaga Bacteroides, mis on üks perekondadest, millel on PPA proovides oluliselt suurem liikide arv. See ensüüm suudab immuunvastuse vältida, ekspresseerides kapsli polüsahhariide (Wang jt, 2008). See võib seletada PPA-ga kokku puutunud hiirtel täheldatud bakteroidide arvu suurenemist. See täiendab PPA mikrobioomis täheldatud rasvhapete sünteesi suurenemist. Bakterid kasutavad rasvhapete tootmiseks FASIIko:K00647 (fabB) rada, mis võib mõjutada peremeesorganismi ainevahetusradasid (Yao ja Rock, 2015; Johnson jt, 2020), ning lipiidide metabolismi muutused võivad mängida rolli neuroloogilises arengus (Yu jt, 2020). Teine rada, mis näitas PPA proovides suurenenud arvukust, oli steroidhormoonide biosüntees (ko:K12343). Üha rohkem on tõendeid selle kohta, et soolemikrobioota võime mõjutada hormoonide taset ja hormoonide poolt mõjutatav olemise vahel on pöördvõrdeline seos, nii et kõrgenenud steroidide tase võib avaldada tervisele negatiivset mõju (Tetel jt, 2018).
See uuring ei ole ilma piirangute ja kaalutlusteta. Oluline erinevus on see, et me ei teinud loomade füsioloogilisi hinnanguid. Seetõttu ei ole võimalik otseselt järeldada, kas mikrobioomi muutused on seotud mõne haigusega. Teine kaalutlus on see, et selles uuringus osalenud hiiri toideti sama toiduga kui nende emasid. Tulevased uuringud võivad kindlaks teha, kas üleminek PPA-rikkalt toidult PPA-vabale toidule parandab selle mõju mikrobioomile. Meie uuringu üks piirang, nagu paljude teistegi, on piiratud valimi suurus. Kuigi saab teha kehtivaid järeldusi, annaks suurem valimi suurus tulemuste analüüsimisel suurema statistilise võimsuse. Samuti oleme ettevaatlikud järelduste tegemisel seose kohta soolemikrobioomi muutuste ja mis tahes haiguse vahel (Yap jt, 2021). Segavad tegurid, sealhulgas vanus, sugu ja toitumine, võivad mikroorganismide koostist oluliselt mõjutada. Need tegurid võivad selgitada kirjanduses täheldatud vastuolusid soolemikrobioomi seose kohta keeruliste haigustega (Johnson jt, 2019; Lagod ja Naser, 2023). Näiteks on näidatud, et perekonna Bacteroidetes liikmete esinemine on ASD-ga loomadel ja inimestel kas suurenenud või vähenenud (Angelis jt, 2013; Kushak jt, 2017). Samamoodi on põletikuliste soolehaigustega patsientide soolestiku koostise uuringud leidnud samades taksonites nii suurenemist kui ka vähenemist (Walters jt, 2014; Forbes jt, 2018; Upadhyay jt, 2023). Soolise eelarvamuse mõju piiramiseks püüdsime tagada sugude võrdse esindatuse, nii et erinevused oleksid tõenäoliselt tingitud toitumisest. Funktsionaalse annotatsiooni üks väljakutse on üleliigsete geenijärjestuste eemaldamine. Meie geeniklastrite meetod nõuab 95% järjestuse identsust ja 85% pikkuse sarnasust, samuti 90% joondamist, et välistada vale klastrite moodustamine. Mõnel juhul täheldasime aga samade annotatsioonidega geenigruppe (nt MUT) (joonis 6). Selleks, et teha kindlaks, kas need ortoloogid on erinevad, seotud konkreetsete perekondadega või on see geeniklasterdamise lähenemisviisi piirang, on vaja täiendavaid uuringuid. Funktsionaalse annotatsiooni teine piirang on võimalik valeklassifikatsioon; bakteriaalne geen mmdA on teadaolev ensüüm, mis osaleb propionaadi sünteesis, kuid KEGG ei seosta seda propionaadi ainevahetusrajaga. Seevastu scpB ja mmcD ortoloogid on seotud. Suur hulk geene ilma määratud väljalülituseta võib põhjustada võimetuse tuvastada PPA-ga seotud geene geenide arvukuse hindamisel. Edasised uuringud saavad kasu metatranskriptoomianalüüsist, mis võib anda sügavama arusaama soolemikrobioota funktsionaalsetest omadustest ja siduda geeniekspressiooni võimalike allavoolu mõjudega. Uuringute puhul, mis hõlmavad spetsiifilisi neuroloogilisi arenguhäireid või põletikulisi soolehaigusi, on vaja loomade füsioloogilisi ja käitumuslikke hinnanguid, et siduda mikrobioomi koostise muutused nende häiretega. Täiendavad uuringud, mis hõlmavad soolemikrobioomi siirdamist iduvabadesse hiirtesse, oleksid samuti kasulikud, et teha kindlaks, kas mikrobioom on haiguse põhjustaja või tunnus.
Kokkuvõttes näitasime, et toidus sisalduv PPA toimib soolestiku mikrobioota koostist muutva tegurina. PPA on FDA poolt heaks kiidetud säilitusaine, mida leidub laialdaselt erinevates toitudes ja mis pikaajalisel kokkupuutel võib häirida normaalset soolestiku mikrofloorat. Leidsime muutusi mitmete bakterite arvukuses, mis viitab sellele, et PPA võib mõjutada soolestiku mikrobioota koostist. Mikrobioota muutused võivad viia teatud ainevahetusradade taseme muutusteni, mis omakorda võivad viia füsioloogiliste muutusteni, mis on peremeesorganismi tervisega seotud. Edasised uuringud on vajalikud, et teha kindlaks, kas toidus sisalduva PPA mõju mikroobide koostisele võib põhjustada düsbioosi või muid haigusi. See uuring loob aluse edasistele uuringutele selle kohta, kuidas PPA mõju soolestiku koostisele võib mõjutada inimeste tervist.
Käesolevas uuringus esitatud andmekogumid on kättesaadavad veebirepositooriumides. Repositooriumi nimi ja registreerimisnumber on: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Selle loomkatse kiitis heaks Kesk-Florida Ülikooli loomade hooldamise ja kasutamise komitee (UCF-IACUC) (loomade kasutamise loa number: PROTO202000002). See uuring vastab kohalikele seadustele, määrustele ja institutsioonilistele nõuetele.
NG: Kontseptualiseerimine, andmete kureerimine, formaalne analüüs, uurimine, metoodika, tarkvara, visualiseerimine, kirjutamine (mustand), kirjutamine (ülevaatamine ja toimetamine). LA: Kontseptualiseerimine, andmete kureerimine, metoodika, ressursid, kirjutamine (ülevaatamine ja toimetamine). SH: Formaalne analüüs, tarkvara, kirjutamine (ülevaatamine ja toimetamine). SA: Uurimine, kirjutamine (ülevaatamine ja toimetamine). Peakohtunik: Uurimine, kirjutamine (ülevaatamine ja toimetamine). SN: Kontseptualiseerimine, projekti administreerimine, ressursid, juhendamine, kirjutamine (ülevaatamine ja toimetamine). TA: Kontseptualiseerimine, projekti administreerimine, juhendamine, kirjutamine (ülevaatamine ja toimetamine).
Autorid kinnitasid, et nad ei saanud selle artikli uurimise, kirjutamise ja/või avaldamise eest rahalist toetust.
Autorid kinnitavad, et uuring viidi läbi ilma igasuguste äriliste või rahaliste suheteta, mida võiks tõlgendada potentsiaalse huvide konfliktina. Ei ole kohaldatav.
Kõik selles artiklis väljendatud arvamused on üksnes autorite omad ega kajasta tingimata nende institutsioonide, kirjastajate, toimetajate ega retsensentide seisukohti. Selles artiklis hinnatud toodetele ega nende tootjate esitatud väidetele ei anna kirjastaja mingit garantiid ega toetust.
Selle artikli lisamaterjali leiab veebist: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). Propioonhape kutsub esile glioosi ja neuroinflammatsiooni, reguleerides PTEN/AKT rada autismispektri häirete korral. Scientific reports 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Koostiseandmete statistiline analüüs. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Firmicutes/Bacteroidetes suhe rinnavähi riskitegurina. Journal of Clinical Medicine, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Järjestuste loendamise andmete diferentsiaalse ekspressiooni analüüs. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI jt (2013). Rooja mikrobioota ja metaboloom lastel, kellel on autism ja muul viisil täpsustamata pervasiivne arenguhäire. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Soolemikrobioota bakteriaalsed neurometaboolsed omadused autismispektri häiretega väikelastel. Journal of Medical Microbiology 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). Mikrobioom kui inimese organ. Clinical Microbiology and Infection 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Uued teadmised propioonhapet tootvate bakterite füsioloogiast: Anaerotignum propionicum ja Anaerotignum neopropionicum (varem Clostridium propionicum ja Clostridium neopropionicum). Microorganisms 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Ema toitumine ja loote areng. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y. ja Hochberg, J. (1995). Valepositiivsete tulemuste määra kontrollimine: praktiline ja tõhus lähenemisviis mitmekordsele testimisele. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Postituse aeg: 18. aprill 2025