Täname teid Nature.com-i külastamise eest. Teie kasutataval brauseriversioonil on CSS-i jaoks piiratud tugi. Parima kogemuse saamiseks soovitame teil kasutada värskendatud brauserit (või lülitada Internet Exploreris ühilduvusrežiim välja). Seni kuvame saiti jätkuva toe tagamiseks ilma stiilide ja JavaScriptita.
Erinevalt selgroogsetest arvatakse laialdaselt, et putukatel puuduvad isasloomadele suunatud suguhormoonid. Anopheles gambiae puhul näib ekdüsooni steroid 20-hüdroksüekdüsoon (20E) olevat arenenud kontrollima munaraku arengut, kui seda sünteesivad emased2, ja indutseerima paaritumisvastase refraktaarse perioodi, kui seda edastavad isased3. Kuna munaraku areng ja paaritumine on olulised reproduktiivsed omadused, võib mõistmine, kuidas emased Anopheles sääsed neid hormonaalseid signaale integreerivad, hõlbustada uute malaaria tõrje programmide väljatöötamist. Siin selgitame, et neid reproduktiivfunktsioone reguleerivad erinevad sugusteroidid keerulise ekdüsteroide aktiveerivate/inaktiveerivate ensüümide võrgustiku kaudu. Tuvastasime isastele spetsiifilise oksüdeeritud ekdüsooni, 3-dehüdro-20E (3D20E), mis kaitseb sugu, peatades emase seksuaalse vastuvõtlikkuse pärast seksuaalset ülekannet ja aktiveerimist defosforüülimise teel. Märkimisväärselt indutseeris 3D20E ülekanne ka reproduktiivgeenide ekspressiooni, mis säilitavad munaraku arengu Plasmodium'i nakkuse ajal, tagades nakatunud emaste tervise. Emastelt saadud 20E ei kutsu esile seksuaalset vastust, kuid võimaldab paarituvatel isenditel munevad pärast 20E-d inhibeerivate kinaaside inhibeerimist. Selle isastele spetsiifilise putukate steroidhormooni tuvastamine ja selle roll emasloomade seksuaalse vastuvõtlikkuse, viljakuse ja Plasmodiumiga interaktsiooni reguleerimisel viitab malaariat levitavate sääskede reproduktiivse edukuse vähendamise potentsiaalile.
Malaariajuhtumite ja -surmade arv on taas tõusuteel4, kuna Anopheles sääsed, kes on inimeste malaariaparasiitide ainus vektor, on laialt levinud insektitsiidiresistentsuse tõttu. Nende sääskede paaritumisbioloogia on eriti atraktiivne sihtmärk uudsete malaaria tõrje meetmete jaoks, kuna emased paarituvad ainult üks kord5; selle ühekordse paaritumissündmuse steriilseks muutmisel oleks suur potentsiaal vähendada sääskede populatsiooni põllul.
Naised muutuvad seksuaalselt võimetuks pärast meestelt kõrge tiitriga steroidhormoonide saamist. Uuringud on näidanud, et edasise paaritumise raskuste käivitajaks on 20-hüdroksüekdüsoon (20E), steroidhormoon, mida tuntakse paremini vastse staadiumis sulgimistsükli regulaatorina. Isaste võime sünteesida ja üle kanda 20E-d on arenenud spetsiifiliselt Anopheles liikidel, mis kuuluvad alamperekonda Cellia7, mis on levinud Aafrikas ja hõlmab kõige ohtlikumaid malaariavektoreid, sealhulgas Anopheles gambiae. See on eriti tähelepanuväärne, kuna nende liikide emased toodavad 20E-d ka pärast iga verejahutamist ja 20E juhib oogeneesi tsüklit (vt viide 8). Siiski on vähe teada selle kohta, kuidas emased integreerivad signaale kahest erinevast ekdüsooni allikast (isase ülekanne ja vere toitmise indutseerimine), ilma et see kahjustaks nende endi paaritumisvõimet. Tegelikult, kui emaste toodetud 20E vallandab seksuaalse talumatuse, viib see neitsilikult toitvate isendite viljatuseni, mis on nende sääskede puhul väga levinud käitumine5.
Võimalik seletus on see, et A. gambiae isased kannavad üle modifitseeritud isasspetsiifilist ekdüsooni, mis aktiveerib emasloomade reproduktiivtraktis signaaliülekande kaskaadi, mille tulemuseks on paaritumise ebastabiilsus. Kuigi selgroogsetel on mitu steroidhormooni, näiteks östrogeen ja androgeen (vaadatud viites 9), ei ole meie teada putukates androgeenselt kallutatud steroide tuvastatud.
Meie eesmärk oli määrata suguküpse A. gambiae isasloomade lisanäärmes (MAG) steroidhormoonide repertuaari, otsides võimalikke modifitseerivaid steroide. Kasutades varem kasutatud vähem spetsiifilise meetodi asemel kõrgefektiivset vedelikkromatograafiat koos tandem-massispektromeetriaga (HPLC-MS/MS), tuvastasime selles koes ekdüsooni (E) ja 20E, mis kinnitas varasemat tulemust. Proovis domineerisid aga oksüdeeritud fosforüülitud steroidid, mis vastavad valemile 3-dehüdro-20E-22-fosfaat (3D20E22P)12 (joonis 1). Teiste vormide hulka kuuluvad 3-dehüdro-20E (3D20E) ja 20E-22-fosfaat (20E22P). 3D20E22P HPLC-MS/MS signaali intensiivsus oli kaks suurusjärku kõrgem kui selle defosforüülitud vormil 3D20E ja kolm suurusjärku kõrgem kui E ja 20E oma (joonis 1). Kuigi ka teistes kehaosades ja alumistes suguelundites (LRT; laiendatud andmed, joonis 1),... 1a). Analüüsisime ka ekdüsteroide äsja sulgunud (<1 päeva vanustel) isastel ja emastel ning tuvastasime 3D20E ja 3D20E22P ainult MAG-is; E, 20E ja 20E22P esinesid mõlemas soos (laiendatud andmed, joonis 1b). Need andmed viitavad sellele, et A. gambiae täiskasvanud isased toodavad oma MAG-ides kõrge tiitriga modifitseerivaid hormoone, mida emased ei sünteesi.
MAG ja emaste LRT (sh atria, seemnepõiekesed ja parovarium) dissekteeriti 4-päevastelt (4-päevastel) neitsilikelt isastelt ja neitsilikelt ning paaritunud emastelt (0,5, 3 ja 12 hpm). Nendes kudedes sisalduvat ekdüsooni analüüsiti HPLC-MS/MS abil (keskmine ± standardviga; paaritu t-test, kahepoolne, vale avastamise määr (FDR) korrigeeritud; NS, mitteoluline; *P < 0,05, **P < 0,01. 3D20E: 3 tundi vs 0,5 tundi, P = 0,035; 12 tundi vs 3 tundi, P = 0,0015; 12 tundi vs 0,5 tundi, P = 0,030. 3D20E22P: 3 tundi vs 0,5 tundi, P = 0,25; 12 tundi vs 3 tundi, P = 0,0032; 12 tundi vs 0,5 tundi, P = 0,015). Andmed pärinevad kolmest bioloogilisest kordusest. Iga huvipakkuva ekdüsooni piigi pindala arvutati ja normaliseeriti sääskede arvuga. Ekdüsooni esindab värv järgmiselt: E, roheline; 20E, oranž; 20E22P, lilla; 3D20E, sinine; 3D20E22P, roosa. Sisestus suurendab y-telje skaalat, et näidata madalamaid ekdüsooni tasemeid.
Et uurida, kas 3D20E22P ja 3D20E kanduvad paaritumise ajal üle, dissekteerisime emaste kõrgete tõendite (LRT) proove erinevatel ajahetkedel pärast paaritumist. Kuigi neitsites ekdüsooni ei leitud, täheldasime LRT-s märkimisväärses koguses 3D20E22P-d kohe pärast paaritumist (0,5 tundi pärast paaritumist, hpm), mis aja jooksul vähenes, samal ajal kui 3D20E tase tõusis märkimisväärselt (joonis 1). Kasutades keemiliselt sünteesitud 3D20E-d standardina, leidsime, et selle steroidhormooni tase paarituvates LRT-des oli vähemalt 100 korda kõrgem kui 20E-l (laiendatud andmete tabel 1). Seega on 3D20E22P peamine isasloomade ekdüsoon, mis paaritumise ajal emasloomadele üle kandub, ja selle defosforüülitud vorm, 3D20E, muutub varsti pärast paaritumist väga rikkaks. See viitab viimase ekdüsooni olulisele rollile emaste paaritumisjärgses bioloogias.
Pärast uue RNA sekveneerimise (RNA-seq) andmekogumi (joonis 2a) genereerimist otsisime spetsiaalselt ehitatud bioinformaatika torujuhtme abil ekdüsooni kinaasi (EcK), ekdüsooni oksüdaasi (EO) ja 20E-modifitseeritud fosfataasi geeni kodeerivat ekdüsooni. EPP-d ekspresseeritakse reproduktiivkoes. Tuvastasime ühe EPP geeni kandidaadi ja kaks potentsiaalset EcK geeni (EcK1 ja EcK2), kuid ei suutnud leida head EO geeni kandidaati. Tähelepanuväärne on see, et üksikuid EPP geene ekspresseeriti kõrgel tasemel (98,9. protsentiil) Gambia MAG-ides, kuid mitte emastes LRT-des (joonis 2b), vastupidiselt meie ootustele, kuna 3D20E22P defosforüülimine toimus selles emaslooma koes. Seetõttu usume, et isaslooma EPP võib paaritumise ajal üle kanduda. Tõepoolest, kasutasime in vivo stabiilsete isotoopmärgistamist, et varjata emaslooma valku pärast paaritumist, ensüümi, mille MS tuvastas emaslooma aatriumis (joonis 2c ja lisatabel 1). EPP esinemine MAG-is ja Paaritatud (kuid mitte neitsi) emase LRT olemasolu kinnitati ka spetsiifiliste antikehade abil (joonis 2d).
a, Kohandatud bioinformaatika torujuhe EcK-sid, EO-sid ja EPP-sid kodeerivate geenide otsimiseks mõlema soo reproduktiivkudedest. Noolte kõrval olevad numbrid näitavad isaste ja emaste kandidaatide arvu igal etapil. See analüüs tuvastas ühe EPP geeni (EPP) ja ühe EcK geeni (EcK1), mida ekspresseeritakse isasloomadel, ning ühe EcK geeni (EcK2), mida ekspresseeritakse mõlemas sooloomas, kuid mis ei anna EO geeni kandidaati. b, Soojuskaart, mis võrdleb kandidaatgeeni ekspressiooni neitsilike (V) ja paarituvate (M) Anopheles gambiae ja Anopheles albicans kudedes. Spca, viljastumine; MAG-id, isasloomade abinäärmed; muud kehaosad, sealhulgas rinnad, tiivad, jalad, rasvkoed ja siseorganid mõlemast soost ning munasarjad emastel. EcK2 ekspresseerub Gambia puhul kõrgelt nii MAG-is kui ka kodades, samas kui EPP-d leidub ainult MAG-is. c, isaste ejakulaadirühma translokatsiooni proteoomiline analüüs emaste kodadesse 3, 12 ja 24 hpm juures, mis näitab 67 kõige rikkalikumat valku. Emased kasvatati dieedil, mis sisaldas 15N-i, et märgistada (ja maskeerida) kõiki valke. Märgistamata isased paaritati märgistatud emastega ja emased LRT-d dissekteeriti 3, 12 ja 24 hpm juures proteoomiliseks analüüsiks (vt lisa tabelit 1 ejakulatsioonivalkude täieliku loetelu kohta). Sissejuhatuses, EPP, Eck1 ja EcK2 tuvastati neitsilike isaste MAG-is nende kudede proteoomilise analüüsi abil. d, EPP tuvastati Western blot'i abil paaritatud emaste MAG-is ja LRT-s, kuid mitte neitsilikel emastel ega isastel ega ülejäänud emase kehas. Membraanid olid samaaegselt sondeeriti anti-aktiini (laadimiskontroll) ja anti-EPP antikehadega. Kõik mehed on neitsid. Geeli allikaandmete kohta vaata lisajoonist 1. Western blotid viidi läbi kaks korda sarnaste tulemustega.
EPP ekdüsteroidfosfofosfataasi aktiivsust kontrolliti pärast inkubeerimist HPLC-MS/MS abil MAG-ist eraldatud 3D20E22P-ga (laiendatud andmed, joonis 2a). Lisaks, kui me vaigistasime EPP RNA-vahendatud interferentsi (RNAi) abil, tuvastasime nende isaste reproduktiivkudedes fosfataasi aktiivsuse tugeva vähenemise (joonis 3a) ja EPP-vaigistatud isastega paaritatud emastel täheldati defosforüülitud 3D20E olulist madalamat osakaalu (joonis 3b) vaatamata osalisele geeni vaigistamisele (laiendatud andmed, joonis 2b, c). Seevastu me ei tuvastanud samadel sääskedel olulisi muutusi 20E22P/20E suhtes, mis võib viidata sellele, et ensüüm on spetsiifiline 3D20E suhtes (joonis 3b).
a, MAG-i fosfataasi aktiivsuse vähenemine, mis on põhjustatud EPP vaigistamisest, kasutades kaheahelalist EPP RNA-d (dsEPP) või kaheahelalist GFP RNA-d (dsGFP). Igas replikaadis kasutati 20 MAG-i kogumit (P = 0,0046, paaris-t-test, kahepoolne), mida tähistavad eraldi punktid. b, EPP-vaigistatud isastega paaritatud emastel oli defosforüülitud 3D20E osakaal oluliselt väiksem 3 hpm juures (P = 0,0043, paarimata t-test, kahepoolne), samas kui 20E tasemed ei muutunud (P = 0,063, paarimata). t-test, kahepoolne). Andmed on esitatud keskmisena ± standardvea kolme 13, 16 ja 19 emase grupi kohta.c, EPP-vaigistatud isastega paaritatud emastel oli oluliselt kõrgem uuestipaaritumise määr (P = 0,0002, Fisheri täpne test, kahepoolne). Emased sunniti esmalt paarituma, et tagada nende paaritumisstaatus; 2 päeva hiljem viidi nad kontakti teiste transgeenset spermat kandvate isastega, et hinnata uuesti paaritumise määra transgeeni kvantitatiivse PCR-detektsiooni abil.d, Verega toidetud emastel, kes paaritusid EPP-vaigistatud isastega, oli oluliselt vähenenud viljakus (P < 0,0001; Mann-Whitney test, kahepoolne) ja veidi vähenenud munade arv (P = 0,088, Mann-Whitney test, kahepoolne), samas kui kudemismäära see ei mõjutanud (P = 0,94, Fisheri täpne test, kahepoolne). Kõigis paneelides tähistab n bioloogiliselt sõltumatute sääskede proovide arvu.NS, mitteoluline.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Järgmisena hindasime, kas ekdüsooni defosforüülimine on oluline emasloomade paaritumisresistentsuse esilekutsumiseks. Märkimisväärselt paaritusid emasloomad EPP-st ilma jäänud isasloomadega palju sagedamini (44,9%) kui kontrollrühma emasloomad (10,4%), kui nad puutusid kokku täiendavate (transgeensete) isasloomadega (joonis 3c). Samuti täheldasime olulist viljakuse langust (joonis 3d, vasakul) ja nende emasloomade munetud munade arvu väikest vähenemist (joonis 3d, keskel), samas kui emasloomade munetud munade protsent (teine ​​emasloomadel paaritumisega esile kutsutud reaktsioon) ei muutunud (joonis 3d, paremal). Arvestades EPP täheldatud spetsiifilisust 3D20E22P suhtes, viitavad need tulemused sellele, et paaritumise ajal üle kantud EPP poolt 3D20E aktiveerimine võib mängida olulist rolli emasloomade edasise paaritumise vastuvõtlikkuse väljalülitamisel, mis on varem omistatud 20E seksuaalsele ülekandele. Seega mõjutab see isasspetsiifiline hormoon tugevalt ka emasloomade viljakust.
Järgmisena võrdlesime 20E ja 3D20E aktiivsust süstimiskatsetes suguküpsetel neitsidel, kasutades keemiliselt sünteesitud 3D20E-d (joonis 4a–c) ja kaubanduslikult saadaval olevat 20E-d. Täheldasime, et 3D20E oli mõlema kontsentratsiooni juures emaste paaritumistundlikkuse väljalülitamisel oluliselt efektiivsem kui 20E (joonis 4d). Märkimisväärne oli see, et pool 3D20E füsioloogilisest tasemest alumises sooles (1066 pg pärast süstimist vs 2022 pg pärast paaritumist) kutsus esile ravile allumatute emaste osakaalu, mis oli 20 korda kõrgem kui 20E füsioloogiline tase (361 pg pärast süstimist) 24 tundi pärast süstimist kõrgeima kontsentratsiooni (18 pg pärast paaritumist) juures; Laiendatud andmete tabel 1). See tulemus on kooskõlas arusaamaga, et 20E suguline ülekandumine ei põhjusta paaritumise refraktaarseid perioode, ning viitab lisaks 3D20E-le kui peamisele tegurile vanema-lapse suhte tagamisel. 3D20E oli ka neitsi emaste munade munemise testides oluliselt aktiivsem kui 20E (joonis 4e), mis viitab sellele, et normaalne munade munemise kiirus, mida me pärast osalist EPP vaigistamist täheldasime, oli tingitud paaritumisest tingitud emaste faktorite poolt endiselt tekitatud 3D20E jääkaktiivsusest.
(a, b) 3D20E, mis on keemiliselt sünteesitud 20E-st (a) väga kõrge konversiooni/efektiivsusega (andmed on esitatud kolme sõltumatu sünteesireaktsiooni keskmisena ± standardviga) (b).c, Massispekter (alumine pool) vastab täpselt paaritunud emasloomade LRT-s leitud ekdüsoonile (ülemine pool).d, Võrreldes 20E-ga (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; Fisheri täpne test, kahepoolne) ja 10% etanooliga (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; Fisheri täpne test, kahepoolne), samas kui 20E oli kontrollrühmast oluliselt kõrgem ainult suuremate annuste korral (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; Fisheri täpne test, kahepoolne).e, 3D20E süstimine indutseeris oluliselt kõrgem kudemismäär neitslastel kui 10% etanooli kontrollrühmas (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; Fisheri täpne test, kahepoolne), samas kui 20E võrreldes kontrollrühmaga ainult suuremate annuste korral (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; Fisheri täpne test, kahepoolne). 3D20E indutseeris oluliselt kõrgema kudemismäära kui 20E suuremate annuste korral (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; Fisheri täpne test, kahepoolne). Kõigil paneelidel tähistab n bioloogiliselt sõltumatute sääskede proovide arvu. NS, mitteoluline. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Andmed pärinevad kolmest kordused.
Varasemates uuringutes tegime kindlaks, et steroidhormoonide suguline ülekanne kutsub esile MISO (paaritusest indutseeritud oogeneesi stimulaator 11) ekspressiooni. See geen kaitseb A. gambiae emaseid P. falciparum'i nakkuse eest. Tervisekulud, mida põhjustab 13, surmavaim inimese malaariaparasiit. Arvestades MISO olulisust Anopheles'e paljunemisvõimele malaaria endeemilistes piirkondades, otsustasime kindlaks teha, milline hormoon – 3D20E või 20E – selle geeni ekspressiooni käivitab. Leidsime, et kuigi 20E süstimine indutseeris spetsiifiliselt või tugevamalt mõningaid tuumahormoonide retseptoreid (HR), näiteks HR3 ja HR4, ning tüüpilisi allavoolu steroidide sihtmärke, näiteks yologeneetilisi geene Vg14, 15, 16, indutseeris MISO-d tugevamalt 3D20E (laiendatud andmed, joonis 3). Seega näib selle androgeense steroidhormooni suguline ülekanne indutseerivat mehhanisme, mis kaitsevad emaseid parasiitnakkuse põhjustatud kulude eest. Lisaks mõjutab 3D20E erinevalt mõlemat isovormi. E-retseptor EcR, indutseerides EcR-A ja pärssides EcR-B ning käivitades tugevamalt teisi paaritumist indutseerivaid geene, sealhulgas HPX15, mis mõjutab emaste viljakust. See võib selgitada märkimisväärset viljatust, mida on täheldatud emastel, kes on paaritatud EPP-vaigistatud isastega (laiendatud andmed, joonis 3). Need andmed viitavad kahe ekdüsoonihormooni poolt eelistatavalt aktiveeritud allavoolu radade olemasolule, mis võivad olla soospetsiifilise funktsiooni aluseks.
Järgmisena testisime meie bioinformaatika töövoos tuvastatud kahe EcK geeni funktsiooni. EcK1 või EcK2 vaigistamine põhjustas isasloomade märkimisväärse suremuse (laiendatud andmed, joonis 4a), mis viitab sellele, et ekdüsooni fosforüülimine ja seega inaktiveerimine on ellujäämise seisukohalt oluline. Kuna EcK2 ekspresseeriti kõrgemal tasemel kui EcK1 ja seda tuvastati MAG-ides proteoomika abil (joonis 2b, c ja lisatabel 2), valideerisime selle ekdüsteroidkinaasi aktiivsust, inkubeerides seda 20E-ga, mille tulemuseks oli 20E22P fosforüülimine (laiendatud andmed, joonis 2).4b). 3D20E kasutamisel substraadina ei õnnestunud meil tuvastada fosforüülitud produkti 3D20E22P (laiendatud andmed, joonis 4c), mis viitab sellele, et 20E, mitte 3D20E, võib olla EcK2 eelistatud sihtmärk.
Meie RNA-seq analüüsi kohaselt oli EcK2 kõrgelt ekspresseeritud ka neitsi emaste alumises retsidiivis (LRT), kus see pärast paaritumist välja lülitati (joonis 2b). Me kinnitasime neid andmeid ja leidsime, et verega toitmine ei mõjutanud EcK2 ekspressiooni (laiendatud andmed, joonis 5a). Laiendades oma esialgseid MS-katseid, leidsime, et 20E22P piik oli tihedalt seotud 20E piigiga (22–26 tundi pärast verega toitmist; laiendatud andmed, joonis 5b). EcK2 vaigistamine neitsi emastel tõi kaasa 20E ja 20E22P suhtelise suhte 3-kordse suurenemise 26 tundi pärast verega toitmist (laiendatud andmed, joonised 2c ja 5c), mis kinnitab, et EcK2 fosforüülib 20E ka emastel. Tähelepanuväärne on see, et EcK2-st tühjenenud neitsid säilitasid täieliku seksuaalse vastuvõtlikkuse (laiendatud andmed, joonis 5d, e), mis viitab veelgi sellele, et emaste 20E tootmine ei indutseeri paaritumise refraktaarseid perioode. Nendel emastel oli aga oluliselt suurenenud munade munemise määr võrreldes kontrollrühmaga, kusjuures üle 30% neitsidest munesid (laiendatud andmed, joonis 5f). Kui kaheahelalise Eck2 RNA (dsEcK2) süstid tehti pärast verega toitmist, siis kudemist ei toimunud, milleks ajaks oli vere sissevõtmisest tingitud 20E piik langenud. Üldiselt toetavad need tulemused mudelit, et pärast vere imemist toodetud 20E võib esile kutsuda kudemise, kuid ainult siis, kui kudemise blokeerimine (EcK2 ja võimalik, et ka muud tegurid) paaritumisega välja lülitatakse. Ei 20E ega 3D20E süstid ei inhibeerinud EcK2 ekspressiooni neitsidel (laiendatud andmed, joonis 5g), mis viitab sellele, et selle kinaasi inhibeerimist vahendavad muud tegurid. Siiski ei olnud 20E tase pärast verega toitmist piisav paaritumismure tekitamiseks, vaid seda vallandasid tõhusalt sugulisel teel ülekantud 3D20E kõrged tiitrid.
Meie tulemused annavad olulist teavet A. gambiae reproduktiivse edu reguleerivate mehhanismide kohta. On tekkinud mudel, kus isased on arenenud sünteesima kõrgeid tiitreid 3D20E-d, isastele spetsiifilist modifitseeritud ekdüsooni, mis tagab suguluse, muutes emased edasiseks paaritumiseks tundlikuks. Samal ajal on need malaariavektorid arendanud ka tõhusa süsteemi 3D20E aktiveerimiseks emastel vastusena isastele spetsiifilise EPP seksuaalsele ülekandele. Meie teada on see esimene näide isas- ja emasloomade domineerivast steroidhormoonide süsteemist, mis täidab putukates ainulaadset ja kriitilist funktsiooni. Isastele spetsiifilise ekdüsooni funktsiooni on oletatud, kuid seda pole lõplikult tõestatud. Näiteks on suures osas ümber lükatud hüpotees18, et neid funktsioone võib täita 20E eelkäija E1. On hästi teada, et Drosophilas käivitab monandria väikeste sugupeptiidide19,20 seksuaalse ülekande teel, mis interakteeruvad emasloomade reproduktiivtrakti innerveerivate neuronitega spetsiifiliste sugupeptiidi retseptorite21,22 kaudu. Edasine töö on vajalik, et määrata kindlaks allavoolu signaaliülekande kaskaadid, mida kontrollivad 3D20E A. gambiae emastel ja et teha kindlaks, kas neid kaskaade saab säilitada sääskede ja Drosophila vahel.
Arvestades meie uuringus tuvastatud 3D20E olulist rolli emaste viljakuses ja käitumises, pakuvad 3D20E sünteesi ja aktiveerimiseni viivad rajad uusi võimalusi tulevasteks sääskede tõrje strateegiateks, näiteks steriilsete putukate tehnoloogiastrateegiates konkureerivate steriilsete isaste genereerimiseks, mida kasutatakse loodusest vabastamiseks või 3D20E jäljendamiseks neitsimängudes. 3D20E isasspetsiifiline funktsioon võis areneda siis, kui A. gambiae ja teised Cellia liigid omandasid võime koaguleerida oma spermat paaritumiskorkideks, kuna see võimaldab suure hulga hormoonide ja hormoone aktiveerivate ensüümide tõhusat ülekandmist. Omakorda pakub monandriat rakendav 3D20E evolutsioon emastele mehhanismi (MISO kõrge ekspressiooni kaudu), et soodustada nende reproduktiivset sobivust kõrge malaaria levimusega piirkondades, mis kaudselt aitab kaasa Plasmodiumi ülekandele. Arvestades, et emastel 20E-l on näidatud olevat sügav mõju P. falciparumi ellujäämisele ja kasvule emastel Anopheles sääskedel,24 on nii isas- kui ka emassteroidhormoonide rajad nüüd sääskede ja parasiitide vastastikmõjude võtmeaspektid.
A. gambiae G3 tüvesid kasvatati putukate standardsetes tingimustes (26–28 °C, 65–80% suhteline õhuniiskus, 12–12 tundi valguse/pimeduse fotoperioodi). Vastseid toideti pulbrilise kalatoiduga (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets ja Tetra Pond Sticks vahekorras 7:7:2). Täiskasvanud sääskedele toideti ad libitum 10% dekstroosilahust ja iganädalaselt inimverd (uuritavad verekomponendid). Neitsisääsed saadi sugude eraldamise teel nukustaadiumis pärast otste mikroskoopilist uurimist. DsRed transgeeni kandvaid isaseid on varem kirjeldatud.
Sundpaaritumise katsed viidi läbi vastavalt eelnevalt kirjeldatud protokollidele. Loodusliku paaritumise jaoks hoiti 4-päevaseid neitsilikke emaseid kaks ööd suhtega 1:3 suguküpsete neitsilike isastega. Katsetes, kus isastele süstiti dsEPP-d, langes ühispuurimine kokku 3.-4. päevaga pärast süstimist, mil fosfataasi aktiivsus oli maksimaalselt vaigistatud (laiendatud andmed, joonis 2b).
Sääsekoed, ülejäänud laibad (ülejäänud keha) või kogu keha dissekteeriti 100% metanooli ja homogeniseeriti graderiga (2 mm klaashelmed, 2400 p/min, 90 sekundit). Koekogused ja metanooli mahud olid järgmised: ülejäänud keha, 50 µl 1000 µl-s; MAG, 50–100 µl 80 µl; emane LRT, 25–50 µl 80 µl. Sade ekstraheeriti metanooliga teist korda sama mahuga metanooliga. Rakujäägid eemaldati tsentrifuugimise teel. Mõlema ekstraktsiooni metanool ühendati ja kuivatati lämmastikuvoolus, seejärel suspendeeriti uuesti järgmistes mahtudes 80% metanooli vees: ülejäänud keha, 50 µl; MAGid ja emane LRT, 30 µl.
Proove analüüsiti massispektromeetril (ID-X, Thermo Fisher), mis oli ühendatud LC-instrumendiga (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl proovi süstiti 3 µm, 100 × 4,6 mm kolonni (Inspire C8, Dikma), mida hoiti temperatuuril 25 °C. LC mobiilsed faasid olid A (vesi, 0,1% sipelghape) ja B (atsetonitriil, 0,1% sipelghape). LC gradient oli järgmine: 5% B 1 minut, seejärel suurendati 11 minuti jooksul 100% B-ni. Pärast 8 minutit 100% juures tasakaalustati kolonn uuesti 5% B juures 4 minutit. Voolukiirus oli 0,3 ml min-1. Ionisatsioon MS-allikas saavutatakse kuumutatud elektropihustus-ionisatsiooniga positiivses ja negatiivses režiimis.
Massispektromeeter mõõdab andmeid m/z vahemikus 350 kuni 680 resolutsiooniga 60 000 täis-MS režiimis. MS/MS andmed saadi [M + H]+ (kõik sihtmärgid), [M - H2O + H]+ (kõik sihtmärgid) ja [M - H]- (fosforüülitud sihtmärgid) kohta. MS/MS andmeid kasutati sihtmärkide ekdüsooni omaduste kinnitamiseks, mille jaoks standard puudus. Mittesihtmärgiks olevate ekdüsteroidide tuvastamiseks analüüsiti MS/MS andmeid kõigi HPLC piikide kohta, mille suhteline küllus oli >15%. Kvantifitseerige, kasutades puhastest standarditest (20E, 3D20E) loodud standardkõveraid, et arvutada ühe konkreetse proovi (kõik teised sihtmärgid) absoluutsed kogused või lahjendused, et arvutada nende ekvivalentsus ühel isasloomal leitud kogustega. 3D20E puhul viidi kvantifitseerimine läbi järgmiste aduktide summa abil: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Andmed ekstraheeriti ja kvantifitseeriti Tracefinderi abil (versioon 4.1). MS/MS andmeid analüüsiti Xcaliburi abil (versioon 4.4). E, 20E ja 3D20E MS-spektreid võrreldi vastavate standarditega. 3D20E22P analüüsiti derivatiseerimise teel Girardi reagendiga. 20E22P analüüsiti m/z suhte abil.
3D20E22P puhastati MAG-ist. Puhastamine viidi läbi analüütilises skaalas, kasutades ülijõudlusega vedelikkromatograafi (Acquity, Waters) kvadrupoolmassipõhise detektoriga (QDa, Acquity, Waters) samades LC tingimustes nagu HPLC-MS/MS analüüsi puhul. Fraktsioonide kogumine käivitati, kui 3D20E22P-le vastav m/z tuvastati sama retentsiooniaja juures, mis eelnevalt määrati. Ekstraheeritud ühendite puhtust kontrolliti seejärel HPLC-MS/MS abil, nagu eespool kirjeldatud.
Totaalne RNA ekstraheeriti 10–12 reproduktiivkoest või muust kehaosast (peata), kasutades TRI reagendi (Thermo Fisher), järgides tootja juhiseid. RNA-d töödeldi TURBO DNase'iga (Thermo Fisher). cDNA sünteesiti Moloney hiire leukeemiaviiruse pöördtranskriptaasi (M-MLV RT; Thermo Fisher) abil, järgides tootja juhiseid. Pöördtranskriptsiooni kvantitatiivse PCR-i (RT-qPCR; laiendatud andmete tabel 2) praimerid on varem avaldatud24 või disainitud Primer-BLAST26 abil, eelistades 70–150 bp suuruseid tooteid, mis hõlmavad ekson-ekson ühendusi või praimeripaaride praimereid, mis eraldavad eksoneid. Kolmest kuni neljast bioloogilisest replikaadist pärinevad cDNA proovid lahjendati RT-qPCR jaoks neljakordselt veega. Kvantifitseerimine viidi läbi 15 µl replikaatreaktsioonides, mis sisaldasid 1× PowerUp SYBR Green Master Mixi (Thermo Fisher), praimereid ja 5 µl lahjendatud cDNA-d. Reaktsioonid viidi läbi QuantStudio 6 Pro reaalajas PCR-süsteemil (Thermo Fisher) ja andmed koguti ning analüüsiti Design and Analysis (versioon 2.4.3) abil. Nagu selles uuringus näidatud, normaliseeriti suhtelised kogused ribosomaalse geeni RpL19 (AGAP004422) suhtes, mille ekspressioon ei muutunud oluliselt verega toitmise27 ega paaritumise3 korral.
RNA kvaliteeti kontrolliti Agilent Bioanalyzer 2100 bioanalüsaatori (Agilent) abil. Illumina paarisotsa teegid valmistati ette ja käivitati MIT-i ja Harvardi Broad Institute'is. Sekveneerimistulemused joondati A. gambiae genoomiga (PEST tüvi, versioon 4.12), kasutades HISAT2 (versioon 2.0.5) vaikesätetega. Lugemised, mille kaardistamise kvaliteedi (MAPQ) skoor oli alla 30, eemaldati Samtoolsi (versioon 1.3.1) abil. Geenidele kaardistatud lugemiste arv loendati htseq-counti (versioon 0.9.1) abil vaikesätetega. Normaliseeritud lugemiste arv arvutati ja diferentsiaalset geeniekspressiooni analüüsiti DESeq2 paketi (versioon 1.28.1) abil R-is (versioon 4.0.3).
Ekdüsooni modifitseerivate geenikandidaatide identifitseerimiseks otsiti esmalt A. gambiae genoomi PSI-BLAST algoritmi abil (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), kasutades vaikeväärtuste parameetreid järgmiste päringuvalgu järjestustega: Bombyx mori'lt (liitumisnumber NP_001038956.1), Musca domestica'lt (liitumisnumbrid XP_005182020.1, XP_005175332.1 ja XP_011294434.1) ja Microplitis demolitor'lt (liitumisnumbrid XP_008552646.1 ja XP_008552645.1); EcK B. mori'lt (liitumisnumber NP_001036900), Drosophila melanogaster'ilt (liitumisnumber NP_651202), Apis mellifera'lt (liitumisnumber XP_394838) ja Acyrthosiphon pisum (liitumisnumber XP_001947166); ning EPP B. mori'st (liitumisnumber XP_001947166) NP_001177919.1 ja NP_001243996.1) ja EO D. melanogaster'ist (liitumisnumber NP_572986.1) (1. samm). Järgmisena filtreeritakse tabamused Gambias reproduktiivkoes (emase LRT või MAG) kõrge mRNA ekspressiooni (>100 fragmenti/kilobaas-eksoni miljoni kaardistatud lugemise (FPKM) kohta või >85%) põhjal (2. samm). Spetsiifilisuse parandamiseks valisime kandidaatensüümid, mida ekspresseeritakse ka A. albimanuse reproduktiivkoes. See liik on anopheles ja ei sünteesi ega kanna ekdüsooni paaritumise ajal üle. Kandidaatgeenid filtreeriti madala ekspressiooni (<100 FPKM või <85. protsentiil) alusel A. albimanuse reproduktiivkoes (3. samm). Viimase filtrina (4. samm) peavad kandidaatgeenid vastama vähemalt ühele järgmistest tingimustest: (1) diferentsiaalselt ekspresseeritud geenide analüüsi kohaselt pärast paaritumist oluliselt ülesreguleeritud (P < 0,05) ja (2) mittereproduktiivkoes (< 85% või <100 FPKM).
Varem kirjeldatud meetodeid 28, 29, 30 modifitseerisime, et saavutada kogu organismi isotoopmärgistamine. Lühidalt, metsiktüüpi Saccharomyces cerevisiae tüüp II (YSC2, Sigma) testiti pärmi lämmastikaluses (BD Difco, DF0335), mis sisaldas (massiprotsent/mahtprotsent) 2% glükoosi (G7528, Sigma), 1,7% aminohappevaba ja ammooniumsulfaati. Ainsa lämmastikuallikana kasutati pärmi tsentrifuugimise teel ja sääsevastseid toideti ad libitum kuni nukkumiseni. Neljanda staadiumi suremuse vältimiseks lisati kalajahu (0,5 mg 300 vastse kohta). Seejärel kasutati paaritumiskatsetes ainult emaseid, märgistamata isastega analüüsiti paaritumise ajal üle kantud isasproteoomi.
4–6 päeva vanused 15N-märgistatud neitsid emased sunniti paarituma samaealiste märgistamata neitside isastega. Edukat paaritumist kontrolliti paaritumiskorkide tuvastamisega epifluorestsentsmikroskoopia abil. 3, 12 ja 24 hpm juures dissekteeriti 45–55 paaritunud emase kodad 50 µl ammooniumvesinikkarbonaatpuhvrisse (pH 7,8) ja homogeniseeriti nuiaga. Homogenaat tsentrifuugiti ja supernatant segati 50 µl 0,1% RapiGestiga (186001860, Waters) 50 mM ammooniumvesinikkarbonaadis. Iga proovi supernatant ja pellet külmutati kuivjääl ja saadeti üleöö Washingtoni ülikooli MacCossi laborisse, kus viidi lõpule proovi ettevalmistamine LC-MS/MS jaoks. Pellet resuspendeeriti 50 µl 0,1% RapiGestis 50 mM ammooniumvesinikkarbonaadis ja sonikeeriti veevannis. Pelleti ja supernatandi valgukontsentratsiooni mõõdeti BCA abil. Analüüsis redutseeriti proove 5 mM ditiotreitooliga (DTT; Sigma), alküüliti 15 mM jodoatseetamiidiga (Sigma) ja inkubeeriti 1 tund temperatuuril 37 °C (1:0 50) trüpsiinimise ja trüpsiini/substraadi suhtega). RapiGest lüüsiti 200 mM HCl lisamisega, millele järgnes inkubeerimine 45 minutit temperatuuril 37 °C ja tsentrifuugimine kiirusel 14 000 p/min 10 minutit temperatuuril 4 °C prahi eemaldamiseks. Proove pesti kaherežiimilise tahkefaasilise ekstraktsiooniga (Oasis MCX padrunid, Waters) ja resuspendeeriti 0,1% sipelghappes lõpliku valgu kontsentratsioonini 0,33 µg µl-1. Märgistamata MAG proteoome analüüsiti sarnaselt neitsilikelt isastelt. Iga proovi kohta analüüsiti kahte analüütilist kordust. Seejärel analüüsiti 1 µg igast proovist, kasutades 25 cm sulatatud silikageeliga 75 μm kolonni 4 cm sulatatud Jupiter C12 pöördfaasilise vaiguga (Phenomenex) täidetud ränidioksiidist Kasil1 (PQ) fritlõks ja 180-minutiline vedelikkromatograafia. Proovide digesteerimine – MS/MS viidi läbi Q-Exactive HF massispektromeetril (Thermo Fisher) koos nanoACQUITY UPLC süsteemiga (Waters). Iga tsükli jaoks genereeritud andmetega seotud kogumisandmed teisendati mzML-vormingusse, kasutades Proteowizardi (versioon 3.0.20287) ja Comet31 (versioon 3.2), võrreldes FASTA andmebaasiga, mis sisaldab Anopheles gambiae (VectorBase versioon 54), Anopheles coluzzi (Mali-NIH (VectorBase versioon 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, märts 2021), A. gambiae RNA-seq ja teadaolevate inimese saasteainete kolmekaadriliste translatsioonide valgujärjestusi. Peptiidikaardiga sobitatud FDR-id määrati Percolator32 (versioon 3.05) abil läviväärtusega 0,01 ja peptiidid pandi valkudeks, kasutades valguparsimooniat Limelight33-s (versioon 2.2.0). Valkude suhteline arvukus hinnati, kasutades normaliseeritud spektraalse arvukuse faktorit (NSAF), mis arvutati iga valgu jaoks igas tsüklis, nagu eelnevalt kirjeldatud. Iga valgu suhtes arvutatud NSAF keskmistati kahe erineva bioloogilise replikaadi proovide põhjal.15N märgistamine maskeeris edukalt emase proteoomi, kuigi märgistatud neitsidest võis tuvastada väikest kogust märgistamata valku. Isaste valkude redutseerimise (1-5 spektrit) tuvastamist emaste toorproovides registreerisime ainult tehnilistes tsüklites, kus toorproovid tsükliti pärast isaste/paarituvaid proove HPLC "ülekande" tulemusena. Märgistatud neitsidest juhuslikult "saasteainetena" leitud valgud on loetletud lisas tabelis 1.
Kaks antigeenset peptiidi, QTTDRVAPAPDQQQ (isotüübi PA piires) ja MESDGTTPSGDSEQ (isotüübi PA ja PB piires) Genscriptis. Kaks peptiidi ühendati, seejärel konjugeeriti kandjavalguga KLH ja süstiti Uus-Meremaa küülikutele. Küülikud hukati pärast neljandat süsti ja kogu IgG eraldati afiinsuspuhastamise teel. Kõige EPP-spetsiifilisema küüliku IgG-d kasutati edasiseks Western blot analüüsiks.
Western bloti analüüsideks lisati eraldi MAG (n = 10, kus n tähistab bioloogiliselt sõltumatute sääskede proovide arvu) ja emaste LRT (n = 30) 4-päevastelt neitsilikelt isastelt ja neitsilikelt või sunniviisiliselt paaritatud emastelt (<10 pärast paaritumist), valgu ekstraheerimispuhver (50 mM Tris, pH 8,0; 1% NP-40; 0,25% naatriumdeoksükolaat; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× proteaasi inhibiitorite kokteil (Roche)). Proovid homogeniseeriti kohe pärast dissekteerimist graderiga (2 mm klaashelmed, 2400 p/min, 90 sekundit). Lahustumatu praht eemaldati tsentrifuugimisega kiirusel 20 000 g temperatuuril 4 °C. Valgud kvantifitseeriti Bradfordi testiga (Bio-Rad). Seejärel denatureeriti 20 µg MAG valku, 40 µg LRT valku ja 20 µg jääkvalku ning eraldati 10% Bis-Tris'iga. NuPAGE, kasutades MOPS-puhvrit. Valgud kanti polüvinülideenfluoriidmembraanidele, kasutades iBlot2 ülekandesüsteemi (Thermo Fisher). Membraane pesti kaks korda 1× PBS-T-s (0,1% Tween-20 PBS-is) ja blokeeriti seejärel Odyssey blokeerimispuhvris (Li-Cor) 1 tund temperatuuril 22 °C. Membraane loksutati üleöö temperatuuril 4 °C kohandatud küüliku anti-EPP polüklonaalse primaarse antikehaga (1:700 blokeerimispuhvris) ja roti anti-aktiini monoklonaalse primaarse antikehaga MAC237 (Abeam; 1:4000). Membraane pesti PBS-T-ga ja inkubeeriti seejärel sekundaarsete antikehadega (eesli anti-küüliku 800CW ja kitse anti-roti 680LT (Li-Cor), mõlemad 1:20 000) blokeerimispuhvris, mis sisaldas 0,01% SDS-i ja 0,2% Tween-20, 1 tund temperatuuril 22 °C. Membraane pesti PBS-T-ga ja pildistati Odyssey CLx-ga. skanner. Pildid koguti ja töödeldi Image Studios (versioon 5.2). EPP-RA isovormile (82 kDa) vastavat spetsiifilist riba ei tuvastatud.
EPP (isovormina AGAP002463-RB, mis sisaldab histidiinfosfataasi domeeni, NCBI konserveerunud domeeni otsing 34) ja EcK2 (AGAP002181) kodeerivad piirkonnad klooniti pET-21a(+) plasmiidi (Novagen Millipore Sigma); praimerid on loetletud laiendatud andmete tabelis 2. Kaheksa GS4 linkerit (tandemina) sisestati enne pET-21a(+)-EcK2 konstrukti C-terminaalset 6xHis märgist. Rekombinantsed valgud valmistati NEBExpress rakuvaba E. coli valgusünteesi reaktsiooni abil (New England BioLabs). Rekombinantsed valgud puhastati NEBExpress Ni tsentrifuugkolonnide abil (New England BioLabs). Dihüdrofolaadi reduktaasi (DHFR) kontrollvalk valmistati NEBExpress rakuvaba E. coli valgusünteesi komplekti DNA matriitsi abil. Valke säilitati 50% glütseroolis PBS-is temperatuuril -20 °C kuni 3 kuud.
EPP ja koeekstraktide fosfataasi aktiivsust mõõdeti 4-nitrofenüülfosfaadi (pNPP; Sigma-Aldrich) abil. Reaktsioonipuhver sisaldas 25 mM Tris, 50 mM äädikhapet, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA ja 1 mM DTT. Koe homogeniseeriti reaktsioonipuhvris ja rakujäägid eemaldati tsentrifuugimise teel. Reaktsioon käivitati ensüümi või koeekstrakti lisamisega reaktsioonipuhvrisse, mis sisaldas 2,5 mg ml-1 pNPP-d. Reaktsioonisegu inkubeeriti toatemperatuuril pimedas ja pNPP-st muundatud pNP kogus kvantifitseeriti, mõõtes neeldumist 405 nm juures erinevatel aegadel.
In vitro EcK aktiivsuse määramiseks inkubeeriti valku 0,2 mg 20E või 3D20E-ga 200 µl puhvris (pH 7,5), mis sisaldas 10 mM HEPES-NaOH, 0,1% BSA-d, 2 mM ATP-d ja 10 mM MgCl2, 2 tundi temperatuuril 27 °C. Reaktsioon peatati 800 µl metanooli lisamisega, seejärel jahutati temperatuuril -20 °C 1 tund ja tsentrifuugiti seejärel kiirusel 20 000 g 10 minutit temperatuuril 4 °C. Seejärel analüüsiti supernatanti HPLC-MS/MS abil. Kontrollrühmas kasutatud valkude inaktiveerimiseks kuumutati neid 50% glütseroolis PBS-is 20 minutit temperatuuril 95 °C.
In vitro EPP aktiivsuse määramiseks inkubeeriti valku 3D20E22P-ga (võrdväärne 18 MAG-paaris leiduva kogusega, puhastatud HPLC-MS/MS abil) 100 µl puhvris (pH 7,5), mis sisaldas 25 mM Tris-i, 50 mM äädikhapet, 25 mM Bis-Tris-i, 150 mM NaCl-i, 0,1 mM EDTA-d ja 1 mM DTT-d, 3 tundi temperatuuril 27 °C. Reaktsioon peatati 400 µl metanooli lisamisega ja jahutati temperatuuril -20 °C 1 tund, seejärel tsentrifuugiti 20 000 g juures 10 minutit temperatuuril 4 °C. Supernatanti analüüsiti HPLC-MS/MS abil.
EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) ja EcK2 (556 bp) PCR fragmendid amplifitseeriti segasooliste peata sääskede korjustelt valmistatud cDNA-st. eGFP kontrollproovi PCR fragment (495 bp) amplifitseeriti eelnevalt kirjeldatud pCR2.1-eGFP-st; PCR praimerid on loetletud laiendatud andmete tabelis 2. PCR fragment sisestati pL4440 plasmiidi inverteeritud T7 promootorite vahele. Plasmiidi konstruktid saadi NEB 5-α kompetentsest E. colist (New England Biolabs) ja kontrolliti enne kasutamist DNA sekveneerimisega (inserdi järjestuse kohta vt lisaandmeid 1). pL4440-põhise plasmiidi inserdi amplifitseerimiseks kasutati T7 promootoriga sobitatud praimereid (laiendatud andmete tabel 2). PCR produkti suurust kinnitati agaroosgeelelektroforeesiga. dsRNA transkribeeriti PCR mallidelt, kasutades Megascript T7 transkriptsioonikomplekti (Thermo Fisher) ja puhastati vastavalt tootja juhistele, kasutades eelnevalt kirjeldatud modifikatsioone.
dsRNA süstimiseks süstiti täiskasvanud isas- või emaslooma rindkeresse (Nanoject III, Drummond) 1380 ng dsRNA-d (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) kontsentratsioonis 10 ng nl-1 1 päeva jooksul pärast eklosiooni. Geeni vaigistamise tasemed määrati vähemalt kolmes bioloogilises replikaadis RNA ekstraheerimise, cDNA sünteesi ja RT-qPCR abil. Ekdüsooni süstimiseks süstiti 4-päevastele või 6-päevastele verega toidetud neitsi-emasloomadele 0,13, 0,21 või 0,63 µg 20E või 3D20E (Nanoject III, Drummond) kontsentratsioonides vastavalt 1,3 ja 2,1, olenevalt katse ülesehitusest, või 6,3 ng nl-1. Süstiti 100 nl 10% (vol/vol) etanooli vees; 100 nl 3D20E22P 10% etanoolis (mis vastab 75%-le MAG-ide paaris leiduvast kogusest). Süstimisgruppi määrati juhuslikult sääsed.
Kudemiskatseteks toideti 3-päevaseid emasloomi inimverega ad libitum. Eemaldati osaliselt toidetud või toitmata sääsed. Sõltuvalt töötlemisest pandi emasloomad neljaks ööks eraldi kudemistopsidesse vähemalt 48 tundi pärast verejahu söötmist. Munad loendati stereoskoobi (Stemi 508, Zeiss) all; paaritunud emasloomade puhul loeti viljakaks vastseteks koorunud munad.
Paaritumiskatseteks lasti emastel olenevalt ravist vähemalt 2 päeva paaritumisresistentsuse tekkeks ning seejärel viidi samasse puuri metsiktüüpi vanuselt sobitatud isased. Kaks ööd hiljem dissekteeriti emased viljastatud vesiikulid ja genoomne DNA vabastati külmutamise-sulatamise ja ultraheliga töötlemise teel puhvris, mis sisaldas 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA ja 25 mM NaCl (pH 8,2). Proove inkubeeriti proteinaas K-ga (0,86 µg µl-1) 15 minutit temperatuuril 55 °C ja seejärel 10 minutit temperatuuril 95 °C. Toorgenoomse DNA preparaate lahjendati 10-kordselt ja Y-kromosoomi järjestuste tuvastamiseks kasutati qPCR-i; praimerid on loetletud laiendatud andmete tabelis 2. Y-kromosoomi järjestuse puudumine näitab paaritumise puudumist.
Uuesti paaritumise testide jaoks uuriti sunniviisiliselt paaritatud emaseid paaritumiskorkide olemasolu suhtes, et kinnitada paaritumisstaatust, ja lasti 2 päeva jooksul arendada välja refraktaarsus isaste puudumisel paaritumisele, nagu eelnevalt kirjeldatud36. Seejärel viidi DsRed transgeenset spermat kandvad isased emasloomade puuridesse. Kaks ööd hiljem eraldati emastelt viljastavad vesiikulid ja genoomne DNA valmistati eespool kirjeldatud viisil ning allutati DsRed transgeeni qPCR-detektsioonile; praimerid on loetletud laiendatud andmete tabelis 2. DsRed transgeeni puudumine näitas, et uuesti paaritumist ei toimunud.
3D20E sünteesiti nagu eelnevalt kirjeldatud37. Lühidalt, 10 mg 20E-d (Sigma-Aldrich) lahustati 10 ml vees, millele järgnes 30 mg plaatina musta (pulbri kujul, Sigma-Aldrich). Reaktsioonisegusse juhiti pidevalt õrna O2 voolu, mida segati toatemperatuuril. 6 tunni pärast lisati reaktsiooni peatamiseks 30 ml metanooli. Segu tsentrifuugiti katalüsaatori osakeste eemaldamiseks. Supernatant aurustati toatemperatuuril vaakumis kuivaks. Kuivatatud reaktsioonisaadus lahustati 10% etanoolis ja metanoolis HPLC-MS/MS analüüsi jaoks süstimiseks. Konversioonimäär (20E-st 3D20E-ks) oli ligikaudu 97% (joonis 4b) ja sünteesitud 3D20E MS-spekter vastas paaritunud emastel leiduvale (joonis 4c).
Legend sisaldab üksikasjalikku teavet tehtud statistiliste testide kohta. Fisheri täpse testi, Mantel-Coxi testi ja Studendi t-testi tegemiseks kasutati GraphPadi (versioon 9.0). Cochran-Mantel-Haenszeli testid viidi läbi kohandatud R-skripti abil (saadaval aadressil https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Andmejaotuse normaalsust testiti Shapiro-Wilki testiga, mille olulisuse lävi oli 0,05. Kui andmed normaalsuse testi ei läbinud, tehti Mann-Whitney test. Ellujäämisandmeid analüüsiti Mantel-Coxi testi abil. RNA-seq geenitaseme diferentsiaalse ekspressiooni analüüsi tegemiseks kasutati DESeq2 paketti (versioon 1.28.1). Graafiku horisontaalne riba tähistab mediaani. Kõigi testide lävendina kasutati olulisuse väärtust P = 0,05.
Lisateavet uuringu ülesehituse kohta leiate selle artikliga lingitud loodusuuringute aruande kokkuvõttest.
MS proteoomilised andmed deponeeriti ProteomeXchange konsortsiumisse (//proteomecentral.proteomexchange.org) PRIDE partnerihoidla (//www.ebi.ac.uk/pride/) kaudu andmestiku identifikaatoriga PXD032157.
RNA-seq andmestik on deponeeritud Gene Expression Comprehensive Library'sse (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) seerianumbri GSE198665 all.
Käesoleva uuringu käigus genereeritud ja/või analüüsitud täiendavaid andmekogumeid saab mõistliku taotluse korral vastavatelt autoritelt. Käesolev artikkel esitab allikandmed.
De Loof, A. Ekdüsteroidid: tähelepanuta jäetud putukate sugusteroidid? Mees: Black Box. Insect Science. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hüdroksüekdüsoon ja munasarjade areng Anopheles stephensil. J. Insect Physiology. 28, 97–109 (1982).