Javascript on teie brauseris hetkel keelatud. Mõned selle veebisaidi funktsioonid ei tööta, kui JavaScript on keelatud.
Registreeru oma täpsete andmete ja sind huvitava ravimiga ning me sobitame sinu esitatud teabe meie ulatuslikus andmebaasis olevate artiklitega ja saadame sulle kohe PDF-koopia e-postiga.
Ban-Lan-Gen graanulid nõrgendavad hiirtel dekstraannaatriumsulfaadist põhjustatud kroonilist retsidiivset koliiti, moduleerides soolestiku mikrobiootat ja taastades soolestiku SCFA deriveeritud GLP-1 tootmise
Jiao Peng,1-3,*Li Xi,4,*Zheng Lin,3,5 Duan Lifang,1 Gao Zhengxian,2,5 Diehu,1 Li Jie,6 Li Xiaofeng,6 Shen Xiangchun,5 Xiao Haitao21Pekingi Ülikooli Shenzheni Haigla Farmaatsiaosakond, Shenzhen, Hiina Rahvavabariik; 2Shenzheni Ülikooli Terviseteaduste Keskuse Farmaatsiakool, Shenzhen, Hiina Rahvavabariik; 3Guizhou Meditsiiniülikooli Etnilise Meditsiini ja Traditsioonilise Hiina Meditsiini Arendus- ja Rakenduskeskus Inseneritehnoloogia Uurimiskeskus Haridusministeerium, Guizhou Provintsi Farmaatsia Võtmelabor, Guizhou Meditsiiniülikool, Guiyang, Hiina Rahvavabariik; 4Gaioenteroloogia Osakond, Pekingi Ülikooli Shenzheni Haigla, Shenzhen, Hiina Rahvavabariik; 5Guizhou Meditsiiniülikooli Farmaatsiakool, Ravimtaimede Funktsiooni ja Rakenduse Riiklik Võtmelabor, Guiyang; 6 Laborimeditsiini osakond, Pekingi Ülikooli Shenzheni Haigla, Shenzhen, Hiina [email protected] Shen Xiangchun, Farmaatsiakool, Guizhou Meditsiiniülikool, Guizhou, Hiina Rahvavabariik, 550004, E-post [email protected] Eesmärk: GLP-1-põhine ravi on uus ravivõimalus põletikulise soolehaiguse korral. Ban-Lan-Gen (BLG) graanulid on tuntud viirusevastane Hiina meditsiinilise retseptiravim, millel on potentsiaalne põletikuvastane toime mitmesuguste põletikuliste seisundite ravis. Selle põletikuvastane toime koliidile ja toimemehhanism on aga endiselt ebaselged. MEETODID: Dekstraannaatriumsulfaadi (DSS) poolt indutseeritud kroonilise retsidiveeruva koliidi kindlakstegemine hiirtel. BLG kaitsva toime hindamiseks määrati haiguse aktiivsuse indeksid, kahjustuse histoloogilised markerid ja põletikuliste tsütokiinide tasemed. BLG mõju soole mikrobiootale ja soolele iseloomustati seerumi GLP-1 taseme ja käärsoole Gcg, GPR41 ja GRP43 ekspressiooni, soole mikrobioota koostise, fekaalsete lühikese ahelaga rasvhapete taseme ja GLP-1 vabanemisega hiire primaarsetest käärsoole epiteelirakkudest. SCFA-dest saadud GLP-1 tootmine. Tulemused: BLG-ravi vähendas oluliselt kehakaalu langust, DAI-d, käärsoole lühenemist, käärsoole kudede kahjustusi ning TNF-α, IL-1β ja IL-6 põletikku soodustavate tsütokiinide taset käärsoolekoes. Lisaks võib BLG-ravi oluliselt taastada käärsoole Gcg, GPR41 ja GRP43 ekspressiooni ning seerumi GLP-1 taseme koliidi hiirtel, suurendades SCFA-sid tootvate bakterite, näiteks Akkermansia ja Prevotellaceae_UCG-001, hulka ning vähendades selliste bakterite nagu Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas ja Oscillibacter arvukust. Lisaks võib BLG-ravi oluliselt suurendada SCFA-de taset koliidi hiirte väljaheites. Samal ajal näitasid in vitro katsed ka seda, et BLG-ga töödeldud hiirte väljaheidete ekstrakt võib oluliselt stimuleerida GLP-1 eritavaid primaarseid väikeseid hiire käärsoole epiteelirakke. Järeldused: Need leiud viitavad sellele, et BLG-l on koliidivastane toime. BLG-l on potentsiaali arendada teraapiana, vähemalt osaliselt soolestiku mikrobioota moduleerimise ja soolestiku lühikese ahelaga rasvhapetest saadud GLP-1 tootmise taastamise kaudu. See on paljulubav ravim kroonilise retsidiveeruva koliidi raviks. Märksõnad: koliit, Ban-Lan-Gen graanulid, soolestiku mikrobioota, lühikese ahelaga rasvhapped, GLP-1.
Haavandiline koliit (UC) on pikaajaline põletikuline käärsoole- ja pärasoole haigus, mida iseloomustab korduv kõhulahtisus, kõhuvalu, kaalulangus ja limaseine verine väljaheide.1 Viimasel ajal on UC levimus suurenenud varem madala esinemissagedusega riikides, sealhulgas Hiinas, koos lääneliku elustiili populaarsuse kasvuga.2 See suurenemine tekitab suuri probleeme rahvatervisele ja avaldab tõsist mõju patsientide töövõimele ja elukvaliteedile. Märkimisväärne on see, et UC patogenees on suures osas ebaselge, kuid on üldiselt aktsepteeritud, et geneetika, keskkonnategurid, soolemikrobioota ja immuunsüsteem aitavad kõik kaasa UC tekkele.3 Isegi praegu ei ole UC-le ravi ja ravi eesmärk on kliiniliselt kontrollida kliinilisi sümptomeid, esile kutsuda ja säilitada remissiooni, soodustada limaskesta paranemist ja vähendada kordumist. Klassikaliste ravimeetodite hulka kuuluvad aminosalitsülaadid, kortikosteroidid, immunosupressandid ja bioloogilised ravimid. Need ravimid ei suuda aga oma mitmesuguste kõrvaltoimete tõttu soovitud efekti saavutada.4 Hiljuti on paljud juhtumiuuringud näidanud, et traditsiooniline hiina meditsiin (TCM) on näidanud suurt potentsiaali UC leevendamisel madala toksilisusega, mis viitab sellele, et Uued traditsioonilise meditsiini ravimeetodid on haavandilise koliidi (UC) ravis paljulubav strateegia.5-7
Banlangeni graanulid (BLG) on traditsioonilise hiina meditsiini preparaat, mis on valmistatud Banlangeni juure vesiekstraktist.8 Lisaks viirusevastasele toimele on BLG-l potentsiaalne põletikuvastane toime mitmesuguste põletikuliste seisundite ravis.9,10 Lisaks on Radix isatidise vesiekstraktidest eraldatud ja identifitseeritud glükosinolaate (R,S-goitriin, progoitriin, epiprorubiin ja glükosiid) ning nukleosiide (hüpoksantiin, adenosiin, uridiin ja guanosiin) ja indigoalkaloide, nagu indigo ja indirubiin.11,12 Varasemad uuringud on hästi dokumenteerinud, et ühendid adenosiin, uridiin ja indirubiin avaldavad tugevat koliidivastast toimet koliidi erinevates loommudelites.13-17 Siiski ei ole BLG efektiivsuse hindamiseks koliidi korral läbi viidud tõenduspõhiseid uuringuid. Käesolevas uuringus uurisime BLG kaitsvat toimet dekstraannaatriumsulfaadi (DSS) poolt indutseeritud kroonilise retsidiveeruva koliidi vastu C57BL/6 hiirtel ja leidsime, et BLG suukaudne manustamine vähendas oluliselt Nõrgestatud DSS-indutseeritud krooniline retsidiveeruv käärsool hiirtel Põletik, selle regulatiivsed mehhanismid on seotud soolemikrobioota moduleerimise ja soolestikust pärineva glükagoonilaadse peptiidi-1 (GLP-1) tootmise taastamisega.
BLG graanulid (suhkruvabad, NMPA poolt heaks kiidetud Z11020357; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., Peking, Hiina; partii number: 20110966) osteti apteekidest. DSS (molekulaarmass: 36 000–50 000 daltonit) osteti firmalt MP Biologicals (Santa Ana, USA). Sulfasalasiin (SASP) (puhtus ≥ 98%), hematoksüliin ja eosiin osteti firmalt Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Hiire TNF-α, IL-1β ja IL-6 luminex Elisa testikomplektid osteti firmalt R&D systems (Minneapolis, MN, USA). Äädikhape, propioonhape ja võihape osteti firmalt Aladdin Industries (Shanghai, Hiina). 2-etüülbutaanhape osteti firmalt Merck KGaA (Darmstadt, Saksamaa).
6–8 nädala vanused isased C57BL/6 hiired (kehakaal 18–22 g) osteti ettevõttest Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Peking, Hiina) ja neid hoiti temperatuuril 22 ± 2 °C 12-tunnise valguse/pimeduse tsükliga keskkonnas. Hiirtele söödeti standardset näriliste toitu ja neil oli vaba juurdepääs joogiveele ühe nädala jooksul, et nad uue keskkonnaga harjuksid. Seejärel jagati hiired juhuslikult nelja rühma: kontrollrühm, DSS-mudelrühm, SASP-ga töödeldud rühm (200 mg/kg, suukaudselt) ja BLG-ga töödeldud rühm (1 g/kg, suukaudselt). Nagu on näidatud joonisel 1A, indutseeriti meie eelmise uuringu kohaselt hiirtel eksperimentaalne krooniline retsidiveeruv koliit kolme tsükliga 1,8% DSS-iga 5 päeva jooksul, millele järgnes destilleeritud vesi 7 päeva jooksul, vastavalt meie varasemale uuringule.18 SASP- ja BLG-ga töödeldud rühmade hiiri raviti vastavalt SASP-ga ja BLG-ga iga päev alates 0. päevast. Eelkatsete kohaselt määrati BLG annus 1 g/kg. Samal ajal määrati SASP annus kirjanduse kohaselt 200 mg/kg-le.4 Kontroll- ja DSS-mudelrühmad said kogu katse vältel sama koguse vett.
Joonis 1. BLG leevendab DSS-i poolt esile kutsutud kroonilist retsidiveeruvat koliiti hiirtel. (A) Kroonilise retsidiveeruva koliidi ja ravi eksperimentaalne disain, (B) kehakaalu muutus, (C) haiguse aktiivsuse indeksi (DAI) skoor, (D) käärsoole pikkus, (E) käärsoole representatiivne pilt, (F) H&E värvimine käärsooles (suurendus, ×100) ja (G) histoloogiline skoor. Andmed on esitatud keskmisena ± SEM (n = 6). ##p < 0,01 või ###p < 0,001 vs kontrollrühm (Con); *p < 0,05 või **p < 0,01 või ***p < 0,001 vs DSS-rühm.
Kehakaalu, väljaheite konsistentsi ja pärasooleverejooksu mõõdeti iga päev. Haiguse aktiivsuse indeks (DAI) määrati kehakaalu, väljaheite konsistentsi ja pärasooleverejooksu skooride kombineerimise teel, nagu eelnevalt kirjeldatud.19 Katse lõpus kõik hiired eutaneeriti ning edasisteks katseteks koguti veri, väljaheited ja jämesool.
Jämesoolekoe fikseeriti formaliinis ja sisestati parafiini. Valmistati 5-mikronilised lõigud, mis värviti hematoksüliin-eosiiniga (H&E), seejärel tehti pimekatsed ja skoor määrati eelnevalt kirjeldatud viisil.19
Jämesoolekoe totaalne RNA ekstraheeriti Trizoli reagendiga (Invitrogen, Carlsbad, CA), millele järgnes cDNA ekstraheerimine pöördtranskriptaasiga (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Jaapan). Kvantitatiivne PCR viidi läbi reaalajas PCR-süsteemi abil, kasutades SYBR Green Masterit (Roche, Basel, Šveits). Sihtgeeni transkriptid normaliseeriti β-aktiini suhtes ja andmeid analüüsiti 2-ΔΔCT meetodil. Geeni praimerite järjestused on toodud tabelis 1.
Hiire käärsoole epiteelirakkude primaarne isoleerimine ja kultiveerimine viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud.20 Lühidalt, 6-8 nädala vanuste hiirte käärsooled lõigati esmalt pärast emakakaela dislokatsiooni teel hukkamist välja, seejärel avati pikisuunas, töödeldi Hanksi tasakaalustatud soolalahusega (HBSS, ilma kaltsiumi ja magneesiumita) ja lõigati 0,5-1 mm väikesteks tükkideks. Seejärel seediti kudesid 0,4 mg/ml kollagenaas XI-ga (Sigma, Poole, Ühendkuningriik) vabas DMEM söötmes ja tsentrifuugiti kiirusel 300 xg 5 minutit toatemperatuuril. Resuspendeerige pellet DMEM söötmes (millele on lisatud 10% loote veise seerumit, 100 ühikut/ml penitsilliini ja 100 µg/ml streptomütsiini) temperatuuril 37 °C ja laske läbi nailonvõrgu (pooride suurus ~250 µm). Käärsoole epiteelirakkude alikvoodid pandi klaaspõhjaga nõudesse ja inkubeeriti äädikhappe, propioonhappe, võihappe ja hiire väljaheidete ekstraktidega 2 tundi temperatuuril 37 °C, 5% CO2.
Jämesoole kude homogeniseeriti PBS-iga ja tsütokiinide IL-6, TNF-α ja IL-1β tasemed jämesoole koes määrati luminex ELISA testikomplektide abil (R&D systems, Minneapolis, MN, USA). Samamoodi määrati GLP-1 tasemed hiire primaarsete jämesoole epiteelirakkude seerumis ja kultuurikeskkonnas ELISA komplektiga (Bioswamp, Wuhan, Hiina) vastavalt tootja juhistele.
Väljaheidetest eraldati kogu DNA DNA ekstraheerimiskomplekti (Tiangen, Hiina) abil. DNA kvaliteeti ja kvantiteeti mõõdeti vastavalt suhetes 260 nm/280 nm ja 260 nm/230 nm. Seejärel, kasutades iga ekstraheeritud DNA-d matriitsina, kasutati spetsiifilisi praimereid 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) ja 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT), et amplifitseerida 16S rRNA geeni V3-V4 piirkondi erinevates piirkondades. PCR-produktid puhastati QIAquick Gel Extraction Kit'i (QIAGEN, Saksamaa) abil, kvantifitseeriti reaalajas PCR-iga ja sekveneeriti IlluminaMiseq PE300 sekveneerimisplatvormi (Illumina Inc., CA, USA) abil. Bioinformaatilise analüüsi jaoks viidi andmetöötlus läbi vastavalt eelnevalt avaldatud protokollidele.21,22 Lühidalt, töötlemata ekspressfailide filtreerimiseks kasutage Cutadapt'i (V1.9.1). OTU-d klasterdati UPARSE (versioon 7.0.1001) abil. sarnasuse piirväärtusega 97% ja kimäärsete järjestuste eemaldamiseks kasutati UCHIME-d. Kogukonna koostise analüüs ja klassifitseerimine viidi läbi RDP klassifikaatori (http://rdp.cme.msu.edu/) abil, mis põhines SILVA ribosomaalse RNA geeni andmebaasil.
Lühikese ahelaga rasvhapete (äädikhape, propioonhape ja võihape) tasemed mõõdeti Tao jt poolt eelnevalt kirjeldatud viisil, mõningate muudatustega.23 Lühidalt, 100 mg väljaheiteid suspendeeriti esmalt 0,4 ml deioniseeritud vees, seejärel lisati 0,1 ml 50% väävelhapet ja 0,5 ml 2-etüülvõihapet (sisestandard), seejärel homogeniseeriti ja kuumutati temperatuuril 4 °C. Tsentrifuugiti kiirusel 12 000 p/min 15 minutit temperatuuril C. Supernatant ekstraheeriti 0,5 ml eetriga ja süstiti analüüsiks gaasikromatograafi. Gaasikromatograafia (GC) analüüsiks analüüsiti proove GC-2010 Plus gaasikromatograafiga (Shimadzu, Inc.), mis oli varustatud leekionisatsioonidetektoriga (FID). Eraldamine saavutati ZKAT-624 kolonni abil, 30 m × 0,53 mm × 0,3 μm (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., Hiina). Andmed saadi GC lahuse tarkvara abil (Shimadzu, Inc.). Jaotussuhe oli 10:1, kandegaas oli lämmastik ja voolukiirus oli 6 ml/min. Sissepritse maht oli 1 μL. Injektori ja detektori temperatuur oli 300 °C. Ahju temperatuuri hoiti 140 °C juures 13,5 minutit, seejärel tõsteti kiirusega 120 °C/min 250 °C-ni; temperatuuri hoiti 5 minutit.
Andmed on esitatud keskmisena ± keskmise standardviga (SEM). Andmete olulisust hinnati ühesuunalise ANOVA abil, millele järgnes Duncani mitmekordse ulatuse test. Kõikide arvutuste jaoks kasutati GraphPad Prism 5.0 tarkvara (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) ja statistiliselt oluliseks loeti p < 0,05.
On hästi teada, et haavandiline koliit (UC) on krooniline retsidiveeruv koliit, millega kaasneb tugev kõhuvalu, kõhulahtisus ja verejooks. Seetõttu tehti hiirtel DSS-indutseeritud krooniline retsidiveeruv koliit, et hinnata BLG koliidivastast efektiivsust (joonis 1A). Võrreldes kontrollrühmaga oli DSS-mudelrühma hiirtel oluliselt väiksem kehakaal ja kõrgem DAI ning need muutused pöördusid oluliselt pärast 24-päevast BLG-ravi (joonis 1B ja C). Käärsoole lühenemine on haavandilise koliidi oluline tunnus. Nagu on näidatud joonistel 1D ja E, lühenes DSS-i saanud hiirte käärsoole pikkus oluliselt, kuid BLG-ravi leevendas seda. Seejärel tehti histopatoloogiline analüüs käärsoole põletiku hindamiseks. H&E-värvitud pildid ja patoloogilised skoorid näitasid, et DSS-i manustamine häiris oluliselt käärsoole arhitektuuri ja põhjustas krüptide hävimist, samas kui BLG-ravi vähendas oluliselt krüptide hävimist ja patoloogilisi skoore (joonis 1F ja G). Märkimisväärne on see, et BLG kaitsev toime annuses 1 g/kg oli võrreldav SASP omaga annuses 200. mg/kg. Kokkuvõttes viitavad need leiud sellele, et BLG on efektiivne DSS-i poolt esile kutsutud kroonilise retsidiveeruva koliidi raskusastme vähendamisel hiirtel.
TNF-α, IL-1β ja IL-6 on olulised jämesoolepõletiku põletiku markerid. Nagu joonisel 2A näidatud, indutseeris DSS TNF-α, IL-1β ja IL-6 geeniekspressiooni olulise suurenemise jämesooles võrreldes kontrollrühmaga. BLG manustamine võib neid DSS-vahendatud muutusi oluliselt tagasi pöörata. Järgmisena kasutasime ELISA-d, et määrata jämesoolekoes põletikuliste tsütokiinide TNF-α, IL-1β ja IL-6 taset. Tulemused näitasid ka, et TNF-α, IL-1β ja IL-6 tase jämesooles oli DSS-iga ravitud hiirtel oluliselt suurenenud, samas kui BLG-ravi leevendas neid tõuse (joonis 2B).
Joonis 2. BLG pärsib põletikku soodustavate tsütokiinide TNF-α, IL-1β ja IL-6 geeniekspressiooni ja tootmist DSS-iga töödeldud hiirte käärsooles. (A) TNF-α, IL-1β ja IL-6 geeniekspressioon käärsooles; (B) TNF-α, IL-1β ja IL-6 valgutasemed käärsooles. Andmed on esitatud keskmisena ± standardvea (n = 4–6). #p < 0,05 või ##p < 0,01 või ###p < 0,001 vs kontrollrühm (Con); *p < 0,05 või **p < 0,01 vs DSS-rühm.
Soole düsbioos on haavandilise koliidi patogeneesis kriitilise tähtsusega.24 Et uurida, kas BLG moduleerib DSS-iga töödeldud hiirte soolestiku mikrobiootat, viidi läbi 16S rRNA sekveneerimine, et analüüsida soolestiku bakterite kooslust. Venni diagramm näitab, et kolmel rühmal on 385 ühist OTÜ-d. Samal ajal oli igal rühmal unikaalsed OTÜ-d (joonis 3A). Lisaks näitasid joonisel 3B ja C näidatud Chao1 indeks ja Shannoni indeks, et soolestiku mikrobioota koosluse mitmekesisus oli BLG-ga töödeldud hiirtel vähenenud, kuna Shannoni indeks oli BLG-ga töödeldud rühmas oluliselt vähenenud. Kolme rühma klastrite mustrite määramiseks kasutati peakomponentide analüüsi (PCA) ja peakoordinaatanalüüsi (PCoA) ning need näitasid, et DSS-iga töödeldud hiirte koosluse struktuur oli pärast BLG-ravi selgelt eristunud (joonis 3D ja E). Need andmed viitavad sellele, et BLG-ravi mõjutas oluliselt DSS-indutseeritud koliidiga hiirte koosluse struktuuri.
Joonis 3. BLG muudab soolestiku mikrobioota mitmekesisust hiirtel, kellel on DSS-indutseeritud koliit. (A) OTU Venni diagramm, (B) Chao1 indeks, (C) Shannoni rikkuse indeks, (D) OTU peamine komponentide analüüsi (PCA) skoordiagramm, (E) OTU peamine koordinaatanalüüsi (PCoA) skoor. Joonis. Andmed on esitatud keskmisena ± SEM (n = 6). **p < 0,01 vs DSS-rühm.
Fekaalse mikrobioota spetsiifiliste muutuste hindamiseks analüüsisime soolestiku mikrobioota koostist kõigil taksonoomilistel tasemetel. Nagu joonisel 4A näidatud, olid kõigis rühmades peamised hõimkonnad Firmicutes ja Bacteroidetes, millele järgnesid Verrucomicrobia. Firmicutes'i ja Firmicutes/Bacteroidetes'i suhteline arvukus oli DSS-iga töödeldud hiirte fekaalsetes mikroobikooslustes kontrollhiirtega võrreldes oluliselt suurenenud ning need muutused pöördusid pärast BLG-ravi oluliselt. Eelkõige suurendas BLG-ravi oluliselt Verrucobacteriumi suhtelist arvukust DSS-indutseeritud koliidiga hiirte väljaheites. Majapidamise tasandil olid fekaalsetes mikroobikooslustes hõivatud Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae ja Prevotellaceae (joonis 4B). Võrreldes DSS-rühmaga suurendas BLG vähenemine Akkermansiaceae arvukust, kuid vähendas Lachnospiraceae ja Ruminococcaceae arvukust. Märkimisväärne on see, et perekonna tasandil olid fekaalses mikrobiootas hõivatud Lachnospira_NK4A136_grupp, Akkermansia ja Prevotellaceae_UCG-001 (joonis 4C). See leid näitas ka, et BLG-töötlus pööras DSS-i indutseeritud mikrobioota tasakaalustamatuse efektiivselt tagasi, mida iseloomustas Eubacterium_xylanophilum_grupi, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas ja Oscillibacter vähenemine ning Akkermansia ja Prevotellaceae_UCG-001 suurenemine.
Joonis 4. BLG muudab soolestiku mikrobioota arvukust DSS-indutseeritud koliidi hiirtel. (A) Soolestiku mikrobioota arvukus hõimkonna tasandil; (B) Soolestiku mikrobioota arvukus perekonna tasandil; (C) Soolestiku mikrobioota arvukus perekonna tasandil. Andmed on esitatud keskmisena ± standardvea (n = 6). #p < 0,05 või ###p < 0,001 vs kontrollrühm (Con); *p < 0,05 või **p < 0,01 või ***p < 0,001 vs DSS-rühm.
Arvestades, et lühikese ahelaga rasvhapped (SCFA-d) on Akkermansia ja Prevotellaceae_UCG-001 peamised metaboliidid, samas kui atsetaat, propionaat ja butüraat on soolevalendikus kõige levinumad SCFA-d,25-27 oleme oma uuringus ikka veel pooleli. Nagu joonisel 5 näidatud, vähenesid väljaheite atsetaadi, propionaadi ja butüraadi kontsentratsioonid DSS-iga ravitud rühmas oluliselt, samas kui BLG-ravi suutis seda vähenemist suures osas pärssida.
Joonis 5. BLG suurendab lühiahelaliste rasvhapete (SCFA) taset DSS-indutseeritud koliidiga hiirte väljaheites. (A) Äädikhappe sisaldus väljaheites; (B) propioonhappe sisaldus väljaheites; (C) võihappe sisaldus väljaheites. Andmed on esitatud keskmisena ± standardvea (n = 6). #p < 0,05 või ##p < 0,01 vs kontrollrühm (Con); *p < 0,05 või **p < 0,01 vs DSS-rühm.
Lisaks arvutasime Pearsoni korrelatsioonikordaja perekonna tasemel diferentsiaalse lühikese ahelaga rasvhapete (SCFA) ja väljaheite mikrobioota vahel. Nagu joonisel 6 näidatud, oli Akkermansia positiivses korrelatsioonis propioonhappe (Pearson = 0,4866) ja võihappe (Pearson = 0,6192) tootmisega. Seevastu olid nii Enteromonas kui ka Oscillobacter negatiivses korrelatsioonis atsetaadi tootmisega, Pearsoni koefitsientidega vastavalt 0,4709 ja 0,5104. Samamoodi oli Ruminococcaceae_UCG-014 negatiivses korrelatsioonis vastavalt propioonhappe (Pearson = 0,4508) ja võihappe (Pearson = 0,5842) tootmisega.
Joonis 6. Pearsoni korrelatsioonianalüüs diferentsiaalsete lühikese ahelaga rasvhapete ja käärsoole mikroobide vahel. (A) Enteromonas äädikhappega; (B) Põrutusbatsill äädikhappega; (C) Akkermansia vs propioonhape; (D) Ruminococcus_UCG-014 propioonhappega; (E) Akkermansia võihappega; (F) Ruminococcus_UCG-014 võihappega.
Glükagoonilaadne peptiid-1 (GLP-1) on rakutüübispetsiifiline proglukagooni (Gcg) translatsioonijärgne produkt, millel on põletikuvastased omadused.28 Nagu joonisel 7 näidatud, indutseeris DSS Gcg mRNA ekspressiooni olulise vähenemise. Käärsoole- ja BLG-ravi võis DSS-indutseeritud Gcg vähenemist kontrollrühmaga võrreldes oluliselt tagasi pöörata (joonis 7A). Samal ajal oli GLP-1 tase seerumis DSS-iga ravitud rühmas oluliselt vähenenud ja BLG-ravi võis seda vähenemist suures osas ära hoida (joonis 7B). Kuna lühikese ahelaga rasvhapped võivad stimuleerida GLP-1 sekretsiooni G-valguga seotud retseptori 43 (GRP43) ja G-valguga seotud retseptori 41 (GRP41) aktiveerimise kaudu, uurisime ka GPR41 ja GRP43 koliidi hiirte käärsooles ning leidsime, et GRP43 ja GPR41 käärsoole mRNA ekspressioon vähenes pärast DSS-ga stimuleerimist oluliselt ja BLG-ravi võis neid langusi tõhusalt päästa (joonis 7C ja D).
Joonis 7. BLG suurendab seerumi GLP-1 taset ning käärsoole Gcg, GPR41 ja GRP43 mRNA ekspressiooni DSS-iga töödeldud hiirtel. (A) Gcg mRNA ekspressioon käärsoolekoes; (B) GLP-1 tase seerumis; (C) GPR41 mRNA ekspressioon käärsoolekoes; (D) GPR43 mRNA ekspressioon käärsoolekoes. Andmed on esitatud keskmisena ± SEM (n = 5–6). #p < 0,05 või ##p < 0,01 vs kontrollrühm (Con); *p < 0,05 vs DSS-rühm.
Kuna BLG-ravi võis DSS-iga töödeldud hiirtel suurendada seerumi GLP-1 taset, käärsoole Gcg mRNA ekspressiooni ja fekaalse SCFA taset, uurisime lisaks atsetaadi, propionaadi ja butüraadi, samuti kontroll- (F-Con), DSS-koliidi (F-Con) (DSS) ja BLG-ga töödeldud koliidi (F-BLG) hiirte GLP-1 vabanemise mõju primaarsetest hiire käärsoole epiteelirakkudest. Nagu on näidatud joonisel 8A, stimuleerisid 2 mM äädikhappe, propioonhappe ja võihappega töödeldud hiire käärsoole epiteelirakud oluliselt GLP-1 vabanemist, mis on kooskõlas varasemate uuringutega.29,30 Samuti stimuleerisid kõik F-Con, F-DSS ja F-BLG (mis võrdub 0,25 g väljaheitega) oluliselt GLP-1 vabanemist primaarsetest hiire käärsoole epiteelirakkudest. Märkimisväärne on see, et F-DSS-iga töödeldud hiire käärsoole epiteelirakkude poolt vabaneva GLP-1 kogus oli palju väiksem kui F-Con ja F-BLG-ga töödeldud hiire käärsoole epiteelirakkude poolt vabanev kogus. (Joonis 8B). Need andmed viitavad sellele, et BLG-ravi taastas oluliselt soolestiku SCFA-st pärineva GLP-1 tootmise.
Joonis 8. BLG-st saadud lühikese ahelaga rasvhapped (SCFA) stimuleerivad GLP-1 vabanemist hiire primaarsetest käärsoole epiteelirakkudest. (A) Äädikhape, propioonhape ja võihape stimuleerisid GLP-1 vabanemist hiire primaarsetest käärsoole epiteelirakkudest; (B) fekaaliekstraktid F-Con, F-DSS ja F-BLG stimuleerisid hiire primaarseid käärsoole epiteelirakke. Vabanenud GLP-1 kogus. Käärsoole epiteelirakkude alikvoodid pandi klaaspõhjaga Petri tassidesse ja töödeldi vastavalt 2 mM äädikhappe, propioonhappe, võihappe ja fekaaliekstraktidega F-Con, F-DSS ja F-BLG (mis vastab 0,25 g väljaheitele). 2 tundi temperatuuril 37 °C, 5% CO2 juures. Hiire primaarsetest käärsoole epiteelirakkudest vabanenud GLP-1 kogus määrati ELISA abil. Andmed on esitatud keskmisena ± SEM (n = 3). #p < 0,05 või ##p < 0,01 vs. tühi või F-Con; *p < 0,05 vs. F-DSS.
Lühendid: Ace, äädikhape; Pro, propioonhape; aga võihape; F-Con, kontrollhiirte fekaaliekstrakt; F-DSS, koliidi hiirte fekaaliekstrakt; F-BLG, BLG-ga töödeldud käärsoolest. Põletikuliste hiirte fekaaliekstraktid.
Maailma Terviseorganisatsiooni poolt ravile allumatu haigusena loetletud haavandiline koliidist on saamas ülemaailmne oht; Siiski on haiguse ennustamiseks, ennetamiseks ja raviks tõhusad meetodid endiselt piiratud. Seetõttu on tungiv vajadus uurida ja välja töötada uusi ohutuid ja tõhusaid haavandilise koliidi (UC) ravistrateegiaid. Traditsioonilise Hiina meditsiini preparaadid on paljutõotav võimalus, kuna paljud traditsioonilise Hiina meditsiini preparaadid on sajandite jooksul osutunud tõhusaks haavandilise koliidi ravis Hiina populatsioonis ning need kõik on bioloogilised orgaanilised ja looduslikud materjalid, mis on enamasti inimestele ja loomadele ohutud.31,32 Selle uuringu eesmärk oli leida ohutu ja tõhus traditsioonilise Hiina meditsiini preparaat haavandilise koliidi raviks ja uurida selle toimemehhanismi.BLG on tuntud Hiina taimne valem, mida kasutatakse gripi raviks.8,33 Meie laboris ja teistes tehtud töö on näidanud, et indigo, töödeldud traditsioonilise Hiina meditsiini toode samast toorainest kui BLG, on inimeste ja loomade haavandilise koliidi ravis märkimisväärse efektiivsusega.4,34 BLG koliidivastane toime ja selle mõju mehhanism on aga ebaselge. Käesolevas uuringus näitavad meie tulemused, et BLG leevendab tõhusalt DSS-i põhjustatud käärsoolepõletikku, mis on seotud soolestiku mikrobioota moduleerimise ja taastamisega. soolestikust pärinev GLP-1 tootmine.
On hästi teada, et haavandilist koliiti iseloomustavad ägenemiste perioodid tüüpiliste kliiniliste tunnustega, nagu kaalulangus, kõhulahtisus, rektaalne verejooks ja ulatuslik käärsoole limaskesta kahjustus.35 Seega manustati kroonilist ägenemist põhjustavat koliiti kolme tsükliga 1,8% DSS-i viie päeva jooksul, millele järgnes seitsmepäevane veejoomine. Nagu on näidatud joonisel 1B, näitasid kõikuv kaalulangus ja DAI skoorid kroonilise ägenemise edukat indutseerimist. BLG-ga ravitud rühma hiirtel täheldati 8. päevast alates paranemist, mis erines oluliselt 24. päevast. Samu muutusi täheldati ka DAI skooris, mis viitab koliidi kliinilise paranemise paranemisele. Käärsoolekahjustuse ja põletikulise seisundi osas paranesid pärast BLG-ravi oluliselt ka käärsoole pikkus, käärsoolekoe kahjustus ning põletikku soodustavate tsütokiinide TNF-α, IL-1β ja IL-6 geeniekspressioon ja tootmine käärsoolekoes. Kokkuvõttes näitavad need tulemused selgelt, et BLG on efektiivne kroonilise ägenemise põhjustava koliidi ravis hiirtel.
Kuidas BLG oma farmakoloogilist toimet avaldab? Arvukad varasemad uuringud on näidanud, et soole mikrobioota mängib haavandilise koliidi patogeneesis võtmerolli ning mikrobioomipõhised ja mikrobioomile suunatud ravimeetodid on osutunud haavandilise koliidi ravis väga atraktiivseks strateegiaks. Käesolevas uuringus näitasime, et BLG-ravi põhjustas olulisi muutusi soole mikrobioota koostises, mis viitab sellele, et BLG kaitsev toime DSS-i poolt indutseeritud koliidi vastu on seotud soole mikrobioota moduleerimisega. See tähelepanek on kooskõlas arusaamaga, et soole mikrobioota homöostaasi ümberprogrammeerimine on oluline lähenemisviis traditsioonilise meditsiini preparaatide efektiivsuse mõistmiseks.36,37 Märkimisväärselt on Akkermansia gramnegatiivne ja rangelt anaeroobne bakter, mis elab soole limakihis, lagundab mutsiine, toodab propioonhapet, stimuleerib karikrakkude diferentseerumist ja säilitab limaskesta barjääri terviklikkuse funktsiooni.26 Mitmed kliinilised ja loomkatsete andmed näitavad, et Akkermansia on väga seotud terve limaskestaga38 ja Akkermansia spp. suukaudse manustamisega. võib oluliselt parandada limaskesta põletikku.39 Meie praegused andmed näitavad, et Akkermansia suhteline arvukus suureneb pärast BLG-ravi oluliselt. Lisaks on Prevotellaceae_UCG-001 SCFA-d tootev bakter.27 Mitmed uuringud on näidanud, et Prevotellaceae_UCG-001 leiti koliidiga loomade väljaheites madala suhtelise arvukusega.40,41 Meie praegused andmed näitavad ka, et BLG-ravi võib oluliselt suurendada Prevotellaceae_UCG-001 suhtelist arvukust DSS-iga töödeldud hiirte käärsooles.Seevastu on Oscillibacter mesofiilne, rangelt anaeroobne bakter.42 teatati, et Oscillibacteri suhteline arvukus oli UC hiirtel oluliselt suurenenud ja oli oluliselt positiivses korrelatsioonis IL-6 ja IL-1β tasemete ja patoloogiliste skooridega.43,44 Märkimisväärselt vähendas BLG-ravi oluliselt Oscillibacteri suhtelist arvukust DSS-iga töödeldud hiirte väljaheites. Tähelepanuväärne on see, et need BLG-ga muudetud bakterid olid kõige SCFA-sid tootvamad bakterid.Arvukad varasemad uuringud on näidanud SCFA-de potentsiaalselt kasulikku mõju. käärsoolepõletikule ja sooleepiteeli terviklikkuse kaitsele.45,46 Meie praegused andmed täheldasid ka, et BLG-ga töödeldud hiirtel olid DSS-iga töödeldud väljaheites oluliselt suurenenud SCFA-atsetaadi, -propionaadi ja -butüraadi kontsentratsioonid. Kokkuvõttes näitavad need leiud selgelt, et BLG-ravi võib kroonilise retsidiveeruva koliidiga hiirtel tõhusalt suurendada DSS-indutseeritud SCFA-d tootvate bakterite hulka.
GLP-1 on inkretiin, mida toodetakse peamiselt iileumis ja käärsooles ning millel on oluline roll mao tühjenemise edasilükkamisel ja söögijärgse veresuhkru alandamisel.47 Tõendid näitavad, et dipeptidüülpeptidaas (DPP)-4, GLP-1 retseptori agonist ja GLP-1 nanomeditsiin, võivad hiirtel tõhusalt leevendada soolepõletikku.48-51 Nagu varasemates uuringutes teatatud, seostati kõrgeid lühikese ahelaga rasvhapete (SCFA) kontsentratsioone plasma GLP-1 tasemega nii inimestel kui ka hiirtel.52 Meie praegused andmed näitavad, et pärast BLG-ravi suurenesid seerumi GLP-1 tasemed ja Gcg mRNA ekspressioon oluliselt.Samamoodi suurenes GLP-1 sekretsioon oluliselt käärsoolekultuurides pärast stimuleerimist BLG-ga töödeldud koliidi hiirte väljaheiteekstraktidega võrreldes stimuleerimisega DSS-iga töödeldud koliidi hiirte väljaheiteekstraktidega.Kuidas mõjutavad lühikese ahelaga rasvhapped GLP-1 vabanemist?Gwen Tolhurst jt. teatas, et SCFA võib stimuleerida GLP-1 sekretsiooni GRP43 ja GPR41 kaudu.29 Meie praegused andmed näitavad ka, et BLG-ravi suurendab oluliselt GRP43 ja GPR41 mRNA ekspressiooni DSS-iga töödeldud hiirte käärsooles. Need andmed viitavad sellele, et BLG-ravi võib taastada SCFA-de poolt soodustatud GLP-1 tootmise, aktiveerides GRP43 ja GPR41.
BLG on Hiinas pikaajaline käsimüügiravim. Kunmingi hiirtel on BLG maksimaalne talutav annus 80 g/kg ja ägedat toksilisust ei ole täheldatud.53 Praegu on BLG (ilma suhkruta) soovitatav annus inimestele 9–15 g päevas (3 korda päevas). Meie uuring näitas, et BLG annuses 1 g/kg leevendas hiirtel DSS-i poolt indutseeritud kroonilist retsidiveeruvat koliiti. See annus on lähedane kliiniliselt kasutatavale BLG annusele. Meie uuring leidis ka, et selle toimemehhanismi vahendavad vähemalt osaliselt muutused soole mikrobiootas, täpsemalt SCFA-d tootvad bakterid, nagu Akkermansia ja Prevotellaceae_UCG-001, et taastada soolestikust pärineva GLP-1 tootmine. Need leiud viitavad sellele, et BLG-d väärib edasist kaalumist potentsiaalse ravimina kliinilise koliidi ravis. Täpne mehhanism, mille abil see soolestiku mikrobiootat moduleerib, vajab aga veel mikrobioota-defitsiidiga hiirte ja fekaalse bakterite siirdamise abil kinnitamist.
Ääss, äädikhape; butüürhape; BLG, pandan; DSS, dekstraannaatriumsulfaat; DAI, haiguse aktiivsuse indeks; DPP, dipeptidüülpeptidaas; FID, leekionisatsioonidetektor; F-Con, kontrollrühm; hiirte väljaheiteekstraktid; F-DSS, DSS-koliidi hiirte väljaheiteekstraktid; F-BLG, BLG-ga töödeldud koliidi hiirte väljaheiteekstraktid; GLP-1, glükagoonilaadne peptiid-1; Gcg, glükagoon; gaasikromatograafia, gaasikromatograafia; GRP43, G-valguga seotud retseptor 43; GRP41, G-valguga seotud retseptor 41; H&E, hematoksüliin-eosiin; HBSS, Hanksi tasakaalustatud soolalahus; OTC, OTC; PCA, põhikomponentide analüüs; PCoA, põhikoordinaatide analüüs; Pro, propioonhape; SASP, sulfasalasiin; SCFA, lühikese ahelaga rasvhapped; Hiina meditsiin, traditsiooniline hiina meditsiin; haavandiline koliit, haavandiline koliit.
Kõik katseprotokollid kiitis heaks Pekingi Ülikooli Shenzheni-Hongkongi Teadus- ja Tehnoloogiaülikooli Meditsiinikeskuse (Shenzhen, Hiina) loomade eetikakomitee vastavalt institutsionaalsetele suunistele ja loomade eeskirjale (eetikanumber A2020157).
Kõik autorid panustasid oluliselt kontseptsiooni ja disaini, andmete hankimisse või andmete analüüsi ja tõlgendamisse; osalesid artikli koostamises või olulise intellektuaalse sisu kriitilises läbivaatamises; nõustusid esitama käsikirja käesolevale ajakirjale; kiitsid lõpuks heaks avaldamiseks mõeldud versiooni; vastutasid töö kõigi aspektide eest.
Seda tööd toetasid Hiina Riiklik Loodusteaduste Fond (81560676 ja 81660479), Shenzheni Ülikooli esmaklassiline projekt (86000000210), Shenzheni Teaduse ja Tehnoloogia Innovatsioonikomitee Fond (JCYJ20210324093810026) ning Guangdongi provintsi Meditsiiniteaduse ja -tehnoloogia Uurimisfond (A2020157 ja A2020272), Guizhou Meditsiiniülikooli Apteek Guizhou provintsis, mida rahastas Key Laboratory (YWZJ2020-01) ja Pekingi Ülikooli Shenzheni Haigla (JCYJ2018009).
1. Tang B, Zhu J, Zhang B jt. Triptoliidi terapeutiline potentsiaal põletikuvastase ainena dekstraannaatriumsulfaadi poolt esile kutsutud eksperimentaalse koliidi korral hiirtel. pre-immune.2020;11:592084.doi: 10.3389/fimmu.2020.592084
2. Kaplan GG. IBD globaalne koormus: aastatel 2015–2025. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2015;12:720–727. doi: 10.1038/nrgastro.2015.150
3. Peng J, Zheng TT, Li Xue jt. Taimse päritoluga alkaloidid: paljulubavad haiguse modifitseerijad põletikulise soolehaiguse korral. Prepharmacology.2019;10:351.doi:10.3389/fphar.2019.00351
4. Xiao Haiteng, Peng Jie, Wen B jt. Indigo Naturalis pärsib hiirtel DSS-indutseeritud koliidi korral käärsoole oksüdatiivset stressi ja Th1/Th17 vastuseid. Oxid Med Cell Longev. 2019;2019:9480945.doi: 10.1155/2019/9480945
5. Chen M, Ding Y, Tong Z. Sophora flavescensi (Sophora flavescens) efektiivsus ja ohutus haavandilise koliidi ravis: kliinilised tõendid ja võimalikud mehhanismid. Prepharmacology.2020;11:603476.doi:10.3389/fphar.2020.603476
6. Cao Fang, Liu Jie, Sha Benxing, Pan HF. Loodustooted: eksperimentaalselt tõhusad ravimid põletikulise soolehaiguse raviks. Curr Pharmaceuticals. 2019;25:4893–4913. doi: 10.2174/1381612825666191216154224
7. Zhang C, Jiang M, Lu A. Mõtisklusi haavandilise koliidi adjuvantravi üle traditsioonilise hiina meditsiini abil. Clinical Rev Allergy Immunization. 2013;44:274–283. doi: 10.1007/s12016-012-8328-9
8. Li Zhongteng, Li Li, Chen TT jt. Banlangeni graanulite efektiivsus ja ohutus hooajalise gripi ravis: randomiseeritud kontrollitud uuringu protokoll. trial.2015;16:126.doi: 10.1186/s13063-015-0645-x