Valkude sorteerimine sekretoorses rajas on oluline rakkude kompartmentalisatsiooni ja homöostaasi säilitamiseks. Lisaks koore vahendatud sorteerimisele on lipiidide roll kinesiini sorteerimises sekretoorse transpordi protsessis pikaajaline põhiküsimus, millele pole veel vastust leitud. Käesolevas uuringus teostame 3D samaaegset mitmevärvilist kõrglahutusega reaalajas pildistamist, et tõestada in vivo, et äsja sünteesitud glükosüülfosfatidüülinositooliga immobiliseeritud valgud, millel on väga pikad keramiidlipiidfragmendid, on klastritesse koondunud ja klassifitseeritud spetsiaalsetesse endoplasma võrgu väljumiskohtadesse, mis erinevad transmembraansete valkude poolt kasutatavatest kohtadest. Lisaks näitame, et keramiidi ahela pikkus endoplasmaatilise retiikulumi membraanis on selle sorteerimise selektiivsuse jaoks kriitilise tähtsusega. Meie uuring pakub esimesi otseseid in vivo tõendeid valgulastide klassifitseerimiseks lipiidahela pikkuse põhjal selektiivsetesse ekspordikohtadesse sekretoorses rajas.
Eukarüootsetes rakkudes sorteeritakse endoplasmaatilises retiikulumis (ER) sünteesitud valgud transpordi ajal sekretoorse raja kaudu, et need kohale toimetada sobivasse rakusihtkohta (1). Lisaks katte vahendatud sorteerimisele on pikka aega oletatud, et teatud lipiidid võivad toimida ka selektiivsete väljumispunktidena, koondades need spetsiifilistesse membraanidomeenidesse, mis spetsiifilised valgud (2-5). Siiski puuduvad endiselt otsesed in vivo tõendid selle võimaliku lipiidipõhise mehhanismi tõestamiseks. Selle põhiprobleemi lahendamiseks uurisime pärmis, kuidas glükosüülfosfatidüülinositooliga (GPI) ankurdatud valgud (GPI-AP-d) eksporditakse ER-ist erinevalt. GPI-AP-d on mitmesugused lipiididega seotud rakupinna valgud (6, 7). GPI-AP on sekreteeritav valk, mis on kinnitunud plasmamembraani välislehtedele glükolipiidosa (GPI ankur) kaudu. Nad aktsepteerivad GPI ankruid konservatiivsete translatsioonijärgsete modifikatsioonidena ER-i valendikus (8). Pärast kinnitumist läbib GPI-AP Golgi aparaadi (5, 9) ER-ist plasmamembraanile. GPI-ankrute olemasolu põhjustab GPI-AP eraldi transpordi transmembraanselt sekreteeritavatest valkudest (sh teistest plasmamembraani valkudest) mööda sekretoorset rada (5, 9, 10). Pärmirakkudes eraldatakse GPI-AP-d teistest sekreteeritavatest valkudest endoplasmaatilises retiikulumis ja seejärel pakitakse unikaalsetesse vesiikulitesse, mis on mähitud kattevalgu kompleksi II (COPII) abil (6, 7). Selle klassifitseerimisprotsessi määrajad ER-i ekspordiprotsessis on ebaselged, kuid oletatakse, et see mehhanism võib vajada lipiide, eriti GPI ankru lipiidiosa struktuurilist ümberkujundamist (5, 8). Pärmis algab GPI lipiidide ümberkujundamine kohe pärast GPI kinnitumist ja paljudel juhtudel põhjustab see keramiidi seondumist 26-süsinikulise pika ahelaga küllastunud rasvhappega (C26:0) (11, 12). C26-keramiid on seni peamine pärmirakkude poolt toodetud keramiid. See sünteesitakse ER-is ja suurem osa sellest eksporditakse Golgi aparaadisse COPII vesiikulite kaudu (13). GPI-AP ER-eksport nõuab spetsiifiliselt pidevat keramiidi sünteesi (14, 15) ja omakorda sõltub keramiidi muundamine inositoolfosfaatkeramiidiks (IPC) Golgi aparaadis GPI ankrusünteesist (16). Biofüüsikalised uuringud tehismembraanidega on näidanud, et väga pika atsüülahelaga keramiidid võivad ühineda, moodustades korrastatud domeene, millel on ainulaadsed füüsikalised omadused (17, 18). Need andmed viivad hüpoteesini, et C26-keramiid ja GPI-AP koos C26-keramiidiga kasutavad oma füüsikalisi omadusi, et ühineda korrapärasteks piirkondadeks või piirkondadeks suhteliselt segases ER-membraani lipiidide keskkonnas. See koosneb peamiselt lühikestest ja küllastumata glütserolipiididest (C16:1 ja C18:1) (19, 20). Need piirkonnad koondatakse valikuliselt spetsiifilistele ER-i väljumiskohtadele (ERES), kus keramiidi ja keramiidipõhist GPI-AP-d saab Golgi aparaadile transportida samas spetsiaalses COPII vesiikulis (5).
Selles uuringus testisime seda lipiidipõhist mehhanismi otseselt, kasutades superresolutsiooniga konfokaalset reaalajas kuvamismikroskoopiat (SCLIM), mis on tipptasemel mikroskoopiatehnika, mis võimaldab samaaegselt jälgida fluorestsentsmärgistatud valke. Kolmevärvilistel ja kolmemõõtmelistel (3D) piltidel on elavates rakkudes äärmiselt kõrge eraldusvõime ja kiirus (21, 22).
Esmalt rakendasime SCLIM-tehnoloogiat, et täpsemalt määratleda, kuidas normaalset GPI-AP-d C26-keramiidrühmaga skriiniti transmembraanselt sekreteeritavatest valkudest pärast ER-ist lahkumist S. cerevisiae-s. ER-i klassifikatsiooni kontrollimiseks kasutasime geneetilist süsteemi, mis suudab in vivo otse visualiseerida ERES-i sisenevat äsjasünteesitud lasti (7, 23). Lastiks valisime C26-keramiidil põhineva GPI-AP Gas1, mis on märgistatud rohelise fluorestseeruva valguga (GFP), ja transmembraanselt sekreteeritava valgu Mid2, mis on märgistatud lähiinfrapunakiirguse fluorestseeruva valguga (iRFP), mis mõlemad on suunatud plasmamembraanile (24–26). Temperatuuritundlikus sec31-1 mutandis ekspresseeritakse neid kahte lasti galaktoosi poolt indutseeritava promootori ja konstitutiivse ERES-markeri all. Äärmuslikul temperatuuril (37 °C), kuna sec31-1 mutatsioon mõjutab COPII kattekomponendi Sec31 funktsiooni COPII idanemise ja ER-i ekspordi pärssimisel, koguneb äsjasünteesitud last ER-i (23). Pärast madalale temperatuurile (24 °C) jahutamist taastusid sec31-1 mutantrakud sekretoorsest piirkonnast ja akumuleerunud uus sünteetiline lasti hakati ER-ist eksportima. CLIM-visualiseerimine näitas, et suurem osa äsja sünteesitud Gas1-GFP-st ja Mid2-iRFP-st akumuleerus pärast inkubeerimist temperatuuril 37 °C ja seejärel 5 minutit temperatuuril 24 °C vabanemist endiselt sec31-1 mutantrakkude ER-is (joonis 1). Kuna Mid2-iRFP on jaotunud kogu ER-membraanile ja Gas1-GFP on kontsentreeritud ja kogunenud katkendlikku ER-membraani piirkonda, on nende jaotus täiesti erinev (joonis 1, A kuni C ja video S1). Lisaks, nagu on näidatud joonisel 1D, ei ole Gas1-GFP klastris Mid2-iRFP-d. Need tulemused näitavad, et GPI-AP ja transmembraansed valgud eraldati varakult erinevateks ER-membraani piirkondadeks. Gas1-GFP klaster asub spetsiifilise ERES-i kõrval, mis on märgistatud mCherry COPII kattevalguga Sec13 (joonis 1, E ja F ning video S1) (23).
sec31-1 rakud ekspresseerivad galaktoosi poolt indutseeritud sekretsioone, pika atsüülahelaga (C26) keramiidi GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, roheline) ja transmembraanset valku Mid2-iRFP (TMP, sinine) ning seda konstruktiivset ERES-märgistust kasutavat Sec13-mCherry (ERES, magenta) inkubeeriti temperatuuril 37 °C 30 minutit, viidi temperatuurini 24 °C ja pildistati SCLIM-iga 5 minutit hiljem. (A kuni C) näitab tasapinna (A) tüüpilist ühendatud või ühte 2D-pilti, 10 z-sektsiooni 2D-projektsioonipilti (B) või lasti ja ERES-markerite 3D-raku poolkera pilti (C). Skaalariba 1 μm (A ja B). Skaalaühik on 0,551 μm (C). Gas1-GFP tuvastati diskreetsetes ER-piirkondades või -klastrites, samas kui Mid2-iRFP tuvastati ja jaotus kogu ER-membraanis (C). (D) Graafik näitab Gas1-GFP ja Mid2-iRFP suhtelist fluorestsentsi intensiivsust Gas1-GFP klastris mööda valget noolejoont (vasakul). AU, suvaline ühik. (E ja F) tähistavad 3D-pilti, mis ühendab kaubad ja ERES-märgi. Gas1-GFP klastrid tuvastati konkreetse ERES-i lähedal. Skaalaühik on 0,551 μm. (F) Valge pidev nool tähistab ERES-iga seotud Gas1-GFP klastrit. Keskmine ja parempoolne paneel näitavad valitud Gas1-GFP klastri ühendatud suurendatud 3D-pilti ja pööratud vaadet.
Gas1-GFP klastri ja konkreetse ERES-i vaheline tihe ruumiline seos näitab, et Gas1-GFP saab siseneda selektiivsesse ERES-i, mis erineb Mid2-iRFP poolt ER-ist lahkumiseks kasutatavast selektiivsusest. Selle võimaluse käsitlemiseks kvantifitseerisime ERES-i suhtarvu ainult ühe või kahe kauba puhul (joonis 2, A kuni C). Leidsime, et enamik ERES-e (70%) sisaldab ainult ühte tüüpi lasti. Joonise 2C alumine pilt näitab kahte tüüpilist ERES-i näidet, kus on ainult Gas1-GFP (joonis 1) või ainult Mid2-iRFP (joonis 2). Seevastu umbes 20% ERES-ist sisaldab kahte lasti, mis kattuvad samas piirkonnas. Leiti, et mõned ERES-id (10%) sisaldasid kahte tüüpi lasti, kuid need olid isoleeritud selgelt erinevates piirkondades. Seega näitab see statistiline analüüs, et pärast ER-i eksporti jagunevad GPI-AP Gas1-GFP ja transmembraanne last Mid2-iRFP erinevateks ERES-ideks (joonis 2D). See sorteerimise efektiivsus on väga kooskõlas varasema biokeemilise analüüsi (6) ja morfoloogilise määramisega (7). Samuti saame jälgida karantiini pandud lasti käitumist ERES-i sisenemisel (joonis 2E ja video S2). Joonis 2E näitab, et ainult väike osa Gas1-GFP-st (paneel 3) või Mid2-iRFP-st (paneel 4) siseneb ERES-i ühelt poolt ja on piiratud eraldi alaga. Joonise 2E paneel 5 näitab, et Gas1-GFP ja Mid2-iRFP esinevad mõnikord samas ERES-is, kuid nad sisenevad erinevatest külgedest ja on koondunud eraldi piirkondadesse, mis võivad esindada erinevaid COPII vesiikuleid. Samuti kinnitasime, et C26 keramiidil põhineva GPI-AP Gas1 eraldumine ja klassifitseerimine selektiivseks ERES-iks on spetsiifiline, kuna teine ​​transmembraanne sekretsioonilast, GFP-märgistatud plasmamembraani valk Axl2 (27), näitab sarnast käitumist Mid2-iRFP-ga. (pilt S1 ja video S3). Äsjasünteesitud Axl2-GFP jaotub läbi ER-membraani nagu Mid2-iRFP (joonis S1, A ja B) ning on enamikus ERES-ides Mid2-iRFP-ga kolokaliseerunud (joonis S1, B kuni D). Joonise 1 paneelid 1 ja 2. Joonis S1C näitab kahte tüüpilist ERES-i näidet, kus kaks transmembraanset lasti kattuvad. Sellistel juhtudel sisenevad mõlemad kaubad ERES-i koos (joonis S1E, paneel 3 ja video S3).
Galaktoosi poolt indutseeritavaid sekreete ekspresseerivad sec31-1 rakud, Gas1-GFP (GPI-AP, roheline) ja Mid2-iRFP (TMP, sinine) ning konstitutiivne ERES-märgistus Sec13-mCherry (ERES, magenta), viidi temperatuurile 37 °C. Pärast 30-minutilist inkubeerimist temperatuuril °C viidi temperatuur 24 °C-ni, et vabastada sekretsiooniblokk, ja pildistati SCLIM-iga 20 minuti pärast. (A kuni C) Lasti ja 10 ERES-iga tähistatud z-sektsiooni tüüpilised 2D-projektsioonipildid (A; skaalariba, 1 μm) või 3D-rakkude poolkerapildid (B ja C; skaalaühik, 0,456 μm). Alumine paneel joonisel (B) ja paneel joonisel (C) näitavad töödeldud pilte, et kuvada ainult ERES-is olevaid kaupu (magenta) [Gas1-GFP (hall) ja Mid2-iRFP (helesinine)]. (C) Avatud nool: ERES veab ainult ühte lasti (1 kuni 4). Hall nool: ERES sisaldab eraldatud lasti (5). Valge pidev nool: ERES sisaldab kaaspaigutatud lasti. Allpool: Valitud üksik ERES sisaldab ainult Gas1-GFP-d (1) või Mid2-iRFP-d (2). Skaalariba, 100 nm. (D) Punktis (C) kirjeldatud mikrofoto kvantifitseerimine. Keskmine protsent ERES-ist, mis sisaldab ainult ühte lasti (Gas1-GFP või Mid2-iRFP), eraldatud lasti ja kattuvat lasti. Kolmes sõltumatus katses oli n = 432 54 rakus. Veariba = standardhälve. Kahesuunaline paaritu t-test. *** P = 0,0002. (E) Karantiini pandud lasti valitud ERES-i 3D-pilt, mis on tähistatud (C)-ga. Gas1-GFP (roheline) (3) või Mid2-iRFP (sinine) (4) siseneb ERES-i (magenta) ühelt poolt ja piirdub väikese alaga ERES-is. Mõnikord sisenevad mõlemad lastitüübid samasse ERES-i (5) samalt poolt ja piirduvad ERES-i isoleeritud alaga. Skaalariba, 100 nm.
Järgmisena testisime hüpoteesi, et ER-membraanis olev pika atsüülahelaga keramiid (C26) juhib Gas1 spetsiifilist klasterdumist ja sorteerimist selektiivseteks ERES-ideks. Selleks kasutasime modifitseeritud pärmitüve GhLag1, milles kaks endogeenset keramiidi süntaasi Lag1 ja Lac1 olid asendatud GhLag1-ga (puuvilla Lag1 homoloog), mille tulemuseks oli pärmitüvi, mille rakumembraani keramiidi tüvi oli lühem kui metsiktüübil (joonis 3A) (28). Massispektromeetria (MS) analüüs näitas, et metsiktüüpi tüvedes on 95% kogu keramiidist väga pika (C26) ahelaga keramiid, samas kui GhLag1-s on 85% keramiidist väga pika (C18 ja C16) ahelaga keramiid, ainult 2% keramiidist on väga pika (C26) ahelaga keramiid. Kuigi C18 ja C16 keramiidid on seni GhLag1 membraanis tuvastatud peamised keramiidid, kinnitas MS-analüüs ka seda, et GhLag1 tüves ekspresseeritud Gas1-GFP GPI ankur sisaldab C26 keramiidi, mis on võrreldav metsiktüüpi lipiididega. Kvaliteet on sama (joonis 3A) (26). Seega tähendab see, et keramiidi remodelleeriv ensüüm Cwh43 on C26 keramiidi suhtes väga selektiivne, nagu on näidatud joonisel 26, lisab see eelistatavalt GPI ankru väikesest kogusest C26 keramiidist GhLag1 tüves. S2 (29). Sellest hoolimata sisaldab GhLag1 rakumembraan põhimõtteliselt ainult C18-C16 keramiidi, samas kui Gas1-GFP-l on endiselt C26 keramiid. See asjaolu muudab selle tüve ideaalseks tööriistaks membraani keramiidi atsüülahela pikkuse probleemi lahendamiseks ER-is. Klassi ja sorteerimise hüpoteetiline roll. Seejärel uurisime esmalt tavapärase fluorestsentsmikroskoopia abil C26 Gas1-GFP võimet akumuleeruda klastritesse GhLag1-s, millel on sec31-1 temperatuuritundlik mutantne alleel, kus ER-membraani keramiidis leidub ainult pikk (C18-C16) ahel (joonis 3). Täheldasime, et sec31-1-s oli suurem osa Gas1-GFP-st koondunud klastritesse, samas kui Gas1-GFP sec31-1 GhLag1-s, millel oli pikk (C18-C16) keramiid, ei olnud enamasti klastritesse koondunud ja oli jaotunud kogu ER-membraanile. Täpsemalt öeldes, kuna C26 keramiidil põhinev klastrite moodustumine on tihedalt seotud spetsiifilise ERES-iga (joonis 1), uurisime seejärel, kas see protsess võib hõlmata ka ER-eksportvalgu mehhanismi funktsiooni. GPI-AP kasutab ER-ekspordiks spetsiaalset COPII süsteemi, mida reguleerib aktiivselt Ted1 GPI ankru glükaani osa struktuuriline ümberehitus (30, 31). Seejärel tunneb transmembraanne lastiretseptori p24 kompleks ära rekombinantse GPI-glükaani, mis omakorda värbab selektiivselt Lst1, mis on COPII peamise lasti sidumise subühiku Sec24 spetsiifiline isovorm, moodustades GPI-AP-rikka COPII vesiikulid (31-33). Seetõttu konstrueerisime topeltmutandi, mis ühendas nende üksikute valkude (p24 kompleksi komponent Emp24, GPI-glükaani remodelleeriv ensüüm Ted1 ja spetsiifiline COPII subühik Lst1) deletsiooni sec31-1 mutantse tüvega ning uurisime, kas neid on võimalik moodustada Gas1-klastri GFP-na (joonis 3). Täheldasime, et sec31-1emp24Δ ja sec31-1ted1Δ puhul on Gas1-GFP peamiselt klasterdamata ja jaotunud kogu ER-membraanile, nagu varem näha sec31-1 GhLag1 puhul, samas kui sec31-1lst1Δ puhul on Gas1-GFP sarnane sec31-1-ga. Need tulemused näitavad, et lisaks C26-tseramiidi olemasolule ER-membraanis peab Gas1-GFP klastrite moodustumine seonduma ka p24 kompleksiga ega vaja spetsiifilist Lst1 värbamist. Seejärel uurisime võimalust, et keramiidi ahela pikkus ER-membraanis saab reguleerida Gas1-GFP seondumist p24-ga. Siiski leidsime, et C18-C16-tseramiidi olemasolu membraanis ei mõjuta p24 kompleksi poolt rekonstrueeritud GPI-glükaane (joonis S3 ja S4, A ja B) ega seondumist GPI-AP-ga ja GPI-AP eksportimise võimet. COPII alatüübi Lst1 värbamine (joonis S4C). Seega ei vaja C26-tseramiidist sõltuv klastrite moodustumine valkude interaktsioone erinevate ER-eksportvalkude mehhanismidega, vaid toetab alternatiivset sorteerimismehhanismi, mida juhib lipiidide pikkus. Seejärel analüüsisime, kas keramiidi atsüülahela pikkus ER-membraanis on oluline Gas1-GFP efektiivseks klassifitseerimiseks selektiivseks ERES-iks. Kuna lühikese ahelaga keramiidiga GhLag1 tüve Gas1 lahkub ER-ist ja siseneb plasmamembraani (joonis S5), usume, et kui sorteerimist juhib keramiidi atsüülahela pikkus, saab GhLag1 tüve Gas1 ümber suunata ja ületada. ERES-kaubad sama membraaniga.
(A) GhLag1 rakumembraan sisaldab peamiselt lühemaid C18-C16 keramiide, samas kui Gas1-GFP GPI ankrul on endiselt sama C26 IPC kui metsiktüüpi rakkudel. Ülal: metsiktüüpi (Wt) ja GhLag1p tüvede rakumembraanis oleva keramiidi atsüülahela pikkuse analüüs massispektromeetria (MS) abil. Andmed esindavad kogu keramiidi protsenti. Kolme sõltumatu katse keskmine. Veariba = SD. Kahepoolne paaritu t-test. **** P <0,0001. Alumine paneel: Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI ankrus esineva IPC atsüülahela pikkuse MS-analüüs metsiktüüpi ja GhLag1p tüvedes. Andmed esindavad kogu IPC signaali protsenti. Viie sõltumatu katse keskmine. Veariba = SD. Kahepoolne paaritu t-test. ns, pole oluline. P = 0,9134. (B) Galaktoosi poolt indutseeritud Gas1-GFP-d ekspresseerivate sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ ja sec31-1lst1Δ rakkude fluorestsentsmikroskoobid inkubeeriti temperatuuril 37 °C 30 minutit ja viidi seejärel 24 °C pärast tavapärase fluorestsentsmikroskoopia läbi. Valge nool: ER Gas1-GFP klaster. Tühja noolega: klastriteta Gas1-GFP on jaotunud kogu ER membraanile, näidates ER-ile iseloomulikku tuumarõnga värvumist. Skaalariba, 5 μm. (C) Punktis (B) kirjeldatud mikrofoto kvantifitseerimine. Punktilise Gas1-GFP struktuuriga rakkude keskmine protsent. Kolmes sõltumatus katses n≥300 rakku. Veariba = standardhälve. Kahesuunaline paaritu t-test. **** P <0,0001.
Selle probleemi otseseks lahendamiseks viisime läbi Gas1-GFP ja Mid2-iRFP SCLIM-visualiseerimise GhLag1-s koos sec31-1 temperatuuritundliku mutantse alleeliga (joonis 4 ja lisavideo S4). Pärast seda, kui ER-i hoiti temperatuuril 37 °C ja seejärel vabastati temperatuuril 24 °C, ei olnud suurem osa äsjasünteesitud Gas1-GFP-st klasterdunud ega jaotunud üle ER-membraani, nagu tavapäraste mikroskoopidega täheldati (joonis 4, A ja B). Lisaks sisaldab suur osa ERES-ist (67%) kahte tüüpi lasti, mis selles paiknevad koos (joonis 4D). Joonise 4C paneelid 1 ja 2 näitavad kahte tüüpilist ERES-i näidet kattuvate Gas1-GFP ja Mid2-GFP-ga. Lisaks värvati mõlemad kaubad samasse ERES-i (joonis 4E, paneel 3 ja lisavideo S4). Seega näitavad meie tulemused, et keramiidatsüülahela pikkus ER-membraanis on ER-valkude agregatsiooni ja klassifitseerimise oluline määraja.
Galaktoosi poolt indutseeritud sekreeti ekspresseerivad Sec31-1 GhLag1 rakud, Gas1-GFP (GPI-AP, roheline) ja Mid2-iRFP (TMP, sinine) ning konstitutiivne ERES-märgistatud Sec13-mCherry (ERES, magenta). Inkubeerige temperatuuril 37 °C. Jätkake 30 minutit, langetage temperatuur 24 °C-ni, et sekreet vabastada, ja pildistage SCLIM-iga 20 minuti pärast. (A kuni C) Tüüpilised 2D projektsioonipildid (A; skaalariba, 1 μm) või 3D rakkude poolkera pildid (B ja C; skaalaühik, 0,45 μm) 10 z-sektsioonist, mis on tähistatud lasti ja ERES-iga. Alumine paneel joonisel (B) ja paneel joonisel (C) kuvavad töödeldud pilte, et kuvada ainult ERES-is (magenta) esinevaid kaupu [Gas1-GFP (hall) ja Mid2-iRFP (helesinine)]. (C) Valgega täidetud nool: ERES, kaubad kattuvad. Tühja noolega: ERES sisaldab ainult ühte eset. Alumine paneel: Valitud ERES-il on kattuvad kaubad (1 ja 2), mis on märgitud (C)-ga. Skaalariba, 100 nm. (D) Punktis (C) kirjeldatud mikrofoto kvantifitseerimine. sec31-1 ja sec31-1 GhLag1 ühikutes on kaasatud ainult üks last (Gas1-GFP või Mid2-iRFP) ning ERES-i keskmine protsent isoleeritud lasti ja kattuva lasti kohta. Kolmes sõltumatus katses oli n = 432 54 rakus (sec31-1) ja n = 430 47 rakus (sec31-1 GhLag1). Veariba = standardhälve. Kahesuunaline paaritu t-test. *** P = 0,0002 (sec31-1) ja ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Valitud ERES-i 3D-pilt kattuva lastiga (3), mis on märgitud (C). Gas1-GFP (roheline) ja Mid2-iRFP (sinine) lähenevad ERES-ile (magenta) samalt küljelt ja jäävad samasse ERES-i piiratud alasse. Skaalariba, 100 nm.
See uuring annab otseseid in vivo tõendeid selle kohta, et lipiidipõhised valgulastid klassifitseeritakse sekretoorses rajas selektiivsetesse ekspordikohtadesse ja näitab atsüülahela pikkuse olulisust klassifitseerimise selektiivsuse seisukohast. Kasutades võimsat ja tipptasemel mikroskoopiatehnikat nimega SCLIM, demonstreerisime pärmis äsjasünteesitud Gas1-GFP-d (peamine plasmamembraani GPI-AP, millel on väga pikk atsüülahela (C26) keramiidi lipiidi osa). Diskreetsetes ER-ides klastritesse koondunud piirkonnad on seotud spetsiifiliste ERES-idega, samas kui transmembraanselt sekreteeritud valgud on jaotunud kogu ER-membraani ulatuses (joonis 1). Lisaks sisenevad need kaks tüüpi kaupu selektiivselt erinevatesse ERES-idesse (joonis 2). Rakulise keramiidi atsüülahela pikkus membraanis väheneb C26-lt C18-C16-le, Gas1-GFP klaster katkestatakse diskreetseks ER-piirkonnaks ja Gas1-GFP suunatakse ümber, et lahkuda ER-ist koos transmembraanse valguga sama ERES-i kaudu (joonis 3 ja joonis 34).
Kuigi GPI-AP kasutab ER-ist väljumiseks spetsiaalset valgumehhanismi, leidsime, et C26 keramiidist sõltuv eraldamine ei tugine valkude diferentsiaalsetele interaktsioonidele, mis võivad viia ERES-i spetsialiseerumiseni (joonis S4 ja S5). Selle asemel toetavad meie tulemused alternatiivset klassifitseerimismehhanismi, mida juhib lipiidipõhine valguklasterdamine ja sellele järgnev teiste lastide välistamine. Meie tähelepanekud näitavad, et konkreetse ERES-iga seotud Gas1-GFP piirkonnas või klastris puudub transmembraanselt sekreteeritav valk Mid2-iRFP, mis näitab, et C26 keramiidist sõltuv GPI-AP klaster hõlbustab nende sisenemist vastavasse ERES-i ja samal ajal välistab transmembraanselt sekreteeritavad valkud sellesse konkreetsesse ERES-i (joonis 1 ja 2). Seevastu C18-C16 keramiidide olemasolu ER-membraanis ei põhjusta GPI-AP piirkondade ega klastrite moodustumist, seega ei välista ega asenda nad transmembraanselt sekreteeritavaid valke samas ERES-is (joonis 3 ja 4). Seetõttu pakume välja, et C26-keramiid soodustab eraldamist ja klassifitseerimist, hõlbustades spetsiifiliste ERES-idega seotud valkude klastrite moodustumist.
Kuidas saavutada seda C26 keramiidist sõltuvat klastrite moodustumist kindlasse ER-piirkonda? Membraankeramiidi kalduvus lateraalselt eralduda võib põhjustada GPI-AP ja C26 keramiidi väikeste ja koheselt korrastatud lipiidide moodustumist ER-membraani ebakorrapärasemas lipiidikeskkonnas, mis sisaldab lühemaid ja küllastumata glütserolipiide. Kvaliteetsed klastrid (17, 18). Neid väikeseid ajutisi klastreid saab pärast p24 kompleksiga seondumist veelgi suuremateks ja stabiilsemateks klastriteks liita (34). Sellega kooskõlas näitasime, et C26 Gas1-GFP peab suuremate nähtavate klastrite moodustamiseks interakteeruma p24 kompleksiga (joonis 3). p24 kompleks on heterosügootne oligomeer, mis koosneb pärmis neljast erinevast p24 transmembraansest valgust (35), mis tagab mitmevalentse sidumise, mis võib viia väikeste GPI-AP klastrite ristseostumiseni, genereerides seeläbi suurema stabiilse klastri (34). GPI-AP valkude ektodomeenide vaheline interaktsioon võib samuti kaasa aidata nende agregatsioonile, nagu on näidatud nende Golgi transpordi ajal imetajate polariseeritud epiteelirakkudes (36). Kui aga ER-membraanis on C18-C16 keramiid ja p24 kompleks seondub Gas1-GFP-ga, siis suuri eraldi klastreid ei moodustu. Selle aluseks olev mehhanism võib sõltuda pika atsüülahelaga keramiidi spetsiifilistest füüsikalistest ja keemilistest omadustest. Kunstmembraanide biofüüsikalised uuringud näitavad, et kuigi nii pika (C24) kui ka lühikese (C18-C16) atsüülahelaga keramiidid võivad põhjustada faaside eraldumist, suudavad ainult pika atsüülahelaga keramiidid (C24) soodustada suurt kumerust ja kile painutamist, et kile kuju muuta. Vastastikuse võrdluse kaudu (17, 37, 38). On näidatud, et TMED2, Emp24 inimese homoloogi transmembraanne heeliks interakteerub selektiivselt C18 keramiidil põhineva sfingomüeliiniga tsütoplasmaatilistes lobulites (39). Molekulaardünaamika (MD) simulatsioonide abil leidsime, et nii C18 kui ka C26 keramiidid akumuleeruvad Emp24 transmembraanse heeliksi tsütoplasmaatiliste lobulite ümber ja neil on sarnased eelistused (joonis S6). Väärib märkimist, et see näitab, et Emp24 transmembraanne heeliks võib viia lipiidide asümmeetrilise jaotumiseni membraanis. See on hiljutine imetajarakkudel põhinev tulemus. Sarnased MD simulatsioonid näitavad ka eetrilipiidide olemasolu (40). Seetõttu oletame, et C26 keramiid ER26 kahes lobulis on lokaalselt rikastatud. Kui GPI-AP luminaalsetes lobulites seondub otse multivalentse p24-ga ja C26 keramiidi akumuleerumine p24 ümber tsütoplasmaatilistes lobulites, võib see soodustada kaasnevat valkude agregatsiooni ja membraani kõverust, mis tekib sõrmede kaudu (41), põhjustades GPI-AP eraldumise ERES-i kõrval asuvateks eraldi piirkondadeks, mis soodustab ka ER-membraani tugevalt kõveraid piirkondi (42). Varasemad aruanded toetasid pakutud mehhanismi (43, 44). Oligolektiinide, patogeenide või antikehade multivalentne seondumine keramiidipõhiste glükosfingolipiididega (GSL) plasmamembraanil käivitab suure GSL-i agregatsiooni, suurendab faaside eraldumist ning põhjustab membraani deformatsiooni ja internaliseerumist (44). Iwabuchi jt (43) Leiti, et pikkade (C24), kuid mitte lühikeste (C16) atsüülahelate juuresolekul indutseeris GSL-laktosüültseramiidiga seotud multivalentne ligand suurte klastrite moodustumist ja membraani invaginatsiooni ning tsütoplasmas Lyn-vahendatud signaaliülekanne voldikutel on omavahel põimitud seotud neutrofiilide atsüülahelatega.
Imetajate polariseeritud epiteelirakkudes kontrollib anti-Golgi võrgustiku (TGN) kontsentratsioon apikaalse plasmamembraani tasemel GPI-AP eraldamist ja sorteerimist (10, 45). Seda agregatsiooni juhib GPI-AP oligomerisatsioon (36), kuid see võib sõltuda ka pärmis leiduva keramiidi ahela pikkusest. Kuigi imetajate GPI-AP-l on eetrilipiidil põhinev ankur ja selle keemiline struktuur erineb väga pika atsüülahelaga keramiidist, leidis hiljutine uuring, et mõlemal lipiidil on evolutsiooniliselt sarnased füüsikalised ja keemilised omadused ja funktsioon (40). Seega võib imetajate rakkude eetrilipiidi osa olla sarnane pärmi C26-keramiidiga ja selle roll on seostuda membraanis oleva pika ahelaga keramiidiga, et soodustada GPI-AP agregatsiooni ja sorteerimist. Kuigi seda võimalust tuleb veel otseselt testida, toetavad varasemad leiud, et pika atsüülahelaga keramiidi transporti Golgi kehasse ei teosta tsütoplasmaatilised ülekandevalgud, vaid see sõltub GPI ankrute sünteesist nagu pärm. Seega näib evolutsiooniline konservatiivne mehhanism olevat võimeline selektiivselt transportima väga pika atsüülahelaga keramiidi ja GPI-AP-d (13, 16, 20, 46, 47) samas transpordivesiikulis.
Pärmi ja imetajate polariseeritud epiteelirakkude süsteemides toimub GPI-AP agregatsioon ja eraldumine teistest plasmamembraani valkudest enne rakupinnale jõudmist. Paladino jt (48) leidsid, et imetajate polariseeritud epiteelirakkude transiitmembraanil (TGN) ei ole GPI-AP klasterdumine vajalik mitte ainult GPI-AP-de selektiivseks klassifitseerimiseks apikaalsele plasmamembraanile, vaid reguleerib ka GPI-AP-de klasterdumise organisatsiooni ja selle bioloogilist aktiivsust. Rakupind. Pärmis näitas see uuring, et C26 keramiidist sõltuv GPI-AP klaster ER-il saab reguleerida GPI-AP klastri organisatsiooni ja funktsionaalset aktiivsust plasmamembraanil (24, 49). Selle mudeli kohaselt on GhLag1 rakud allergilised GPI inhibiitorite või ravimite suhtes, mis mõjutavad rakuseina terviklikkust (28), ja vajadus funktsionaalsete Gas1-GFP klastrite (49) järele, mis projitseeruvad pärmirakkude paaritumisel tippkeramiidi G-rakkude võimalike füsioloogiliste tagajärgede suhtes. GPI-AP viga. Siiski on meie tulevaste uuringute teemaks edasine testimine, kas rakupinna funktsionaalne korraldus on ER-ist programmeeritud lipiidide pikkusel põhineva sorteerimismeetodi abil.
Selles töös kasutatud Saccharomyces cerevisiae tüved on loetletud tabelis S1. Elusrakkude pildistamiseks mõeldud SCLIM tüved MMY1583 ja MMY1635 konstrueeriti W303 taustal. Need fluorestsentsvalgu märgisega Sec13-mCherryt ekspresseerivad tüved konstrueeriti polümeraasi ahelreaktsioonil (PCR) põhineva meetodi abil, kasutades matriitsina pFA6a plasmiidi (23). GAL1 promootori kontrolli all fluorestsentsvalguga märgistatud Mid2-iRFP-d ekspresseeriv tüvi konstrueeriti järgmiselt. pKTiRFP-KAN vektorist (E. O'Shea kingitus, Addgene plasmiidi number 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; uurimisressursi identifikaator (RRID): Addgene_64687) pärineva iRFP-KanMx järjestuse PCR amplifikatsioon ja sisestamine endogeense Mid2 C-otsa. Pärast Mid2-iRFP genoomijärjestuse amplifitseerimist ja GAL1 promootorisse kloonimist integreeriti see integratsiooniplasmiidi pRS306 Not I-Sac I saiti. Saadud plasmiid pRGS7 lineariseeriti Pst I-ga, et integreerida see URA3 lookusesse.
Gas1-GFP fusioongeen ekspresseeritakse GAL1 promootori kontrolli all tsentromeeri (CEN) plasmiidis, mis on konstrueeritud järgmiselt. Gas1-GFP järjestus amplifitseeriti PCR-i abil pRS416-GAS1-GFP plasmiidist (24) (L. Popolo kingitus) ja klooniti CEN plasmiidi pBEVY-GL LEU2 (C kingitus) Xma I–Xho I saiti. Miller; Addgene plasmiidi number 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Saadud plasmiidile pandi nimeks pRGS6. Axl2-GFP fusioongeen ekspresseeritakse samuti pBEVY-GL LEU2 vektori GAL1 promootori kontrolli all ja selle konstruktsioon on järgmine. Axl2-GFP järjestus amplifitseeriti PCR-i abil pRS304-p2HSE-Axl2-GFP plasmiidist (23) ja klooniti pBEVY-GL LEU2 vektori Bam HI-Pst I saiti. Saadud plasmiidile pandi nimeks pRGS12. Selles uuringus kasutatud oligonukleotiidide järjestus on loetletud tabelis S2.
Tüvele lisati süsinikuallikana 0,2% adeniini ja 2% glükoosi [YP-dekstroos (YPD)], 2% rafinoosi [YP-rafinoos] rikka pärmiekstrakti valgu p (YP) söötme (1% pärmiekstrakti ja 2% valgu ept. (YPR)] või 2% galaktoosi [YP-galaktoos (YPG)] või sünteetilist minimaalsöötmet (0,15% pärmi lämmastikalust ja 0,5% ammooniumsulfaati), et täiendada toitumiseks vajalikke aminohappeid ja aluseid, ning see sisaldas süsinikuallikana 2% glükoosi (sünteetiline glükoosi minimaalne söötme) või 2% galaktoosi (sünteetiline galaktoosi minimaalne söötme).
Reaalajas pildistamiseks kasvatati temperatuuritundlikke sec31-1 mutantrakke, mis ekspresseerisid konstrukti GAL1 promootori all, YPR söötmes temperatuuril 24 °C üleöö kuni logaritmilise faasi keskpaigani. Pärast indutseerimist YPG-s temperatuuril 24 °C 1 tunni jooksul inkubeeriti rakke SG-s temperatuuril 37 °C 30 minutit ja seejärel viidi need 24 °C-ni, et vabaneda sekretsiooniblokist. Rakkude fikseerimiseks klaasslaidile ja pildistamiseks kasutati konkanavaliin A-d. SCLIM on kombinatsioon Olympus IX-71 inverteeritud fluorestsentsmikroskoobist ja UPlanSApo 100×1,4 numbrilise apertuuriga õliläätsest (Olympus), kiirest ja kõrge signaali-müra suhtega pöörleva ketta konfokaalsest skannerist (Yokogawa Electric), kohandatud spektromeetrist ja kohandatud jahutusest. Süsteemi pildivõimendi (Hamamatsu Photonics) suudab pakkuda suurendusläätsede süsteemi lõppsuurendusega ×266,7 ja laengsidestatud kaamerat, mis paljundab elektrone (Hamamatsu Photonics) (21). Kujutiste omandamine toimub kohandatud tarkvara abil (Yokogawa Electric). 3D-piltide jaoks kasutasime objektiivi vertikaalseks vibreerimiseks kohandatud piesoelektrilist ajamit ja kogusime optilised osad 100 nm kaugusel üksteisest virna. Z-virna pilt teisendatakse 3D-vokselandmeteks ja pöörleva ketta konfokaalse mikroskoobi jaoks kasutatavat teoreetilist punkti hajumise funktsiooni kasutatakse dekonvolutsioonitöötluseks Volocity tarkvara (PerkinElmer) abil. Kasutades Volocity tarkvara kolokatsioonianalüüsi automaatseks läviväärtuste määramiseks, mõõdeti ERES-i, sealhulgas lasti. Joone skaneerimise analüüs viidi läbi MetaMorph tarkvara (Molecular Devices) abil.
Statistilise olulisuse määramiseks kasutage GraphPad Prism tarkvara. Kahepoolse Studendi t-testi ja tavalise ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) testi puhul loetakse rühmadevahelisi erinevusi oluliseks mõjuks P <0,05 (*).
Gas1-GFP fluorestsentsmikroskoopia jaoks kasvatati log-faasi rakke üleöö YPD-s ja koguti tsentrifuugimise teel, pesti kaks korda fosfaatpuhverdatud soolalahusega ja inkubeeriti jääl vähemalt 15 minutit ning seejärel uuriti mikroskoobi all, nagu eelnevalt kirjeldatud (24). Andmete omandamiseks kasutati Leica DMi8 mikroskoopi (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS), mis oli varustatud objektiivi, L5 (GFP) filtri, Hamamatsu kaamera ja Application Suite X (LAS X) tarkvaraga.
Proove denatureeriti SDS-proovipuhvriga temperatuuril 65 °C 10 minutit ja seejärel eraldati SDS-polüakrüülamiidgeelelektroforeesil (PAGE). Immunoblotanalüüsiks laaditi 10 μl proovi raja kohta. Primaarne antikeha: Kasutati küüliku polüklonaalset anti-Gas1 lahjenduses 1:3000, küüliku polüklonaalset anti-Emp24 lahjenduses 1:500 ja küüliku polüklonaalset anti-GFP (kingitus H. Riezmanilt) lahjenduses 1:3000. Hiire monoklonaalset anti-Pgk1 antikeha kasutati lahjenduses 1:5000 (kingitus J. de la Cruzilt). Sekundaarne antikeha: Mädarõika peroksidaasiga (HRP) konjugeeritud kitse anti-küüliku immunoglobuliin G (IgG) lahjenduses 1:3000 (Pierce). HRP-konjugeeritud kitse anti-hiire IgG-d kasutati lahjenduses 1:3000 (Pierce). Immuunvastuse tsooni jälgiti SuperSignal West Pico reagendi (Thermo Fisher Scientific) kemoluminestsentsmeetodil.
Nagu kirjeldatud artiklis (31), viidi rikastatud ER-fraktsioonil läbi loomuliku immunosadestamise katse. Lühidalt, pärmirakke pesti TNE puhvriga [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenüülmetüülsulfonüülfluoriidi ja proteaasi inhibiitori segu) lainepikkusel 600 nm (OD600) ja optilise tihedusega 100 kaks korda. See purustati klaashelmestega ja seejärel eemaldati rakkude jäänused ja klaashelmed tsentrifuugimise teel. Seejärel tsentrifuugiti supernatanti kiirusel 17 000 g 15 minutit temperatuuril 4 °C. Pellet resuspendeeriti TNE-s ja lisati digitaalise saponiini lõppkontsentratsioonini 1%. Suspensiooni inkubeeriti pöörleva suspensiooni abil 1 tund temperatuuril 4 °C ja seejärel eemaldati lahustumatud komponendid tsentrifuugimise teel kiirusel 13 000 g temperatuuril 4 °C 60 minutit. Gas1-GFP immunosadestamise jaoks eelinkubeerige proovi esmalt tühjade agaroosigraanulitega (ChromoTek) temperatuuril 4 °C 1 tund ja seejärel inkubeerige GFP-Trap_A-ga (ChromoTek) temperatuuril 4 °C 3 tundi. Immunosadestatud graanuleid pesti viis korda TNE-ga, mis sisaldas 0,2% digoksigeniini, elueeriti SDS-proovipuhvriga, lahutati SDS-PAGE-il ja analüüsiti immunoblotanalüüsi abil.
Nagu kirjeldatud artiklis (31), viidi ristseostumise määramine läbi rikastatud ER-fraktsioonil. Lühidalt, rikastatud ER-fraktsiooni inkubeeriti 0,5 mM ditiobis(suktsiinimidüülpropionaadiga) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20 °C, 20 min). Ristseostumise reaktsioon peatati glütsiini lisamisega (lõppkontsentratsioon 50 mM, 5 minutit, 20 °C).
Nagu eelnevalt kirjeldatud (50), viidi läbi metsiktüüpi ja GhLag1 tüvede keramiidi MS-analüüs. Lühidalt, rakke kasvatati eksponentsiaalse faasini (3 kuni 4 OD600 ühikut/ml) YPD-s temperatuuril 30 °C ja koguti 25 × 107 rakku. Nende metabolism peatati trikloroäädikhappega. Kasutati ekstraheerimislahustit [etanool, vesi, eeter, püridiin ja 4,2 N ammooniumhüdroksiid (15:15:5:1:0,018 v/v)] ja 1,2 nmol sisemist standardit C17 keramiidi (860517, Avanti polaarne lipiid) kvaliteediga). Ekstrakti kergelt aluselise hüdrolüüsi läbiviimiseks kasutati monometüülamiinreagenti [metanool, vesi, n-butanool ja metüülamiini lahus (4:3:1:5 v/v)] ja seejärel soolade eemaldamiseks kasutati veega küllastunud n-butanooli. Lõpuks suspendeeriti ekstrakt uuesti positiivse režiimi lahustis [kloroform/metanool/vesi (2:7:1) + 5 mM ammooniumatsetaat] ja süstiti massispektromeetrisse. Sfingolipiidide molekulide identifitseerimiseks ja kvantifitseerimiseks viidi läbi mitme reaktsiooni jälgimine (MRM). TSQ Vantage tertsiaarne kvadrupoolmassispektromeeter (Thermo Fisher Scientific) on varustatud lipiidide analüüsimiseks robotiseeritud nanovooluioonallikaga Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY). Kokkupõrkeenergia on iga keramiidi kategooria jaoks optimeeritud. MS-andmed saadi positiivses režiimis. Iga bioloogilise korduse puhul on lipiidisignaal kolme sõltumatu mõõtmise mediaan.
Nagu kirjeldatud (31), allutati Gas1-GFP-d ekspresseerivatele rakkudele (800 × 107) loomulikule immunosadestamisele. Puhastatud Gas1-GFP eraldati SDS-PAGE abil ja kanti polüvinülideenfluoriid (PVDF) membraanile. Valk visualiseeriti PVDF-i värvimisega amiidmustaga. Gas1-GFP riba lõigati PVDF-ist välja ja pesti 5 korda metanooliga ning üks kord vedelikkromatograafia-MS (LC-MS) kvaliteediga veega. Membraaniriba inkubeerimisel 500 μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), puhvri ja 500 μl värskelt lahustatud 1 M naatriumnitriti seguga temperatuuril 37 °C 3 tunni jooksul vabaneb lipiidifraktsioon Gas1-GFP-st ja lüüsitakse inosiinfosfaatkeramiidi vabanemine glükoosamiini ja inositooli vahel (51). Seejärel pesti membraaniriba neli korda LC-MS kvaliteediga veega, kuivatati toatemperatuuril ja hoiti lämmastikuatmosfääris temperatuuril -80 °C kuni analüüsini. Kontrollina kasutati iga katse jaoks PVDF membraani tühja proovi. Gas1-GFP-st ekstraheeritud lipiide analüüsiti seejärel MS-meetodil, nagu kirjeldatud (50). Lühidalt, GPI-lipiidi sisaldavad PVDF ribad resuspendeeriti 75 μl negatiivses vormilahustis [kloroform/metanool (1:2) + 5 mM ammooniumatsetaat] ja läbisid sfingolipiidide liikide elektropihustus-ionisatsiooni (ESI) - MRM/MS-analüüsi (TSQ Vantage). Sel juhul saadi MS-andmed negatiivsete ioonide režiimis.
Nagu varem mainitud, eraldati GPI-ankru lipiidiosa [3H]-inositooliga märgistatud GPI-AP-st (16). Lipiidid eraldati õhukese kihi kromatograafia abil, kasutades lahustisüsteemi (55:45:10 kloroform-metanool-0,25% KCl) ja visualiseeriti FLA-7000 (Fujifilm) abil.
Gas1-GFP-d (600×107) ekspresseerivaid rakke pesti kaks korda TNE puhvriga koos TNE puhvriga, purustati klaashelmestega ja seejärel tsentrifuugiti rakkude prahi ja klaashelmete eemaldamiseks. Seejärel tsentrifuugiti supernatanti kiirusel 17 000 g 1 tund temperatuuril 4 °C. Sadet pesti TNE-s ja inkubeeriti 1 tund temperatuuril 37 °C 1 U PI-PLC-ga (Invitrogen) TNE-s, mis sisaldas 0,2% digitaalise saponiini. Pärast ensüümtöötlust eemaldati membraan tsentrifuugimisega kiirusel 17 000 g 4 °C juures 1 tund. Gas1-GFP immunosadestamiseks inkubeeriti supernatanti GFP-Trap_A-ga (ChromoTek) temperatuuril 4 °C üleöö. SDS-PAGE abil eraldatud puhastatud Gas1-GFP värviti Coomassie briljantsinisega. Gas1-GFP värvimisriba lõigati akvedukti ümbritsevast hallist alalt ära ning pärast jodoatseetamiidiga alküülimist ja ditiotreitooliga redutseerimist teostati geelisisene digestioon trüpsiiniga. Trüptilised peptiidid ja peptiidid ekstraheeriti ja kuivatati GPI-glükaanidega. Kuivatatud peptiid lahustati 20 μl vees. Osa (8 μl) süstiti LC-sse. Peptiidide eraldamiseks spetsiifilistes gradienditingimustes kasutati oktadetsüülsilaani (ODS) kolonni (Develosil 300ODS-HG-5; sisediameeter 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, Aichi prefektuur, Jaapan). Liikuv faas on lahusti A (0,08% sipelghape) ja lahusti B (0,15% sipelghape 80% atsetonitriilis). Kolonni elueerimiseks lahustiga A 55 minuti jooksul voolukiirusel 50 μl min-1 5 minuti jooksul kasutati Accela HPLC süsteemi (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) ja seejärel suurendati lahusti B kontsentratsiooni 40%-ni. (Ameerika Ühendriigid). Eluaati juhiti pidevalt ESI ioonallikasse ning trüptilisi peptiide ja GPI-glükaanidega peptiide analüüsiti LTQ Orbitrap XL abil (hübriidne lineaarne ioonlõks-orbitrap massispektromeeter; Thermo Fisher Scientific). MS-seadmes seati kapillaarallika pinge 4,5 kV-le ja ülekandekapillaari temperatuur hoiti 300 °C juures. Kapillaari pinge ja toru läätse pinge seati vastavalt 15 V ja 50 V-le. MS-andmed saadi positiivse iooni režiimis (eraldusvõime 60 000; massi täpsus 10 miljondikosa) massivahemikus 300/m/z, massi/laengu suhe (m/z) 3000. MS/MS-andmed saadakse LTQ Orbitrap XL ioonlõksu kaudu [esimesed 3 numbrit, millest andmed sõltuvad, on kokkupõrke indutseeritud dissotsiatsioon (CID)].
MD simulatsioonid viidi läbi GROMACS (52) tarkvara ja MARTINI 2 jõuvälja (53-55) abil. Seejärel kasutati CHARMM GUI membraanide ehitajat (56, 57) kaksikkihi konstrueerimiseks, mis sisaldas dioleoüülfosfatidüülkoliini (DOPC) ja Cer C18 või DOPC ja Cer C26. Cer C26 topoloogia ja koordinaadid tuletatakse DXCE-st, eemaldades sfingosiini sabast lisahelmed. Kasutage allpool kirjeldatud protsessi kaksikkihi tasakaalustamiseks ja käivitamiseks, seejärel kasutage süsteemi viimaseid koordinaate Emp24 sisaldava süsteemi ehitamiseks. Pärmi Emp24 transmembraanne domeen (jäägid 173 kuni 193) konstrueeriti α-heeliksina, kasutades visuaalse MD (VMD) tööriista molekulaarstruktuuri (58). Seejärel, pärast kattuvate lipiidide eemaldamist, granuleeriti valk jämedalt ja sisestati kaksikkihti CHARMM GUI abil. Lõplik süsteem sisaldab 1202 DOPC-d ja 302 Cer C26-d või 1197 DOPC-d ja 295 Cer C18-d ning Emp24-d. Süsteem ioniseeritakse kontsentratsioonini 0,150 M. Kahe kaksikkihilise koostise jaoks tehakse neli sõltumatut kordust.
Lipiidkaksikkiht tasakaalustatakse CHARMM GUI protsessi abil, mis hõlmab 405 000 sammu minimeerimist ja seejärel tasakaalustamist, kus positsioonipiiranguid järk-järgult vähendatakse ja kõrvaldatakse ning ajasammu suurendatakse 0,005 ps-lt 0,02 ps-ni. Pärast tasakaalustamist saadakse 6 µs ajasammuga 0,02 ps. Pärast Emp24 sisestamist kasutage sama CHARMM GUI protsessi süsteemi minimeerimiseks ja tasakaalustamiseks ning seejärel laske sellel 8 sekundit tootmises töötada.
Kõigi süsteemide puhul reguleeritakse rõhku tasakaalustamisprotsessi ajal Berendseni barostaat (59) ja tootmisprotsessi ajal Parrinello-Rahmani barostaat (60). Kõigil juhtudel on keskmine rõhk 1 baar ja kasutatakse poolisotroopset rõhu sidestusskeemi. Tasakaalustamis- ja tootmisprotsessis kasutatakse valgu-, lipiidi- ja lahustiosakeste temperatuuri ühendamiseks vastavalt kiiruse ümberkalibreerimisega termostaati (61). Kogu operatsiooni vältel on sihttemperatuur 310 K. Mittesiduv interaktsioon arvutatakse paaride loendi genereerimise teel, kasutades Verleti skeemi puhvritolerantsiga 0,005. Coulombi termin arvutatakse reaktsioonivälja ja piirväärtuse 1,1 nm abil. Vander-Waalsi termin kasutab piirväärtuse skeemi piirväärtusega 1,1 nm ja Verleti piirväärtuse skeemi kasutatakse potentsiaalse triivi jaoks (62).
VMD abil on DOPC fosfaathelmeste või keramiid-AM1 helmeste ja valgu vaheline piirlainepikkus 0,7 nm ning arvutatakse valguga interakteeruvate lipiidide arv. Arvutage järgmise valemi abil kahanemis-rikastamisfaktor (DE) nagu valemis (63): DE-faktor = (lipiidide koguhulk valgus 0,7) valgus 0,7 (Ceri kogus lipiidides)
Esitatud väärtus on saadud keskmisena ja vearibad tähistavad standardhälbe neli sõltumatut koopiat. DE-teguri statistiline olulisus arvutatakse t-testi abil [(keskmine DE-tegur-1)/SE]. Arvutage P-väärtus ühepoolse jaotuse põhjal.
GROMACS-tööriista kasutati Emp24 sisaldava süsteemi 2D lateraalse tiheduse kaardi arvutamiseks jälje viimase 250 ns jooksul. Keramiidi rikastumise/kadumise kaardi saamiseks jagatakse Ceri tiheduskaart Ceri ja DOPC kaardi summaga ning seejärel jagatakse Ceri kontsentratsiooniga kehas. Kasutatakse sama värvikaardi skaalat.
Selle artikli lisamaterjalide saamiseks külastage palun veebilehte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1.
See on avatud juurdepääsuga artikkel, mis on levitatud Creative Commonsi litsentsi "Autorile viitamine + Mitteäriline eesmärk" tingimuste kohaselt, mis lubab kasutamist, levitamist ja reprodutseerimist mis tahes meediumis, kui lõppkasutus ei ole ärilise kasu saamiseks ja eelduseks on algse teose õigsus. Viide.
Märkus: Palume teil oma e-posti aadressi esitada ainult selleks, et lehele soovitatud inimene teaks, et soovite talle e-kirja näidata ja et see pole rämpspost. Me ei salvesta ühtegi e-posti aadressi.
Selle küsimuse abil kontrollitakse, kas olete külastaja, ja takistatakse automaatset rämpsposti saatmist.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez (S.S.Sergio Lopez), (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D-kõrglahutusega reaalajas pildistamine näitab keramiidi ahela pikkuse olulisust valkude sorteerimisel selektiivsetes väljundkohtades.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez (S.S.Sergio Lopez), (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D-kõrglahutusega reaalajas pildistamine näitab keramiidi ahela pikkuse olulisust valkude sorteerimisel selektiivsetes väljundkohtades.
©2020 American Association for the Advanced of Science of Science. kõik õigused kaitstud. AAAS on HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ja COUNTER partner. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.