Täname teid nature.com külastamise eest. Teie kasutataval brauseriversioonil on piiratud CSS-i tugi. Parima kogemuse saamiseks soovitame kasutada brauseri uusimat versiooni (või lülitada Internet Exploreris ühilduvusrežiim välja). Lisaks ei sisalda see sait jätkuva toe tagamiseks stiile ega JavaScripti.
Vesiniksulfiidil (H2S) on inimkehale mitmeid füsioloogilisi ja patoloogilisi mõjusid. Naatriumhüdrosulfiidi (NaHS) kasutatakse laialdaselt farmakoloogilise vahendina H2S mõju hindamiseks bioloogilistes katsetes. Kuigi H2S kadumine NaHS lahustest võtab vaid paar minutit, on NaHS lahuseid mõnedes loomkatsetes kasutatud H2S doonorühenditena joogivees. Käesolevas uuringus uuriti, kas roti/hiire pudelites valmistatud joogivesi, mille NaHS kontsentratsioon on 30 μM, võib püsida stabiilsena vähemalt 12–24 tundi, nagu mõned autorid on soovitanud. Valmistage NaHS lahus (30 μM) joogivees ja valage see kohe roti/hiire veepudelitesse. Proovid koguti veepudeli otsast ja seest 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 ja 24 tunni möödudes, et mõõta sulfiidi sisaldust metüleensinise meetodi abil. Lisaks süstiti isastele ja emastele rottidele kahe nädala jooksul NaHS-i (30 μM) ning seerumi sulfiidi kontsentratsiooni mõõdeti esimesel nädalal ja teise nädala lõpus ülepäeviti. Veepudeli otsast saadud proovis olev NaHS-i lahus oli ebastabiilne; see vähenes vastavalt 72% ja 75% 12 ja 24 tunni pärast. Veepudelite seest saadud proovides ei olnud NaHS-i langus 2 tunni jooksul oluline; see aga vähenes vastavalt 47% ja 72% 12 ja 24 tunni pärast. NaHS-i süstimine ei mõjutanud isas- ja emasrottide seerumi sulfiidi taset. Kokkuvõtteks võib öelda, et joogiveest valmistatud NaHS-i lahuseid ei tohiks H2S-i annetamiseks kasutada, kuna lahus on ebastabiilne. See manustamisviis viib loomad ebaregulaarse ja oodatust väiksema NaHS-i koguseni.
Vesiniksulfiidi (H2S) on toksiinina kasutatud alates 1700. aastast; aga selle võimalikku rolli endogeense biosignaalimolekulina kirjeldasid Abe ja Kimura 1996. aastal. Viimase kolme aastakümne jooksul on selgitatud arvukalt H2S-i funktsioone erinevates inimese süsteemides, mis on viinud arusaamani, et H2S doonormolekulidel võib olla kliinilisi rakendusi teatud haiguste ravis või ohjamisel; vt Chirino jt. hiljutist ülevaadet.
Naatriumhüdrosulfiidi (NaHS) on laialdaselt kasutatud farmakoloogilise vahendina H2S-i mõjude hindamiseks paljudes rakukultuuri- ja loomkatsetes5,6,7,8. NaHS ei ole aga ideaalne H2S-i doonor, kuna see muundub lahuses kiiresti H2S/HS-iks, saastub kergesti polüsulfiididega ning oksüdeerub ja lendub kergesti4,9. Paljudes bioloogilistes katsetes lahustatakse NaHS vees, mille tulemuseks on passiivne lenduvus ja H2S10,11,12 kadu, H2S11 spontaanne oksüdatsioon11,12,13 ja fotolüüs14. Sulfiid alglahuses kaob H2S11 lendumise tõttu väga kiiresti. Avatud anumas on H2S-i poolestusaeg (t1/2) umbes 5 minutit ja selle kontsentratsioon väheneb umbes 13% minutis10. Kuigi vesiniksulfiidi kadu NaHS-i lahustest võtab vaid paar minutit, on mõnedes loomkatsetes kasutatud NaHS-i lahuseid vesiniksulfiidi allikana joogivees 1–21 nädalat, asendades NaHS-i sisaldavat lahust iga 12–24 tunni järel.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 See praktika ei ole kooskõlas teadusliku uurimistöö põhimõtetega, kuna ravimite annused peaksid põhinema nende kasutamisel teistel liikidel, eriti inimestel.27
Biomeditsiini prekliiniliste uuringute eesmärk on parandada patsiendihoolduse kvaliteeti või ravitulemusi. Enamiku loomkatsete tulemusi ei ole aga veel inimestele üle kantud28,29,30. Üks selle ülekantava ebaõnnestumise põhjuseid on tähelepanu puudumine loomkatsete metodoloogilisele kvaliteedile30. Seetõttu oli käesoleva uuringu eesmärk uurida, kas roti/hiire veepudelites valmistatud 30 μM NaHS-i lahused võivad joogivees stabiilsena püsida 12–24 tundi, nagu mõnedes uuringutes väidetakse või soovitatakse.
Kõik käesoleva uuringu katsed viidi läbi vastavalt Iraanis avaldatud laboriloomade hooldamise ja kasutamise suunistele31. Kõik käesoleva uuringu katsearuanded järgisid ka ARRIVE'i suuniseid32. Shahid Beheshti Meditsiiniteaduste Ülikooli Endokriinteaduste Instituudi eetikakomitee kiitis heaks kõik käesoleva uuringu katsemenetlused.
Tsinkatsetaatdihüdraat (CAS: 5970-45-6) ja veevaba raud(III)kloriid (CAS: 7705-08-0) osteti firmalt Biochem, Chemopahrama (Cosne-sur-Loire, Prantsusmaa). Naatriumhüdrosulfiidhüdraat (CAS: 207683-19-0) ja N,N-dimetüül-p-fenüleendiamiin (DMPD) (CAS: 535-47-0) osteti firmalt Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Isofluraan osteti firmalt Piramal (Bethlehem, PA, USA). Vesinikkloriidhape (HCl) osteti firmalt Merck (Darmstadt, Saksamaa).
Valmistage NaHS-i lahus (30 μM) joogivees ja valage see kohe roti/hiire veepudelitesse. See kontsentratsioon valiti arvukate publikatsioonide põhjal, milles on kasutatud NaHS-i H2S allikana; vt arutelu osa. NaHS on hüdreeritud molekul, mis võib sisaldada erinevas koguses hüdratsioonivett (st NaHS•xH2O); tootja andmetel oli meie uuringus kasutatud NaHS-i protsent 70,7% (st NaHS•1,3 H2O) ja me võtsime selle väärtuse oma arvutustes arvesse, kasutades molekulmassi 56,06 g/mol, mis on veevaba NaHS-i molekulmass. Hüdratsioonivesi (nimetatakse ka kristallisatsiooniveeks) on veemolekulid, mis moodustavad kristallstruktuuri33. Hüdraatidel on anhüdraatidega võrreldes erinevad füüsikalised ja termodünaamilised omadused34.
Enne NaHS-i lisamist joogiveele mõõtke lahusti pH-d ja temperatuuri. Valage NaHS-i lahus kohe loomapuuris olevasse roti/hiire veepudelisse. Sulfiidisisalduse mõõtmiseks koguti proovid veepudeli otsast ja seest 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 ja 24 tunni möödudes. Sulfiidisisalduse mõõtmised tehti kohe pärast iga proovivõtmist. Proovid võeti toru otsast, kuna mõned uuringud on näidanud, et veetoru väike pooride suurus võib minimeerida H2S aurustumist15,19. See probleem näib kehtivat ka pudelis oleva lahuse kohta. See ei kehtinud aga veepudeli kaelas oleva lahuse kohta, millel oli suurem aurustumiskiirus ja mis autooksüdeerus; tegelikult jõid loomad selle vee esimesena.
Uuringus kasutati isaseid ja emaseid Wistari rotte. Rotte hoiti polüpropüleenist puurides (2–3 rotti puuri kohta) standardtingimustes (temperatuur 21–26 °C, õhuniiskus 32–40%) 12 tunni valguse (kell 7–19) ja 12 tunni pimedusega (kell 19–7). Rottidel oli vaba juurdepääs kraaniveele ja neid toideti standardtoiduga (Khorak Dam Pars Company, Teheran, Iraan). Vanuse poolest sobitatud (6 kuud) emased (n = 10, kehakaal: 190–230 g) ja isased (n = 10, kehakaal: 320–370 g) Wistari rotid jagati juhuslikult kontrollrühma ja NaHS-iga (30 μM) töödeldud rühma (n = 5 rühma kohta). Valimi suuruse määramiseks kasutasime KISS-i (Keep It Simple, Stupid) meetodit, mis ühendab varasema kogemuse ja võimsusanalüüsi35. Esmalt viisime läbi pilootuuringu kolme rotiga ja määrasime seerumi keskmise sulfiidisisalduse ja standardhälbe (8,1 ± 0,81 μM). Seejärel, arvestades 80% võimsust ja eeldades kahepoolset 5% olulisuse taset, määrasime esialgse valimi suuruse (n = 5 varasema kirjanduse põhjal), mis vastas standardiseeritud efekti suurusele 2,02, kasutades Festingi soovitatud eelnevalt määratletud väärtust katseloomade valimi suuruse arvutamiseks35. Pärast selle väärtuse korrutamist standardhälbega (2,02 × 0,81) oli ennustatud tuvastatava efekti suurus (1,6 μM) 20%, mis on vastuvõetav. See tähendab, et n = 5/rühm on piisav, et tuvastada rühmadevaheline 20% keskmine muutus. Rotid jagati juhuslikult kontroll- ja NaSH-ga töödeldud rühmadesse, kasutades Exceli tarkvara juhuslikku funktsiooni36 (lisajoonis 1). Pimetestimine viidi läbi tulemuse tasandil ja biokeemilisi mõõtmisi teostavad uurijad ei olnud rühmade määramisest teadlikud.
Mõlema soo NaHS-i rühmi töödeldi 2 nädala jooksul joogivees valmistatud 30 μM NaHS-i lahusega; värsket lahust lisati iga 24 tunni järel, mille jooksul mõõdeti kehakaalu. Kõigi isofluraananesteesia all olevate rottide sabaotstest võeti vereproovid ülepäeviti esimese ja teise nädala lõpus. Vereproovid tsentrifuugiti kiirusel 3000 g 10 minutit, seerum eraldati ja säilitati temperatuuril –80 °C seerumi uurea, kreatiniini (Cr) ja kogusulfiidi edasiseks mõõtmiseks. Seerumi uurea määrati ensümaatilise ureaasi meetodil ja seerumi kreatiniini määrati fotomeetrilisel Jaffe meetodil, kasutades kaubanduslikult saadaval olevaid komplekte (Man Company, Teheran, Iraan) ja automaatset analüsaatorit (Selectra E, seerianumber 0-2124, Holland). Uurea ja Cr analüüsisisese ja analüüsidevahelise variatsioonikordaja oli alla 2,5%.
Metüleensinise (MB) meetodit kasutatakse kogu sulfiidi mõõtmiseks joogivees ja NaHS-i sisaldavas seerumis; MB on kõige sagedamini kasutatav meetod sulfiidi mõõtmiseks lahustes ja bioloogilistes proovides11,37. MB meetodit saab kasutada kogu sulfiidivaru hindamiseks38 ja anorgaaniliste sulfiidide mõõtmiseks H2S, HS- ja S2 kujul vesifaasis39. Selle meetodi puhul sadestatakse väävel tsinksulfiidina (ZnS) tsinkatsetaadi juuresolekul11,38. Tsinkatsetaadi sadestamine on kõige laialdasemalt kasutatav meetod sulfiidide eraldamiseks teistest kromofooridest11. ZnS lahustati uuesti HCl11 abil tugevalt happelistes tingimustes. Sulfiid reageerib DMPD-ga stöhhiomeetrilises suhtes 1:2 reaktsioonis, mida katalüüsib raud(III)kloriid (Fe3+ toimib oksüdeerijana), moodustades värvaine MB, mida detekteeritakse spektrofotomeetriliselt lainepikkusel 670 nm40,41. MB meetodi avastamispiir on ligikaudu 1 μM11.
Selles uuringus lisati katseklaasi 100 μL igast proovist (lahus või seerum); seejärel lisati 200 μL tsinkatsetaati (1% w/v destilleeritud vees), 100 μL DMPD-d (20 mM 7,2 M HCl-is) ja 133 μL FeCl3-i (30 mM 1,2 M HCl-is). Segu inkubeeriti temperatuuril 37 °C pimedas 30 minutit. Lahust tsentrifuugiti kiirusel 10 000 g 10 minutit ja supernatandi neeldumist loeti lainepikkusel 670 nm, kasutades mikroplaadilugejat (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, USA). Sulfiidi kontsentratsioonid määrati NaHS-i (0–100 μM) kalibreerimiskõvera abil ddH2O-s (lisajoonis 2). Kõik mõõtmisteks kasutatud lahused olid värskelt valmistatud. Sulfiidi mõõtmiste sise- ja analüüsidevahelised variatsioonikordajad olid vastavalt 2,8% ja 3,4%. Samuti määrasime naatriumtiosulfaati sisaldavast joogiveest ja seerumiproovidest eraldatud sulfiidi koguhulga, kasutades rikastatud proovi meetodit42. Naatriumtiosulfaati sisaldava joogivee ja seerumiproovide saagised olid vastavalt 91 ± 1,1% (n = 6) ja 93 ± 2,4% (n = 6).
Statistiline analüüs viidi läbi, kasutades GraphPad Prism tarkvara versiooni 8.0.2 Windowsile (GraphPad Software, San Diego, CA, USA, www.graphpad.com). Joogivee temperatuuri ja pH võrdlemiseks enne ja pärast NaHS-i lisamist kasutati paaris-t-testi. H2S-i kadu NaHS-i sisaldavas lahuses arvutati protsentuaalse vähenemisena algtaseme omastamisest ning kadu statistiliselt olulise hindamiseks teostasime ühesuunalise korduvmõõtmistega ANOVA, millele järgnes Dunnetti mitmekordse võrdluse test. Kehakaalu, seerumi uurea, seerumi kreatiniini ja seerumi sulfiidi koguhulka ajas võrreldi kontroll- ja NaHS-iga töödeldud erineva soo rottide vahel, kasutades kahesuunalist sega-ANOVA-d (rühmade vahel-sisemisel), millele järgnes Bonferroni post hoc test. Kahepoolseid P-väärtusi < 0,05 peeti statistiliselt oluliseks.
Joogivee pH oli enne NaHS-i lisamist 7,60 ± 0,01 ja pärast NaHS-i lisamist 7,71 ± 0,03 (n = 13, p = 0,0029). Joogivee temperatuur oli 26,5 ± 0,2 ja langes pärast NaHS-i lisamist 26,2 ± 0,2-ni (n = 13, p = 0,0128). Valmistage 30 μM NaHS-i lahus joogivees ja hoidke seda veepudelis. NaHS-i lahus on ebastabiilne ja selle kontsentratsioon väheneb aja jooksul. Veepudeli kaelast proovi võttes täheldati esimese tunni jooksul olulist langust (68,0%) ning NaHS-i sisaldus lahuses vähenes vastavalt 72% ja 75% 12 ja 24 tunni pärast. Veepudelitest saadud proovides ei olnud NaHS-i vähenemine kuni 2 tunni jooksul oluline, kuid 12 ja 24 tunni pärast oli see vähenenud vastavalt 47% ja 72%. Need andmed näitavad, et joogivees valmistatud 30 μM lahuses oli NaHS-i protsent 24 tunni pärast vähenenud ligikaudu veerandini algväärtusest, olenemata proovivõtukohast (joonis 1).
NaHS-i lahuse (30 μM) stabiilsus joogivees roti/hiire pudelites. Pärast lahuse valmistamist võeti proovid veepudeli otsast ja sisemusest. Andmed on esitatud keskmisena ± standardhälve (n = 6/rühm). * ja #, P < 0,05 võrreldes ajaga 0. Veepudeli fotol on näha ots (avaga) ja pudeli korpus. Otsa maht on ligikaudu 740 μL.
Värskelt valmistatud 30 μM lahuses oli NaHS-i kontsentratsioon 30,3 ± 0,4 μM (vahemik: 28,7–31,9 μM, n = 12). 24 tunni pärast langes NaHS-i kontsentratsioon aga madalamale väärtusele (keskmine: 3,0 ± 0,6 μM). Nagu joonisel 2 näidatud, ei olnud rottidele avaldatud NaHS-i kontsentratsioonid uuringuperioodi jooksul konstantsed.
Emaste rottide kehakaal suurenes aja jooksul märkimisväärselt (kontrollrühmas 205,2 ± 5,2 g-lt 213,8 ​​± 7,0 g-ni ja NaHS-iga töödeldud rühmas 204,0 ± 8,6 g-lt 211,8 ± 7,5 g-ni); NaHS-i töötlemisel ei olnud kehakaalule mingit mõju (joonis 3). Isaste rottide kehakaal suurenes aja jooksul märkimisväärselt (kontrollrühmas 338,6 ± 8,3 g-lt 352,4 ± 6,0 g-ni ja NaHS-iga töödeldud rühmas 352,4 ± 5,9 g-lt 363,2 ± 4,3 g-ni); NaHS-i töötlemisel ei olnud kehakaalule mingit mõju (joonis 3).
Emas- ja isasrottide kehakaalu muutused pärast NaHS-i (30 μM) manustamist. Andmed on esitatud keskmisena ± standardvea ja neid võrreldi kahesuunalise segavariatsioonianalüüsi abil, kasutades Bonferroni post hoc testi. n = 5 mõlemast soost igas rühmas.
Seerumi uurea ja kreatiinfosfaadi kontsentratsioonid olid kontroll- ja NaSH-ga ravitud rottidel kogu uuringu vältel võrreldavad. Lisaks ei mõjutanud NaSH-ravi seerumi uurea ja kreatiinkroomi kontsentratsioone (tabel 1).
Seerumi kogusulfiidi kontsentratsioonid algtasemel olid kontroll- ja NaHS-iga töödeldud isaste (8,1 ± 0,5 μM vs 9,3 ± 0,2 μM) ning emaste (9,1 ± 1,0 μM vs 6,1 ± 1,1 μM) rottide vahel võrreldavad. NaHS-i manustamine 14 päeva jooksul ei mõjutanud seerumi kogusulfiidi taset ei isastel ega emastel rottidel (joonis 4).
Seerumi kogusulfiidi kontsentratsiooni muutused isastel ja emastel rottidel pärast NaHS-i (30 μM) manustamist. Andmed on esitatud keskmisena ± standardvea ja neid võrreldi kahesuunalise segavariatsioonianalüüsi abil, kasutades Bonferroni post hoc testi. Mõlemast soost, n = 5/rühm.
Selle uuringu peamine järeldus on, et NaHS-i sisaldav joogivesi on ebastabiilne: 24 tundi pärast roti/hiire veepudelite otsast ja seest proovi võtmist on võimalik tuvastada vaid umbes veerand esialgsest sulfiidi kogusisaldusest. Lisaks puutusid rotid kokku ebastabiilse NaHS-i kontsentratsiooniga H2S kadumise tõttu NaHS-i lahuses ning NaHS-i lisamine joogiveele ei mõjutanud kehakaalu, seerumi uurea ja kreatiinkroomi ega seerumi sulfiidi kogusisaldust.
Selles uuringus oli H2S kadu kiirus 30 μM NaHS lahustest joogivees ligikaudu 3% tunnis. Puhverdatud lahuses (100 μM naatriumsulfiidi 10 mM PBS-is, pH 7,4) vähenes sulfiidi kontsentratsioon aja jooksul 8 tunni jooksul 7%. Oleme varem kaitsnud NaHS-i intraperitoneaalset manustamist, teatades, et sulfiidi kadu kiirus 54 μM NaHS lahusest joogivees oli ligikaudu 2,3% tunnis (4% tunnis esimese 12 tunni jooksul ja 1,4% tunnis viimase 12 tunni jooksul pärast valmistamist)8. Varasemad uuringud43 leidsid NaHS lahustest pideva H2S kadu, peamiselt lendumise ja oksüdeerumise tõttu. Isegi ilma mullide lisamiseta kaob sulfiid põhilahuses kiiresti H2S lendumise tõttu.11 Uuringud on näidanud, et lahjendusprotsessi käigus, mis kestab umbes 30–60 sekundit, kaob aurustumise tõttu umbes 5–10% H2S-ist. H2S aurustumise vältimiseks lahusest on teadlased võtnud mitmeid meetmeid, sealhulgas lahuse õrn segamine,12 põhilahuse katmine plastkilega6 ja lahuse kokkupuute minimeerimine õhuga, kuna H2S aurustumise kiirus sõltub õhu-vedeliku piirpinnast.13 H2S spontaanne oksüdeerumine toimub peamiselt siirdemetallide, eriti raud(III)ioonide, tõttu, mis on vees lisandid.13 H2S oksüdeerumine põhjustab polüsulfiidide (kovalentsete sidemetega seotud väävliaatomid)11 moodustumist. Selle oksüdeerumise vältimiseks valmistatakse H2S-i sisaldavad lahused deoksüdeeritud lahustites44,45 ja seejärel puhutakse argooni või lämmastikuga 20–30 minutit, et tagada deoksüdeerumine.11,12,37,44,45,46 Dietüleentriamiinpentaäädikhape (DTPA) on metalli kelaatija (10–4 M), mis hoiab ära HS-i autooksüdatsiooni aeroobsetes lahustes. DTPA puudumisel on HS- autooksüdatsiooni kiirus ligikaudu 50% ligikaudu 3 tunni jooksul temperatuuril 25 °C37,47. Lisaks, kuna 1e-sulfiidi oksüdatsiooni katalüüsib ultraviolettvalgus, tuleks lahust hoida jääl ja valguse eest kaitstult11.
Nagu joonisel 5 näidatud, dissotsieerub NaHS vees lahustudes Na+ ja HS-6 ioonideks; see dissotsiatsioon määratakse reaktsiooni pK1 abil, mis sõltub temperatuurist: pK1 = 3,122 + 1132/T, kus T on vahemikus 5 kuni 30 °C ja mõõdetakse kelvini kraadides (K), K = °C + 273,1548. HS--l on kõrge pK2 (pK2 = 19), seega pH < 96,49 juures S2--d ei moodustu või moodustub väga väikestes kogustes. Seevastu HS- toimib alusena ja võtab H+ iooni H2O molekulist ning H2O toimib happena ja muundub H2S-iks ja OH--ks.
Lahustunud H2S gaasi moodustumine NaHS lahuses (30 µM). aq, vesilahus; g, gaas; l, vedelik. Kõik arvutused eeldavad, et vee pH = 7,0 ja vee temperatuur = 20 °C. Loodud BioRender.com abil.
Vaatamata tõenditele, et NaHS-i lahused on ebastabiilsed, on mitmed loomkatsed kasutanud NaHS-i lahuseid joogivees H2S doonorühendina15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, sekkumise kestusega 1 kuni 21 nädalat (tabel 2). Nende uuringute käigus uuendati NaHS-i lahust iga 12 tunni, 15, 17, 18, 24, 25 tunni või 24 tunni, 19, 20, 21, 22, 23 tunni järel. Meie tulemused näitasid, et rotid puutusid kokku ebastabiilsete ravimikontsentratsioonidega H2S kadumise tõttu NaHS-i lahusest ning NaHS-i sisaldus rottide joogivees kõikus 12 või 24 tunni jooksul oluliselt (vt joonis 2). Kahes neist uuringutest teatati, et H2S tase vees püsis 24 tunni jooksul stabiilsena22 või et 12 tunni jooksul täheldati vaid 2–3% H2S kadu15, kuid need ei esitanud toetavaid andmeid ega mõõtmisandmeid. Kaks uuringut on näidanud, et veepudelite väike läbimõõt võib minimeerida H2S aurustumist15,19. Meie tulemused näitasid aga, et see võib H2S kadu veepudelist edasi lükata vaid 2 tunni võrra, mitte 12–24 tunni võrra. Mõlemas uuringus märgitakse, et eeldame, et NaHS tase joogivees ei muutunud, kuna me ei täheldanud vees värvimuutust; seetõttu ei olnud H2S oksüdeerumine õhu toimel oluline19,20. Üllataval kombel hindab see subjektiivne meetod NaHS-i stabiilsust vees, mitte ei mõõda selle kontsentratsiooni muutust aja jooksul.
H2S kadu NaHS lahuses on seotud pH ja temperatuuriga. Nagu meie uuringus märgitud, põhjustab NaHS-i lahustamine vees aluselise lahuse moodustumist50. Kui NaHS lahustatakse vees, sõltub lahustunud H2S gaasi moodustumine pH väärtusest6. Mida madalam on lahuse pH, seda suurem on NaHS-i osakaal H2S gaasimolekulidena ja seda rohkem sulfiidi kaob vesilahusest11. Ükski neist uuringutest ei ole teatanud NaHS-i lahustina kasutatava joogivee pH-d. WHO soovituste kohaselt, mida enamik riike kasutab, peaks joogivee pH olema vahemikus 6,5–8,551. Selles pH vahemikus suureneb H2S-i spontaanse oksüdeerumise kiirus ligikaudu kümme korda13. NaHS-i lahustamine vees selles pH vahemikus annab lahustunud H2S gaasi kontsentratsiooni 1–22,5 μM, mis rõhutab vee pH jälgimise olulisust enne NaHS-i lahustamist. Lisaks põhjustaks ülaltoodud uuringus kirjeldatud temperatuurivahemik (18–26 °C) lahustunud H2S gaasi kontsentratsiooni ligikaudu 10% muutuse lahuses, kuna temperatuurimuutused muudavad pK1 ja väikesed pK1 muutused võivad oluliselt mõjutada lahustunud H2S gaasi kontsentratsiooni48. Lisaks süvendab seda probleemi mõnede uuringute pikk kestus (5 kuud)22, mille jooksul eeldatakse suurt temperatuuri varieeruvust.
Kõik uuringud peale ühe21 kasutasid joogivees 30 μM NaHS-i lahust. Kasutatud doosi (st 30 μM) selgitamiseks juhtisid mõned autorid tähelepanu sellele, et NaHS vesifaasis tekitab täpselt sama kontsentratsiooni H2S gaasi ja et H2S füsioloogiline vahemik on 10 kuni 100 μM, seega jääb see annus füsioloogilise vahemiku piiresse15,16. Teised selgitasid, et 30 μM NaHS suudab hoida plasma H2S taset füsioloogilises vahemikus, st 5–300 μM19,20. Meie arvestame NaHS-i kontsentratsiooniga vees 30 μM (pH = 7,0, T = 20 °C), mida kasutati mõnes uuringus H2S mõju uurimiseks. Me võime arvutada, et lahustunud H2S gaasi kontsentratsioon on 14,7 μM, mis on umbes 50% NaHS-i algkontsentratsioonist. See väärtus on sarnane teiste autorite poolt samades tingimustes arvutatud väärtusega13,48.
Meie uuringus ei muutnud NaHS-i manustamine kehakaalu; see tulemus on kooskõlas teiste isastel hiirtel22,23 ja isastel rottidel18 läbi viidud uuringute tulemustega; kahes uuringus teatati aga, et NaSH taastas nefrektoomia läbinud rottidel vähenenud kehakaalu24,26, samas kui teistes uuringutes ei teatatud NaSH manustamise mõjust kehakaalule15,16,17,19,20,21,25. Lisaks ei mõjutanud NaSH manustamine meie uuringus seerumi uurea ja kreatiini kroomi taset, mis on kooskõlas teise aruande tulemustega25.
Uuring näitas, et NaHS-i lisamine joogiveele kahe nädala jooksul ei mõjutanud seerumi sulfiidi kogukontsentratsiooni isastel ja emastel rottidel. See leid on kooskõlas Sen jt (16) tulemustega: 8-nädalane ravi 30 μM NaHS-iga joogivees ei mõjutanud kontrollrottide plasma sulfiidi taset; aga nad teatasid, et see sekkumine taastas nefrektoomia läbinud hiirte plasmas vähenenud H2S taseme. Li jt (22) teatasid ka, et ravi 30 μM NaHS-iga joogivees viie kuu jooksul suurendas eakate hiirte plasma vaba sulfiidi taset umbes 26%. Teistes uuringutes ei ole täheldatud muutusi ringleva sulfiidi sisalduses pärast NaHS-i lisamist joogiveele.
Seitsmes uuringus kasutati Sigma NaHS-i15,16,19,20,21,22,23, kuid hüdratsioonivee kohta ei esitatud täiendavaid üksikasju ning viies uuringus ei mainitud nende valmistusmeetodites kasutatud NaHS-i allikat17,18,24,25,26. NaHS on hüdreeritud molekul ja selle hüdratsioonivee sisaldus võib varieeruda, mis mõjutab antud molaarsusega lahuse valmistamiseks vajaliku NaHS-i kogust. Näiteks oli meie uuringus NaHS-i sisaldus NaHS•1,3 H2O. Seega võivad tegelikud NaHS-i kontsentratsioonid nendes uuringutes olla madalamad kui teatatud.
„Kuidas saab nii lühikese elueaga ühendil olla nii pikaajaline toime?“ esitasid Pozgay jt.21 selle küsimuse, hinnates NaHS-i mõju hiirte koliidile. Nad loodavad, et tulevased uuringud suudavad sellele küsimusele vastata ja oletada, et NaHS-i lahused võivad lisaks NaHS-i toimet vahendavatele H2S-ile ja disulfiididele21 sisaldada stabiilsemaid polüsulfiide. Teine võimalus on, et ka väga madalad lahusesse jäänud NaHS-i kontsentratsioonid võivad avaldada kasulikku mõju. Tegelikult esitasid Olson jt tõendeid selle kohta, et H2S-i mikromolaarsed tasemed veres ei ole füsioloogilised ja peaksid olema nanomolaarses vahemikus või üldse puuduma13. H2S võib toimida valkude sulfatsiooni kaudu, mis on pöörduv translatsioonijärgne modifikatsioon, mis mõjutab paljude valkude funktsiooni, stabiilsust ja lokaliseerumist52,53,54. Tegelikult on füsioloogilistes tingimustes ligikaudu 10–25% paljudest maksavalkudest sulfüülitud53. Mõlemad uuringud tunnistavad NaHS-i kiiret lagunemist,19,23 kuid üllataval kombel väidavad, et „me kontrollisime NaHS-i kontsentratsiooni joogivees, asendades seda iga päev.“23 Ühes uuringus väideti kogemata, et „NaHS on standardne H2S-i doonor ja seda kasutatakse kliinilises praktikas tavaliselt H2S-i enda asendamiseks.“18
Ülaltoodud arutelu näitab, et NaHS kaob lahusest lenduvuse, oksüdatsiooni ja fotolüüsi teel ning seetõttu tehakse mõned ettepanekud H2S kadumise vähendamiseks lahusest. Esiteks sõltub H2S aurustumine gaasi-vedeliku piirpinnast13 ja lahuse pH-st11; seetõttu saab aurustumiskao minimeerimiseks veepudeli kaela teha võimalikult väikeseks, nagu eelnevalt kirjeldatud15,19, ja vee pH-d saab reguleerida vastuvõetava ülempiirini (st 6,5–8,551), et minimeerida aurustumiskadu11. Teiseks toimub H2S spontaanne oksüdeerumine hapniku mõjul ja joogivees sisalduvate siirdemetalliioonide olemasolu tõttu13, seega joogivee deoksüdeerimine argooni või lämmastikuga44,45 ja metallikelaatorite37,47 kasutamine võib vähendada sulfiidide oksüdeerumist. Kolmandaks, H2S fotolagunemise vältimiseks saab veepudelid pakkida alumiiniumfooliumisse; see tava kehtib ka valgustundlike materjalide, näiteks streptozototsiini55 kohta. Lõpuks võib anorgaanilisi sulfiidsooli (NaHS, Na2S ja CaS) manustada sondiga, mitte joogivees lahustatult, nagu varem teatatud56,57,58; uuringud on näidanud, et rottidele sondiga manustatud radioaktiivne naatriumsulfiid imendub hästi ja jaotub praktiliselt kõikidesse kudedesse59. Praeguseks on enamikus uuringutes anorgaanilisi sulfiidsooli manustatud intraperitoneaalselt; seda manustamisviisi kasutatakse aga kliinilistes tingimustes harva60. Teisest küljest on suukaudne manustamisviis inimestel kõige levinum ja eelistatum manustamisviis61. Seetõttu soovitame hinnata H2S doonorite mõju närilistele suukaudse sondi abil.
Piiranguks on see, et me mõõtsime sulfiidi vesilahuses ja seerumis MB meetodil. Sulfiidi mõõtmise meetodite hulka kuuluvad joodi tiitrimine, spektrofotomeetria, elektrokeemiline meetod (potentsiomeetria, amperomeetria, kulonomeetriline meetod ja amperomeetriline meetod) ja kromatograafia (gaasikromatograafia ja kõrgefektiivne vedelikkromatograafia), mille hulgas on kõige sagedamini kasutatav meetod MB spektrofotomeetriline meetod62. MB meetodi piirang H2S mõõtmiseks bioloogilistes proovides on see, et see mõõdab kõiki väävlit sisaldavaid ühendeid ja mitte vaba H2S63, kuna seda tehakse happelistes tingimustes, mille tulemuseks on väävli ekstraheerimine bioloogilisest allikast64. Ameerika Rahvatervise Assotsiatsiooni andmetel on MB aga standardmeetod sulfiidi mõõtmiseks vees65. Seega ei mõjuta see piirang meie peamisi tulemusi NaHS-i sisaldavate lahuste ebastabiilsuse kohta. Lisaks oli meie uuringus sulfiidi mõõtmiste saagis NaHS-i sisaldavates vee- ja seerumiproovides vastavalt 91% ja 93%. Need väärtused on kooskõlas varem teatatud vahemikega (77–92)66, mis näitab vastuvõetavat analüütilist täpsust42. Väärib märkimist, et kasutasime nii isaseid kui ka emaseid rotte vastavalt USA Riiklike Terviseinstituutide (NIH) suunistele, et vältida prekliinilistes uuringutes liigset tuginemist ainult isasloomadega tehtud uuringutele67 ning kaasata võimaluse korral nii isaseid kui ka emaseid rotte68. Seda punkti on rõhutanud ka teised69,70,71.
Kokkuvõtteks näitavad selle uuringu tulemused, et joogiveest valmistatud NaHS-i lahuseid ei saa nende ebastabiilsuse tõttu kasutada H2S-i tekitamiseks. See manustamisviis viiks loomade kokkupuuteni ebastabiilse ja oodatust madalama NaHS-i tasemega; seetõttu ei pruugi need tulemused olla inimestele kohaldatavad.
Käesoleva uuringu käigus kasutatud ja/või analüüsitud andmekogumid on vastavalt autorilt mõistliku taotluse korral kättesaadavad.
Szabo, K. Vesiniksulfiidi (H2S) uuringute ajajoon: keskkonnatoksiinist bioloogiliseks mediaatoriks. Biokeemia ja farmakoloogia 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Abe, K. ja Kimura, H. Vesiniksulfiidi võimalik roll endogeense neuromodulaatorina. Journal of Neuroscience, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Chirino, G., Szabo, C. ja Papapetropoulos, A. Vesiniksulfiidi füsioloogiline roll imetajate rakkudes, kudedes ja organites. Reviews in Physiology and Molecular Biology 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Dillon, KM, Carrazzone, RJ, Matson, JB ja Kashfi, K. Lämmastikoksiidi ja vesiniksulfiidi rakuliste manustamissüsteemide arenev potentsiaalikus: personaalmeditsiini uus ajastu. Biokeemia ja farmakoloogia 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Sun, X. jt. Aeglaselt vabaneva vesiniksulfiidi doonori pikaajaline manustamine võib ennetada müokardi isheemiat/reperfusioonikahjustust. Scientific reports 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Sitdikova, GF, Fuchs, R., Kainz, W., Weiger, TM ja Hermann, A. BK kanali fosforüülimine reguleerib vesiniksulfiidi (H2S) tundlikkust. Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Sitdikova, GF, Weiger, TM ja Hermann, A. Vesiniksulfiid suurendab kaltsiumi poolt aktiveeritava kaaliumi (BK) kanali aktiivsust roti hüpofüüsi kasvajarakkudes. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Jeddy, S. jt. Vesiniksulfiid tugevdab nitriti kaitsvat toimet müokardi isheemia-reperfusioonikahjustuse vastu II tüüpi diabeediga rottidel. Lämmastikoksiid 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Corvino, A. jt. H2S doonorite keemia trendid ja selle mõju südame-veresoonkonna haigustele. Antioksüdandid 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
DeLeon, ER, Stoy, GF ja Olson, KR (2012). Vesiniksulfiidi passiivsed kaod bioloogilistes katsetes. Analytical Biochemistry 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Nagy, P. jt. Füsioloogilistes proovides sisalduva vesiniksulfiidi keemilised aspektid. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Kline, LL.D. Vesiniksulfiidi spektrofotomeetriline määramine looduslikes vetes. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Olson, KR (2012). Praktiline koolitus vesiniksulfiidi keemias ja bioloogias. „Antioksüdandid.“ Redox Signaling. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).