Varem teatasime, et soolestikust pärineva trüptofaani metaboliidi indool-3-propioonhappe (IPA) seerumitasemed on maksafibroosiga patsientidel madalamad. Selles uuringus uurisime transkriptoomi ja DNA metüloomi rasvunud maksades seoses seerumi IPA tasemetega, samuti IPA rolli maksa stellaatrakkude (HSC-de) fenotüübilise inaktiveerimise indutseerimisel in vitro.
Uuringus osales 116 rasvunud patsienti, kellel ei olnud II tüüpi diabeeti (T2DM) (vanus 46,8 ± 9,3 aastat; KMI: 42,7 ± 5,0 kg/m²), kellele tehti bariaatriline operatsioon Kuopio Bariaatrilise Kirurgia Keskuses (KOBS). Ringleva IPA taset mõõdeti vedelikkromatograafia-massispektromeetria (LC-MS) abil, maksa transkriptoomi analüüs viidi läbi kogu RNA sekveneerimise abil ja DNA metülatsiooni analüüs viidi läbi Infinium HumanMethylation450 BeadChip abil. In vitro katsetes kasutati inimese maksa stellaatrakke (LX-2).
Seerumi IPA tasemed korreleerusid maksas apoptootiliste, mitofaagiliste ja pikaealisuse radadega seotud geenide ekspressiooniga. AKT seriin/treoniinkinaas 1 (AKT1) geen oli maksa transkripti ja DNA metülatsiooniprofiilides kõige arvukam ja domineerivam interakteeruv geen. IPA-ravi indutseeris apoptoosi, vähendas mitokondriaalset hingamist ning muutis rakkude morfoloogiat ja mitokondriaalset dünaamikat, moduleerides LX-2 rakkude fibroosi, apoptoosi ja ellujäämist reguleerivate geenide ekspressiooni.
Kokkuvõttes toetavad need andmed, et IPA-l on potentsiaalne terapeutiline toime ning see võib indutseerida apoptoosi ja nihutada HSC fenotüüpi inaktiivsesse olekusse, laiendades seeläbi maksafibroosi pärssimise võimalust, häirides HSC aktivatsiooni ja mitokondriaalset metabolismi.
Rasvumise ja metaboolse sündroomi levimust on seostatud metaboolselt seotud rasvmaksahaiguse (MASLD) esinemissageduse suurenemisega; haigus mõjutab 25–30% üldpopulatsioonist [1]. MASLD etioloogia peamine tagajärg on maksafibroos, dünaamiline protsess, mida iseloomustab kiulise rakuvälise maatriksi (ECM) pidev akumuleerumine [2]. Peamised maksafibroosiga seotud rakud on maksa tähtrakud (HSC-d), millel on neli teadaolevat fenotüüpi: uinunud, aktiveeritud, inaktiveeritud ja vananevad [3, 4]. HSC-sid saab aktiveerida ja transdiferentseerida uinunud vormist proliferatiivseteks fibroblastilaadseteks rakkudeks, millel on suur energiavajadus, kusjuures α-silelihasaktiini (α-SMA) ja I tüüpi kollageeni (Col-I) ekspressioon on suurenenud [5, 6]. Maksafibroosi pöördumise ajal elimineeritakse aktiveeritud HSC-d apoptoosi või inaktiveerimise teel. Need protsessid hõlmavad fibrogeensete geenide allareguleerimist ja ellujäämist soodustavate geenide (näiteks NF-κB ja PI3K/Akt signaaliülekande radade) moduleerimist [7, 8], samuti muutusi mitokondrite dünaamikas ja funktsioonis [9].
Soolestikus toodetava trüptofaani metaboliidi indool-3-propioonhappe (IPA) seerumitase on inimeste ainevahetushaiguste, sealhulgas MASLD korral vähenenud [10–13]. IPA on seotud toidukiudainete tarbimisega, on tuntud oma antioksüdantse ja põletikuvastase toime poolest ning nõrgestab dieedist tingitud alkoholivaba steatohepatiidi (NASH) fenotüüpi nii in vivo kui ka in vitro [11–14]. Mõned tõendid pärinevad meie varasemast uuringust, mis näitas, et seerumi IPA tase oli maksafibroosiga patsientidel madalam kui rasvunud patsientidel, kellel ei olnud maksafibroosi Kuopio bariaatrilise kirurgia uuringus (KOBS). Lisaks näitasime, et IPA-ravi võib vähendada geenide ekspressiooni, mis on inimese maksa stellaatrakkude (LX-2) mudelis klassikalised rakkude adhesiooni, rakkude migratsiooni ja vereloome tüvirakkude aktivatsiooni markerid ning on potentsiaalne hepatoprotektiivne metaboliit [15]. Siiski jääb ebaselgeks, kuidas IPA indutseerib maksafibroosi regressiooni, aktiveerides HSC apoptoosi ja mitokondriaalset bioenergeetikat.
Siin demonstreerime, et seerumi IPA on seotud apoptoosi, mitofagia ja pikaealisuse radades rikastatud geenide ekspressiooniga rasvunud, kuid mitte II tüüpi diabeediga (KOBS) inimeste maksas. Lisaks leidsime, et IPA võib indutseerida aktiveeritud hematopoeetiliste tüvirakkude (HSC-de) kliirensit ja lagunemist inaktiveerimise raja kaudu. Need tulemused näitavad IPA uut rolli, muutes selle potentsiaalseks terapeutiliseks sihtmärgiks maksafibroosi regressiooni soodustamiseks.
Varasem KOBS-i kohordi uuring näitas, et maksafibroosiga patsientidel oli madalam IPA tase vereringes võrreldes maksafibroosita patsientidega [15]. 2. tüüpi diabeedi võimaliku segava mõju välistamiseks kaasasime uuringupopulatsiooniks käimasolevast KOBS-i uuringust 116 rasvunud patsienti, kellel ei olnud 2. tüüpi diabeeti (keskmine vanus ± standardhälve: 46,8 ± 9,3 aastat; KMI: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (tabel 1) [16]. Kõik osalejad andsid kirjaliku nõusoleku ja uuringuprotokolli kiitis heaks Põhja-Savo maakonnahaigla eetikakomitee vastavalt Helsingi deklaratsioonile (54/2005, 104/2008 ja 27/2010).
Maksa biopsiaproovid saadi bariaatrilise kirurgia käigus ja kogenud patoloogid hindasid neid histoloogiliselt vastavalt eelnevalt kirjeldatud kriteeriumidele [17, 18]. Hindamiskriteeriumid on kokku võetud lisatabelis S1 ja neid on varem kirjeldatud [19].
Paastumisest võetud seerumiproove analüüsiti metaboloomika analüüsiks sihtimata vedelikkromatograafia-massispektromeetria (LC-MS) abil (n = 116). Proove analüüsiti UHPLC-qTOF-MS süsteemi abil (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Saksamaa), nagu eelnevalt kirjeldatud19. Isopropüülalkoholi (IPA) identifitseerimine põhines retentsiooniajal ja MS/MS spektri võrdlemisel puhaste standarditega. IPA signaali intensiivsust (piigi pindala) arvestati kõigis edasistes analüüsides [20].
Kogu maksa RNA sekveneerimine viidi läbi Illumina HiSeq 2500 abil ja andmed eeltöödeldi eelnevalt kirjeldatud viisil [19, 21, 22]. Viisime läbi mitokondriaalse funktsiooni/biogeneesi mõjutavate transkriptide sihipärase diferentsiaalse ekspressiooni analüüsi, kasutades 1957 geeni, mis valiti MitoMiner 4.0 andmebaasist [23]. Maksa DNA metülatsiooni analüüs viidi läbi Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) abil, kasutades sama metoodikat nagu eelnevalt kirjeldatud [24, 25].
Inimese maksa stellaatrakud (LX-2) saadi prof Stefano Romeolt ning neid kultiveeriti ja hoiti DMEM/F12 söötmes (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). IPA tööannuse valimiseks töödeldi LX-2 rakke 24 tunni jooksul DMEM/F12 söötmes erineva kontsentratsiooniga IPA-ga (10 μM, 100 μM ja 1 mM; Sigma, 220027). Lisaks, et uurida IPA võimet HSC-sid inaktiveerida, töödeldi LX-2 rakke 24 tunni jooksul koos 5 ng/ml TGF-β1-ga (R&D systems, 240-B-002/CF) ja 1 mM IPA-ga seerumivabas söötmes. Vastavate vehiiklikontrollide puhul kasutati TGF-β1 töötlemiseks 4 nM HCl-i, mis sisaldas 0,1% BSA-d, ja IPA töötlemiseks 0,05% DMSO-d ning mõlemat kasutati koos kombineeritud ravis.
Apoptoosi hinnati FITC anneksiin V apoptoosi tuvastamise komplekti abil koos 7-AAD-ga (Biolegend, San Diego, CA, USA, kat. nr 640922) vastavalt tootja juhistele. Lühidalt, LX-2 (1 × 105 rakku/süvend) kultiveeriti üleöö 12-süvendilistes plaatides ja seejärel töödeldi neid mitme IPA või IPA ja TGF-β1 annusega. Järgmisel päeval koguti ujuvad ja adherentsed rakud, trüpsiiniti, pesti PBS-iga, resuspendeeriti anneksiin V sidumispuhvris ja inkubeeriti FITC-anneksiin V ja 7-AAD-ga 15 minutit.
Elusrakkude mitokondrid värviti oksüdatiivse aktiivsuse suhtes, kasutades Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) värvi (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). MTR-testide jaoks inkubeeriti LX-2 rakke võrdse tihedusega IPA ja TGF-β1-ga. 24 tunni pärast trüpsiiniti elusrakud, pesti PBS-iga ja inkubeeriti seejärel 100 μM MTR-iga seerumivabas söötmes temperatuuril 37 °C 20 minutit, nagu eelnevalt kirjeldatud [26]. Elusrakkude morfoloogia analüüsiks analüüsiti rakkude suurust ja tsütoplasmaatilist keerukust vastavalt edasihajumise (FSC) ja külghajumise (SSC) parameetrite abil.
Kõik andmed (30 000 sündmust) saadi NovoCyte Quanteoni (Agilent) abil ja analüüsiti NovoExpress® 1.4.1 või FlowJo V.10 tarkvara abil.
Hapniku tarbimise kiirust (OCR) ja rakuvälist hapestumise kiirust (ECAR) mõõdeti reaalajas Seahorse'i rakuvälise voolu analüsaatori (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) abil, mis oli varustatud Seahorse XF rakkude mitostressianduriga vastavalt tootja juhistele. Lühidalt, XF96 rakukultuuriplaatidele külvati 2 × 104 LX-2 rakku/süvend. Pärast üleöö inkubeerimist töödeldi rakke isopropanooliga (IPA) ja TGF-β1-ga (lisameetodid 1). Andmete analüüs viidi läbi Seahorse XF Wave tarkvara abil, mis sisaldab Seahorse XF rakkude energia fenotüübi testi aruannete generaatorit. Selle põhjal arvutati bioenergeetiline terviseindeks (BHI) [27].
Totaalne RNA transkribeeriti cDNA-ks. Täpsemate meetodite kohta vaata viidet [15]. Konstitutiivsete geenikontrollidena kasutati inimese 60S ribosoomi happelise valgu P0 (RPLP0) ja tsüklofiliin A1 (PPIA) mRNA tasemeid. Kasutati QuantStudio 6 pro reaalaja PCR süsteemi (Thermo Fisher, Landsmeer, Holland) koos TaqMan™ Fast Advanced Master Mix komplektiga (Applied Biosystems) või Sensifast SYBR Lo-ROX komplektiga (Bioline, BIO 94050) ning suhteline geeniekspressiooni kord arvutati võrdlevate Ct väärtuse tsükliliste parameetrite (ΔΔCt) ja ∆∆Ct meetodi abil. Praimerite üksikasjad on esitatud lisatabelites S2 ja S3.
Tuuma-DNA (ncDNA) ja mitokondriaalne DNA (mtDNA) ekstraheeriti DNeasy vere- ja koekomplekti (Qiagen) abil, nagu eelnevalt kirjeldatud [28]. mtDNA suhteline kogus arvutati iga mtDNA sihtpiirkonna ja kolme tuuma-DNA piirkonna (mtDNA/ncDNA) geomeetrilise keskmise suhte arvutamise teel, nagu on üksikasjalikult kirjeldatud lisameetodites 2. mtDNA ja ncDNA praimerite üksikasjad on esitatud lisatabelis S4.
Elusrakud värviti Mitotracker™ Red CMXRos'ega (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA), et visualiseerida rakkudevahelisi ja rakusiseseid mitokondriaalseid võrgustikke. LX-2 rakke (1 × 104 rakku/süvend) kultiveeriti klaasplaatidel vastavatel klaaspõhjaga kultuuriplaatidel (Ibidi GmbH, Martinsried, Saksamaa). 24 tunni pärast inkubeeriti elusaid LX-2 rakke 100 μM MTR-iga 20 minutit temperatuuril 37 °C ja rakutuumad värviti DAPI-ga (1 μg/ml, Sigma-Aldrich), nagu eelnevalt kirjeldatud [29]. Mitokondrite võrgustikke visualiseeriti Zeiss Axio Observer inverteeritud mikroskoobi (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Saksamaa) abil, mis oli varustatud Zeiss LSM 800 konfokaalse mooduliga temperatuuril 37 °C niisutatud atmosfääris 5% CO2 sisaldusega, kasutades 63×NA 1,3 objektiivi. Saime iga proovitüübi kohta kümme Z-seeria pilti. Iga Z-seeria sisaldab 30 sektsiooni, igaühe paksusega 9,86 μm. Iga proovi puhul saadi ZEN 2009 tarkvara (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Saksamaa) abil kümne erineva vaatevälja kujutised ja mitokondrite morfoloogia analüüs viidi läbi ImageJ tarkvara (v1.54d) [30, 31] abil vastavalt lisameetodites 3 üksikasjalikult kirjeldatud parameetritele.
Rakud fikseeriti 2% glutaraldehüüdiga 0,1 M fosfaatpuhvris, seejärel fikseeriti 1% osmiumtetroksiidi lahusega (Sigma Aldrich, MO, USA), dehüdreeriti järk-järgult atsetooniga (Merck, Darmstadt, Saksamaa) ja lõpuks sisestati epoksüvaiku. Valmistati üliõhukesed sektsioonid, mis värviti 1% uranüülatsetaadiga (Merck, Darmstadt, Saksamaa) ja 1% pliitsitraadiga (Merck, Darmstadt, Saksamaa). Ultrastruktuurilised kujutised saadi JEM 2100F EXII transmissioon-elektronmikroskoobiga (JEOL Ltd, Tokyo, Jaapan) kiirenduspingel 80 kV.
24 tunni jooksul IPA-ga töödeldud LX-2 rakkude morfoloogiat analüüsiti faasikontrastmikroskoopia abil 50-kordse suurendusega, kasutades Zeissi inverteeritud valguse mikroskoopi (Zeiss Axio Vert.A1 ja AxioCam MRm, Jena, Saksamaa).
Kliinilised andmed väljendati keskmisena ± standardhälve või mediaanina (kvartiilidevaheline vahemik: IQR). Kolme uuringurühma erinevuste võrdlemiseks kasutati ühesuunalist dispersioonanalüüsi (pidevad muutujad) või χ² testi (kategoorilised muutujad). Mitmekordse testimise korrigeerimiseks kasutati valepositiivsete tulemuste määra (FDR) ja statistiliselt oluliseks loeti geene, mille FDR oli < 0,05. CpG DNA metülatsiooni ja IPA signaali intensiivsuse korreleerimiseks kasutati Spearmani korrelatsioonanalüüsi, kusjuures esitati nominaalsed p-väärtused (p < 0,05).
Raja analüüs viidi läbi veebipõhise geenikomplekti analüüsi tööriista (WebGestalt) abil 268 transkripti (nominaalne p < 0,01), 119 mitokondritega seotud transkripti (nominaalne p < 0,05) ja 4350 CpG puhul 3093 maksa transkripti hulgast, mis olid seotud ringleva seerumi IPA tasemega. Kattuvate geenide leidmiseks kasutati vabalt kättesaadavat Venny DB (versioon 2.1.0) tööriista ja valk-valk interaktsioonide visualiseerimiseks StringDB-d (versioon 11.5).
LX-2 katse puhul testiti proovide normaalsust D'Agostino-Pearsoni testi abil. Andmed saadi vähemalt kolmest bioloogilisest replikaadist ja need allutati ühesuunalisele ANOVA-le Bonferroni post hoc testiga. Statistiliselt oluliseks loeti p-väärtust alla 0,05. Andmed on esitatud keskmisena ± standardhälve ja katsete arv on näidatud igal joonisel. Kõik analüüsid ja graafikud tehti Windowsi statistikatarkvara GraphPad Prism 8 abil (GraphPad Software Inc., versioon 8.4.3, San Diego, USA).
Esmalt uurisime seerumi IPA taseme seost maksa, kogu keha ja mitokondrite transkriptidega. Kogu transkripti profiilis oli seerumi IPA tasemega kõige tugevamalt seotud geen MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaas-aktiveeritud proteiinkinaas 3); mitokondritega seotud transkripti profiilis oli kõige tugevamalt seotud geen AKT1 (FDR = 0,7621; AKT seriin/treoniinkinaas 1) (lisafail 1 ja lisafail 2).
Seejärel analüüsisime globaalseid transkripte (n = 268; p < 0,01) ja mitokondritega seotud transkripte (n = 119; p < 0,05), tuvastades lõpuks apoptoosi kõige olulisema kanoonilise rajana (p = 0,0089). Seerumi IPA tasemetega seotud mitokondriaalsete transkriptide puhul keskendusime apoptoosile (FDR = 0,00001), mitofagiale (FDR = 0,00029) ja TNF signaaliülekande radadele (FDR = 0,000006) (joonis 1A, tabel 2 ja täiendavad joonised 1A-B).
Globaalsete, mitokondritega seotud transkriptide ja DNA metülatsiooni kattuvate analüüside arv inimese maksas seoses seerumi IPA tasemetega. A tähistab 268 globaalset transkripti, 119 mitokondritega seotud transkripti ja DNA metüleeritud transkripti, mis on kaardistatud 3092 CpG saitile, mis on seotud seerumi IPA tasemetega (p-väärtused < 0,01 globaalsete transkriptide ja metüleeritud DNA puhul ning p-väärtused < 0,05 mitokondrite transkriptide puhul). Peamised kattuvad transkriptid on näidatud keskel (AKT1 ja YKT6). B 13 geeni interaktsioonikaart, millel on kõrgeim interaktsiooniskoor (0,900) teiste geenidega, konstrueeriti 56 kattuvast geenist (must joon), mis olid oluliselt seotud seerumi IPA tasemetega, kasutades veebipõhist tööriista StringDB. Roheline: Geenid, mis on kaardistatud Gene Ontology (GO) rakulise komponendi: mitokondrid (GO:0005739). AKT1 on valk, millel on kõrgeim skoor (0,900) interaktsioonide osas teiste valkudega andmete põhjal (põhineb tekstikaevel, katsetel, andmebaasidel ja koekspressioonil). Võrgustiku sõlmed esindavad valke ja servad esindavad valkude vahelisi ühendusi.
Kuna soolemikrobioota metaboliidid saavad reguleerida epigeneetilist koostist DNA metülatsiooni kaudu [32], uurisime, kas seerumi IPA tase oli seotud maksa DNA metülatsiooniga. Leidsime, et kaks peamist seerumi IPA tasemega seotud metülatsioonisaiti asusid proliini-seriinirikka piirkonna 3 (C19orf55) ja kuumašoki valkude perekonna B (väike) liikme 6 (HSPB6) lähedal (lisafail 3). 4350 CpG DNA metülatsioon (p < 0,01) oli korrelatsioonis seerumi IPA tasemega ja rikastas pikaealisuse regulatiivseid radasid (p = 0,006) (joonis 1A, tabel 2 ja lisajoonis 1C).
Seerumi IPA tasemete, globaalsete transkriptide, mitokondritega seotud transkriptide ja inimese maksas toimuva DNA metülatsiooni vaheliste seoste aluseks olevate bioloogiliste mehhanismide mõistmiseks viisime läbi eelmises raja analüüsis tuvastatud geenide kattuvusanalüüsi (joonis 1A). 56 kattuva geeni (joonisel 1A musta joone sees) raja rikastamise analüüsi tulemused näitasid, et apoptoosi rada (p = 0,00029) tõi esile kaks geeni, mis on kolmes analüüsis ühised: AKT1 ja YKT6 (YKT6 v-SNARE homoloog), nagu on näidatud Venni diagrammil (lisajoonis 2 ja joonis 1A). Huvitaval kombel leidsime, et AKT1 (cg19831386) ja YKT6 (cg24161647) olid positiivses korrelatsioonis seerumi IPA tasemetega (lisafail 3). Geeniproduktide vaheliste võimalike valguinteraktsioonide tuvastamiseks valisime sisendiks 56 kattuva geeni hulgast 13 geeni, millel oli kõrgeim ühise piirkonna skoor (0,900), ja koostasime interaktsioonikaardi. Usaldusväärsuse taseme (marginaalse usalduse) järgi oli kõrgeima skooriga (0,900) AKT1 geen tipus (joonis 1B).
Raja analüüsi põhjal leidsime, et peamine rada oli apoptoos, seega uurisime, kas IPA-ravi mõjutab HSC-de apoptoosi in vitro. Varem näitasime, et erinevad IPA annused (10 μM, 100 μM ja 1 mM) ei olnud LX-2 rakkudele toksilised [15]. See uuring näitas, et IPA-ravi kontsentratsioonidel 10 μM ja 100 μM suurendas elujõuliste ja nekrootiliste rakkude arvu. Võrreldes kontrollrühmaga vähenes rakkude elujõulisus aga 1 mM IPA kontsentratsioonil, samas kui rakkude nekroosi määr jäi samaks (joonis 2A, B). Seejärel, et leida optimaalne kontsentratsioon LX-2 rakkude apoptoosi esilekutsumiseks, testisime 24 tunni jooksul 10 μM, 100 μM ja 1 mM IPA-d (joonis 2A-E ja täiendav joonis 3A-B). Huvitaval kombel vähendasid IPA 10 μM ja 100 μM apoptoosi kiirust (%), kuid IPA 1 mM suurendas hilist apoptoosi ja apoptoosi kiirust (%) võrreldes kontrollrühmaga ning valiti seetõttu edasisteks katseteks see (joonis 2A–D).
IPA indutseerib LX-2 rakkude apoptoosi. Apoptootilise kiiruse ja rakkude morfoloogia kvantifitseerimiseks voolutsütomeetria abil kasutati anneksiin V ja 7-AAD topeltvärvimise meetodit. BA rakke inkubeeriti 24 tundi 10 μM, 100 μM ja 1 mM IPA-ga või F–H TGF-β1 (5 ng/ml) ja 1 mM IPA-ga seerumivabas söötmes 24 tundi. A: elusrakud (anneksiin V -/ 7AAD-); B: nekrootilised rakud (anneksiin V -/ 7AAD+); C, F: varajane (anneksiin V +/ 7AAD-); D, G: hiline (anneksiin V+/7AAD.+); E, H: varajaste ja hiliste apoptootiliste rakkude koguarvu protsent apoptoosi kiirusest (%). Andmed on väljendatud keskmisena ± SD, n = 3 sõltumatut katset. Statistilised võrdlused viidi läbi ühesuunalise ANOVA abil koos Bonferroni post hoc testiga. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Nagu me varem näitasime, võib 5 ng/ml TGF-β1 indutseerida HSC aktivatsiooni, suurendades klassikaliste markergeenide ekspressiooni [15]. LX-2 rakke töödeldi 5 ng/ml TGF-β1 ja 1 mM IPA kombinatsiooniga (joonis 2E–H). TGF-β1 ravi ei muutnud apoptoosi kiirust, kuid IPA samaaegne ravi suurendas hilist apoptoosi ja apoptoosi kiirust (%) võrreldes TGF-β1 raviga (joonis 2E–H). Need tulemused näitavad, et 1 mM IPA võib soodustada apoptoosi LX-2 rakkudes sõltumatult TGF-β1 induktsioonist.
Uurisime edasi IPA mõju mitokondriaalsele hingamisele LX-2 rakkudes. Tulemused näitasid, et 1 mM IPA vähendas hapnikutarbimise kiiruse (OCR) parameetreid: mittemitokondriaalset hingamist, basaalset ja maksimaalset hingamist, prootonite leket ja ATP tootmist võrreldes kontrollrühmaga (joonis 3A, B), samas kui bioenergeetiline terviseindeks (BHI) ei muutunud.
IPA vähendab LX-2 rakkudes mitokondriaalset hingamist. Mitokondriaalse hingamise kõver (OCR) on esitatud mitokondriaalse hingamise parameetritena (mittemitokondriaalne hingamine, basaalne hingamine, maksimaalne hingamine, prootonite leke, ATP teke, SRC ja BHI). Rakke A ja B inkubeeriti vastavalt 10 μM, 100 μM ja 1 mM IPA-ga 24 tundi. Rakke C ja D inkubeeriti vastavalt TGF-β1 (5 ng/ml) ja 1 mM IPA-ga seerumivabas söötmes 24 tundi. Kõik mõõtmised normaliseeriti DNA sisalduse suhtes, kasutades CyQuant komplekti. BHI: bioenergeetiline terviseindeks; SRC: hingamisreservvõimsus; OCR: hapniku tarbimise kiirus. Andmed on esitatud keskmisena ± standardhälve (SD), n = 5 sõltumatut katset. Statistilised võrdlused viidi läbi ühesuunalise ANOVA ja Bonferroni post hoc testi abil. *p < 0,05; **p < 0,01; ja ***p < 0,001
IPA mõju TGF-β1-aktiveeritud LX-2 rakkude bioenergeetilisele profiilile paremaks mõistmiseks analüüsisime OCR-i abil mitokondriaalset oksüdatiivset fosforüülimist (joonis 3C, D). Tulemused näitasid, et TGF-β1 ravi võis vähendada maksimaalset hingamist, hingamisreservvõimsust (SRC) ja BHI-d võrreldes kontrollrühmaga (joonis 3C, D). Lisaks vähendas kombineeritud ravi basaalset hingamist, prootonite leket ja ATP tootmist, kuid SRC ja BHI olid oluliselt kõrgemad kui TGF-β1-ga ravitud rühmal (joonis 3C, D).
Samuti viisime läbi Seahorse tarkvara pakutava „Cellular Energy Phenotype Testi“ (lisajoonis 4A–D). Nagu on näidatud lisajoonisel 3B, vähenesid nii OCR-i kui ka ECAR-i metaboolne potentsiaal pärast TGF-β1-ravi, kuid kombinatsioon- ja IPA-ravirühmades ei täheldatud erinevust võrreldes kontrollrühmaga. Lisaks langesid nii OCR-i basaal- kui ka stressitase pärast kombinatsioon- ja IPA-ravi võrreldes kontrollrühmaga (lisajoonis 4C). Huvitaval kombel täheldati sarnast mustrit ka kombinatsioonravi puhul, kus ECAR-i basaal- ja stressitasemes ei täheldatud muutusi võrreldes TGF-β1-raviga (lisajoonis 4C). HSC-des ei muutnud mitokondriaalse oksüdatiivse fosforüülimise vähenemine ja kombinatsioonravi võime taastada SCR-i ja BHI-d pärast TGF-β1-ravi metaboolset potentsiaali (OCR ja ECAR). Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et IPA võib vähendada HSC-de bioenergeetikat, mis viitab sellele, et IPA võib esile kutsuda madalama energeetilise profiili, mis nihutab HSC fenotüüpi inaktiveerimise suunas (lisajoonis 4D).
IPA mõju mitokondrite dünaamikale uuriti mitokondrite morfoloogia ja võrgustikuühenduste kolmemõõtmelise kvantifitseerimise ning MTR-värvimise abil (joonis 4 ja lisajoonis 5). Joonis 4 näitab, et võrreldes kontrollrühmaga vähendas TGF-β1-ravi keskmist pindala, harude arvu, harude kogupikkust ja harude ühenduste arvu (joonis 4A ja B) ning muutis mitokondrite osakaalu sfäärilisest keskmise morfoloogiaga võrreldes keskmise morfoloogiaga (joonis 4C). Ainult IPA-ravi vähendas keskmist mitokondrite mahtu ja muutis mitokondrite osakaalu sfäärilisest keskmise morfoloogiaga võrreldes kontrollrühmaga (joonis 4A). Seevastu sfäärilisus, keskmine harude pikkus ja mitokondriaalne aktiivsus, mida hinnati mitokondrite membraanipotentsiaalist sõltuva MTR-i abil (joonis 4A ja E), jäid samaks ning need parameetrid ei erinenud rühmade vahel. Kokkuvõttes viitavad need tulemused sellele, et TGF-β1 ja IPA-ravi näivad moduleerivat mitokondrite kuju ja suurust, samuti võrgustiku keerukust elusates LX-2 rakkudes.
IPA muudab mitokondriaalset dünaamikat ja mitokondriaalse DNA arvukust LX-2 rakkudes. A. Elusate LX-2 rakkude representatiivsed konfokaalsed pildid, mida inkubeeriti TGF-β1 (5 ng/ml) ja 1 mM IPA-ga 24 tunni jooksul seerumivabas söötmes, mis näitavad Mitotracker™ Red CMXRos-iga värvitud mitokondriaalseid võrgustikke ja DAPI-ga siniseks värvitud tuumasid. Kõik andmed sisaldasid vähemalt 15 pilti rühma kohta. Iga proovitüübi kohta saime 10 Z-virna pilti. Iga Z-telje järjestus sisaldas 30 viilu, igaühe paksusega 9,86 μm. Skaalariba: 10 μm. B. Representatiivsed objektid (ainult mitokondrid), mis identifitseeriti pildile adaptiivse läviväärtuste rakendamise teel. Mitokondriaalsete morfoloogiliste võrgustike seoste kvantitatiivne analüüs ja võrdlus viidi läbi kõigi rakkude puhul igas rühmas. C. Mitokondriaalsete kujusuhete sagedus. 0-lähedased väärtused näitavad sfäärilisi kujusid ja 1-lähedased väärtused näitavad niitjaid kujusid. D Mitokondriaalse DNA (mtDNA) sisaldus määrati materjalide ja meetodite osas kirjeldatud viisil. E Mitotracker™ Red CMXRos analüüs viidi läbi voolutsütomeetria abil (30 000 sündmust), nagu on kirjeldatud materjalides ja meetodites. Andmed on esitatud keskmisena ± standardhälve, n = 3 sõltumatut katset. Statistilised võrdlused viidi läbi ühesuunalise ANOVA ja Bonferroni post hoc testi abil. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Seejärel analüüsisime LX-2 rakkude mtDNA sisaldust mitokondrite arvu indikaatorina. Võrreldes kontrollrühmaga oli mtDNA sisaldus TGF-β1-ga töödeldud rühmas suurenenud (joonis 4D). Võrreldes TGF-β1-ga töödeldud rühmaga oli mtDNA sisaldus kombineeritud ravirühmas vähenenud (joonis 4D), mis viitab sellele, et IPA võib vähendada mtDNA sisaldust ja võimalik, et ka mitokondrite arvu ning mitokondriaalset hingamist (joonis 3C). Lisaks näis IPA kombinatsioonravis vähendavat mtDNA sisaldust, kuid ei mõjutanud MTR-vahendatud mitokondriaalset aktiivsust (joonised 4A–C).
Uurisime IPA seost fibroosi, apoptoosi, ellujäämise ja mitokondriaalse dünaamikaga seotud geenide mRNA tasemetega LX-2 rakkudes (joonis 5A–D). Võrreldes kontrollrühmaga näitas TGF-β1-ga töödeldud rühm selliste geenide nagu I tüüpi kollageeni α2 ahela (COL1A2), α-silelihasaktiin (αSMA), maatriksi metalloproteinaas 2 (MMP2), metalloproteinaas 1 koe inhibiitori (TIMP1) ja dünamiin 1-laadse geeni (DRP1) suurenenud ekspressiooni, mis viitab suurenenud fibroosile ja aktivatsioonile. Lisaks vähendas TGF-β1-ravi võrreldes kontrollrühmaga tuumapregnaan X retseptori (PXR), kaspaas 8 (CASP8), MAPKAPK3, B-rakkude α inhibiitori, tuumafaktori κ geeni valguspeptiidi võimendaja (NFκB1A) ja tuumafaktori κB kinaasi subühiku β inhibiitori (IKBKB) mRNA taset (joonis 5A–D). Võrreldes TGF-β1 raviga vähendas TGF-β1 ja IPA kombinatsioonravi COL1A2 ja MMP2 ekspressiooni, kuid suurendas PXR, TIMP1, B-rakulise lümfoomi-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β ja IKBKB mRNA taset. IPA ravi vähendas oluliselt MMP2, Bcl-2-ga seotud valgu X (BAX), AKT1, nägemisnärvi atroofia valgu 1 (OPA1) ja mitokondriaalse fusioonvalgu 2 (MFN2) ekspressiooni, samas kui CASP8, NFκB1A, NFκB1B ja IKBKB ekspressioon oli kontrollrühmaga võrreldes suurenenud. Kaspaas-3 (CASP3), apoptootilise peptidaasi aktiveeriva faktori 1 (APAF1), mitokondriaalse fusioonvalgu 1 (MFN1) ja lõhustumisvalgu 1 (FIS1) ekspressioonis ei leitud aga erinevust. Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et IPA ravi moduleerib fibroosi, apoptoosi, ellujäämise ja mitokondriaalse dünaamikaga seotud geenide ekspressiooni. Meie andmed näitavad, et IPA-ravi vähendab LX-2 rakkude fibroosi; samal ajal stimuleerib see ellujäämist, nihutades fenotüüpi inaktiveerimise suunas.
IPA moduleerib fibroblastide, apoptootiliste, elujõulisuse ja mitokondriaalse dünaamika geenide ekspressiooni LX-2 rakkudes. Histogrammid näitavad mRNA ekspressiooni endogeense kontrolli (RPLP0 või PPIA) suhtes pärast seda, kui LX-2 rakke indutseeriti TGF-β1 ja IPA-ga seerumivabas söötmes 24 tunni jooksul. A tähistab fibroblaste, B tähistab apoptootilisi rakke, C tähistab ellujäänud rakke ja D näitab mitokondriaalse dünaamika geeniekspressiooni. Andmed on esitatud keskmisena ± standardhälve (SD), n = 3 sõltumatut katset. Statistilised võrdlused viidi läbi ühesuunalise ANOVA ja Bonferroni post hoc testi abil. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Seejärel hinnati rakkude suuruse (FSC-H) ja tsütoplasmaatilise keerukuse (SSC-H) muutusi voolutsütomeetria abil (joonis 6A, B) ning rakkude morfoloogia muutusi pärast IPA-ravi hinnati transmissioon-elektronmikroskoopia (TEM) ja faasikontrastmikroskoopia abil (lisajoonis 6A-B). Nagu oodatud, suurenesid TGF-β1-ga töödeldud rühma rakud võrreldes kontrollrühmaga (joonis 6A, B), mis näitab kareda endoplasmaatilise retiikulumi (ER*) ja fagolüsosoomide (P) klassikalist laienemist, mis viitab hematopoeetiliste tüvirakkude (HSC) aktivatsioonile (lisajoonis 6A). Võrreldes TGF-β1-ga töödeldud rühmaga vähenesid aga rakkude suurus, tsütoplasmaatiline keerukus (joonis 6A, B) ja ER* sisaldus TGF-β1 ja IPA kombinatsioonravi rühmas (lisajoonis 6A). Lisaks vähendas IPA-ravi rakkude suurust, tsütoplasmaatilist keerukust (joonis 6A, B), P ja ER* sisaldust (lisajoonis 6A) võrreldes kontrollrühmaga. Lisaks suurenes apoptootiliste rakkude sisaldus pärast 24-tunnist IPA-ravi võrreldes kontrollrühmaga (valged nooled, lisajoonis 6B). Kokkuvõttes viitavad need tulemused sellele, et 1 mM IPA võib stimuleerida HSC apoptoosi ja pöörata tagasi TGF-β1 poolt indutseeritud rakkude morfoloogiliste parameetrite muutused, reguleerides seeläbi rakkude suurust ja keerukust, mis võib olla seotud HSC inaktiveerimisega.
IPA muudab LX-2 rakkude suurust ja tsütoplasmaatilist keerukust. Voolutsütomeetria analüüsi representatiivsed kujutised. Analüüsis kasutati LX-2 rakkudele spetsiifilist lülitusstrateegiat: SSC-A/FSC-A rakkude populatsiooni määratlemiseks, FSC-H/FSC-A dublettide tuvastamiseks ja SSC-H/FSC-H rakkude suuruse ja keerukuse analüüsiks. Rakke inkubeeriti TGF-β1 (5 ng/ml) ja 1 mM IPA-ga seerumivabas söötmes 24 tundi. LX-2 rakud jaotati rakkude suuruse ja tsütoplasmaatilise keerukuse analüüsiks alumisse vasakusse kvadranti (SSC-H-/FSC-H-), ülemisse vasakusse kvadranti (SSC-H+/FSC-H-), alumisse paremasse kvadranti (SSC-H-/FSC-H+) ja ülemisse paremasse kvadranti (SSC-H+/FSC-H+). B. Rakkude morfoloogiat analüüsiti voolutsütomeetria abil, kasutades FSC-H (edasihajumine, raku suurus) ja SSC-H (külghajumine, tsütoplasmaatiline keerukus) (30 000 sündmust). Andmed on esitatud keskmisena ± standardhälve, n = 3 sõltumatut katset. Statistilised võrdlused viidi läbi ühesuunalise ANOVA ja Bonferroni post hoc testi abil. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 ja ****p < 0,0001
Soolestiku metaboliidid, näiteks IPA, on muutunud kuumaks uurimisteemaks, mis viitab uute sihtmärkide avastamisele soolestiku mikrobiootas. Seetõttu on huvitav, et IPA, metaboliit, mille oleme seostanud inimeste maksafibroosiga [15], on osutunud potentsiaalseks fibroosivastaseks ühendiks loommudelites [13, 14]. Siin demonstreerime esmakordselt seost seerumi IPA ja globaalse maksa transkriptoomika ning DNA metülatsiooni vahel rasvunud inimestel, kellel puudub II tüüpi diabeet (T2D), tuues esile apoptoosi, mitofaagia ja pikaealisuse, samuti võimaliku kandidaatgeeni AKT1, mis reguleerib maksa homöostaasi. Meie uuringu teine ​​uudsus on see, et demonstreerisime IPA-ravi interaktsiooni apoptoosi, rakumorfoloogia, mitokondriaalse bioenergeetika ja dünaamikaga LX-2 rakkudes, mis viitab madalama energiaspektrile, mis nihutab HSC fenotüüpi inaktiveerimise suunas, muutes IPA-ks potentsiaalse kandidaadi maksafibroosi parandamiseks.
Leidsime, et apoptoos, mitofaagia ja pikaealisus olid kõige olulisemad kanoonilised rajad, mis olid rikastatud maksa geenidega, mis on seotud ringleva seerumi IPA-ga. Mitokondriaalse kvaliteedikontrolli (MQC) süsteemi häirimine võib viia mitokondriaalse düsfunktsiooni, mitofaagia ja apoptoosini, soodustades seeläbi MASLD teket [33, 34]. Seetõttu võime oletada, et IPA võib olla seotud rakkude dünaamika ja mitokondriaalse terviklikkuse säilitamisega apoptoosi, mitofaagia ja pikaealisuse kaudu maksas. Meie andmed näitasid, et kõigis kolmes testis olid ühised kaks geeni: YKT6 ja AKT1. Tasub märkida, et YKT6 on SNARE valk, mis osaleb rakumembraanide fusiooniprotsessis. See mängib rolli autofaagias ja mitofaagias, moodustades autofagosoomil initsiatsioonikompleksi STX17 ja SNAP29-ga, soodustades seeläbi autofagosoomide ja lüsosoomide fusiooni [35]. Lisaks põhjustab YKT6 funktsiooni kadu mitofaagia häireid [36], samas kui YKT6 ülesreguleerimine on seotud hepatotsellulaarse kartsinoomi (HCC) progresseerumisega, mis näitab suurenenud rakkude ellujäämist [37]. Teisest küljest on AKT1 kõige olulisem interakteeruv geen ja mängib olulist rolli maksahaigustes, sealhulgas PI3K/AKT signaaliülekande rajas, rakutsüklis, rakkude migratsioonis, proliferatsioonis, fokaalses adhesioonis, mitokondriaalses funktsioonis ja kollageeni sekretsioonis [38–40]. Aktiveeritud PI3K/AKT signaaliülekande rada võib aktiveerida hematopoeetilisi tüvirakke (HSC-sid), mis on rakuvälise maatriksi (ECM) tootmise eest vastutavad rakud, ja selle düsregulatsioon võib kaasa aidata maksafibroosi tekkele ja progresseerumisele [40]. Lisaks on AKT üks peamisi rakkude ellujäämisfaktoreid, mis pärsib p53-sõltuvat raku apoptoosi, ja AKT aktiveerimine võib olla seotud maksarakkude apoptoosi pärssimisega [41, 42]. Saadud tulemused viitavad sellele, et IPA võib olla seotud maksa mitokondritega seotud apoptoosiga, mõjutades hepatotsüütide otsust apoptoosi sisenemise või ellujäämise vahel. Neid toimeid võivad reguleerida AKT ja/või YKT6 kandidaatgeenid, mis on maksa homöostaasi jaoks kriitilise tähtsusega.
Meie tulemused näitasid, et 1 mM IPA indutseeris LX-2 rakkudes apoptoosi ja vähendas mitokondriaalset hingamist sõltumatult TGF-β1 ravist. On tähelepanuväärne, et apoptoos on fibroosi lahenemise ja hematopoeetiliste tüvirakkude (HSC) aktiveerimise peamine rada ning samuti võtmetähtsusega sündmus maksafibroosi pöörduvas füsioloogilises vastuses [4, 43]. Lisaks andis BHI taastumine LX-2 rakkudes pärast kombineeritud ravi uusi teadmisi IPA potentsiaalsest rollist mitokondriaalse bioenergeetika regulatsioonis. Puhke- ja inaktiivsetes tingimustes kasutavad hematopoeetilised rakud tavaliselt mitokondriaalset oksüdatiivset fosforüülimist ATP tootmiseks ja neil on madal metaboolne aktiivsus. Teisest küljest suurendab HSC aktiveerimine mitokondriaalset hingamist ja biosünteesi, et kompenseerida glükolüütilisse olekusse sisenemise energiavajadust [44]. Asjaolu, et IPA ei mõjutanud metaboolset potentsiaali ja ECAR-i, viitab sellele, et glükolüütiline rada on vähem prioritiseeritud. Sarnaselt näitas teine ​​uuring, et 1 mM IPA suutis moduleerida mitokondriaalse hingamisahela aktiivsust kardiomüotsüütides, inimese hepatotsüütide rakuliinis (Huh7) ja inimese nabanööri veeni endoteelirakkudes (HUVEC); Siiski ei leitud IPA mõju kardiomüotsüütide glükolüüsile, mis viitab sellele, et IPA võib mõjutada teiste rakutüüpide bioenergeetikat [45]. Seetõttu oletame, et 1 mM IPA võib toimida kerge keemilise lahtisidujana, kuna see võib oluliselt vähendada fibrogeenset geeniekspressiooni, rakkude morfoloogiat ja mitokondriaalset bioenergeetikat ilma mtDNA hulka muutmata [46]. Mitokondriaalsed lahtisidujad võivad pärssida kultuuri poolt indutseeritud fibroosi ja HSC aktivatsiooni [47] ning vähendada mitokondriaalse ATP tootmist, mida reguleerivad või indutseerivad teatud valgud, näiteks lahtisiduvad valgud (UCP) või adeniini nukleotiidtranslokaas (ANT). Sõltuvalt rakutüübist võib see nähtus kaitsta rakke apoptoosi eest ja/või soodustada apoptoosi [46]. IPA rolli selgitamiseks mitokondriaalse lahtisidujana vereloome tüvirakkude inaktiveerimisel on aga vaja täiendavaid uuringuid.
Seejärel uurisime, kas mitokondriaalse hingamise muutused kajastuvad elusate LX-2 rakkude mitokondriaalses morfoloogias. Huvitaval kombel muudab TGF-β1 ravi mitokondrite osakaalu sfäärilisest keskmise kujuga, vähendades mitokondriaalset hargnemist ja suurendades DRP1 ekspressiooni, mis on mitokondriaalse lõhustumise võtmetegur [48]. Lisaks on mitokondriaalne fragmentatsioon seotud üldise võrgustiku keerukusega ja üleminek fusioonilt lõhustumisele on kriitilise tähtsusega hematopoeetiliste tüvirakkude (HSC) aktiveerimiseks, samas kui mitokondriaalse lõhustumise pärssimine viib HSC apoptoosini [49]. Seega näitavad meie tulemused, et TGF-β1 ravi võib esile kutsuda mitokondriaalse võrgustiku keerukuse vähenemise koos hargnemise vähenemisega, mis on sagedasem aktiveeritud hematopoeetiliste tüvirakkudega (HSC) seotud mitokondriaalse lõhustumise korral. Lisaks näitasid meie andmed, et IPA võib muuta mitokondrite osakaalu sfäärilisest keskmise kujuga, vähendades seeläbi OPA1 ja MFN2 ekspressiooni. Uuringud on näidanud, et OPA1 allareguleerimine võib põhjustada mitokondriaalse membraanipotentsiaali vähenemist ja vallandada rakkude apoptoosi [50]. On teada, et MFN2 vahendab mitokondriaalset fusiooni ja apoptoosi [51]. Saadud tulemused näitavad, et LX-2 rakkude indutseerimine TGF-β1 ja/või IPA poolt näib moduleerivat mitokondrite kuju ja suurust, samuti aktivatsiooni olekut ja võrgu keerukust.
Meie tulemused näitavad, et TGFβ-1 ja IPA kombinatsioonravi võib vähendada mtDNA ja rakkude morfoloogilisi parameetreid, reguleerides fibroosi, apoptoosi ja ellujäämisega seotud geenide mRNA ekspressiooni apoptoosi vältivates rakkudes. IPA vähendas tõepoolest AKT1 ja oluliste fibroosi geenide, näiteks COL1A2 ja MMP2, mRNA ekspressioonitaset, kuid suurendas CASP8 ekspressioonitaset, mis on seotud apoptoosiga. Meie tulemused näitasid, et pärast IPA-ravi vähenes BAX ekspressioon ja suurenes TIMP1 perekonna allüksuste, BCL-2 ja NF-κB mRNA ekspressioon, mis viitab sellele, et IPA võib stimuleerida ellujäämissignaale hematopoeetilistes tüvirakkudes (HSC-des), mis väldivad apoptoosi. Need molekulid võivad toimida ellujäämist soodustavate signaalidena aktiveeritud hematopoeetilistes tüvirakkudes, mis võib olla seotud antiapoptootiliste valkude (näiteks Bcl-2) suurenenud ekspressiooniga, proapoptootilise BAX ekspressiooni vähenemisega ning keerulise koosmõjuga TIMP ja NF-κB vahel [5, 7]. IPA avaldab oma mõju PXR kaudu ja me leidsime, et kombinatsioonravi TGF-β1 ja IPA-ga suurendas PXR mRNA ekspressioonitaset, mis viitab HSC aktivatsiooni pärssimisele. Aktiveeritud PXR signaalimine on teadaolevalt pärsib HSC aktivatsiooni nii in vivo kui ka in vitro [52, 53]. Meie tulemused näitavad, et IPA võib osaleda aktiveeritud HSC-de kliirensis, soodustades apoptoosi, vähendades fibroosi ja mitokondriaalset metabolismi ning tugevdades ellujäämissignaale, mis on tüüpilised protsessid, mis muudavad aktiveeritud HSC fenotüübi inaktiveerituks. Teine võimalik seletus IPA võimalikule mehhanismile ja rollile apoptoosis on see, et see püüab kinni düsfunktsionaalseid mitokondreid peamiselt mitofagia (sisemine rada) ja välise TNF signaaliraja kaudu (tabel 1), mis on otseselt seotud NF-κB ellujäämissignaalirajaga (lisajoonis 7). Huvitaval kombel on IPA-ga seotud rikastatud geenid võimelised indutseerima pro-apoptootilisi ja pro-ellujäämise signaale apoptootilises rajas [54], mis viitab sellele, et IPA võib indutseerida apoptootilist rada või ellujäämist, suheldes nende geenidega. Siiski jääb ebaselgeks, kuidas IPA indutseerib apoptoosi või ellujäämist HSC aktiveerimise ajal ja selle mehhanistlikud rajad.
IPA on mikroobne metaboliit, mis moodustub toidus leiduvast trüptofaanist soolestiku mikrobioota kaudu. Uuringud on näidanud, et sellel on soolestikus põletikuvastased, antioksüdantsed ja epigeneetilised regulatiivsed omadused.[55] Uuringud on näidanud, et IPA võib moduleerida soolebarjääri funktsiooni ja vähendada oksüdatiivset stressi, mis võib kaasa aidata selle lokaalsetele füsioloogilistele efektidele.[56] Tegelikult transporditakse IPA sihtorganitesse vereringe kaudu ja kuna IPA-l on sarnane peamine metaboliidi struktuur trüptofaani, serotoniini ja indooli derivaatidega, avaldab IPA metaboolseid toimeid, mille tulemuseks on konkureerivad metaboolsed saatus.[52] IPA võib konkureerida trüptofaanist saadud metaboliitidega ensüümide või retseptorite seondumiskohtade pärast, mis võib potentsiaalselt häirida normaalseid ainevahetusradasid. See rõhutab vajadust edasiste uuringute järele selle farmakokineetika ja farmakodünaamika kohta, et paremini mõista selle terapeutilist akent.[57] Jääb veel näha, kas see võib esineda ka hematopoeetilistes tüvirakkudes (HSC-des).
Tunnistame, et meie uuringul on teatud piirangud. IPA-ga seotud seoste täpsemaks uurimiseks välistasime II tüüpi diabeediga (T2DM) patsiendid. Tunnistame, et see piirab meie tulemuste laialdast rakendatavust II tüüpi diabeedi ja kaugelearenenud maksahaigusega patsientidele. Kuigi IPA füsioloogiline kontsentratsioon inimese seerumis on 1–10 μM [11, 20], valiti 1 mM IPA kontsentratsioon kõrgeima mittetoksilise kontsentratsiooni [15] ja kõrgeima apoptoosi määra põhjal, kusjuures nekrootiliste rakkude populatsiooni protsendimääras erinevust ei täheldatud. Kuigi käesolevas uuringus kasutati IPA suprafüsioloogilisi tasemeid, puudub praegu IPA efektiivse annuse osas üksmeel [52]. Kuigi meie tulemused on olulised, on IPA laiem metaboolne saatus endiselt aktiivne uurimisvaldkond. Lisaks saadi meie tulemused seerumi IPA taseme ja maksa transkriptide DNA metülatsiooni vahelise seose kohta mitte ainult hematopoeetilistest tüvirakkudest (HSC-dest), vaid ka maksakoest. Valisime inimese LX-2 rakud, tuginedes meie varasematele transkriptoomianalüüsi tulemustele, mille kohaselt IPA on seotud hematopoeetiliste tüvirakkude (HSC) aktivatsiooniga [15] ning HSC-d on peamised rakud, mis osalevad maksafibroosi progresseerumises. Maks koosneb mitmest rakutüübist, seega tuleks IPA rolli ja selle interaktsiooni teiste maksarakkude tüüpidega uurimiseks kaaluda ka teisi rakumudeleid, näiteks hepatotsüütide-HSC-immuunrakkude kokultuuri süsteemi koos kaspaasi aktivatsiooni ja DNA fragmentatsiooniga, samuti toimemehhanismi, sealhulgas valgu taset.