Erinevad taimekaitse teooriad pakuvad olulist teoreetilist juhendamist taimede spetsialiseerunud ainevahetuse mustrite selgitamiseks, kuid nende peamised ennustused vajavad veel testimist. Siin kasutasime erapooletut tandem-massispektromeetria (MS/MS) analüüsi, et süstemaatiliselt uurida tubaka nõrgestatud tüvede metaboliite üksikutest taimedest populatsioonideni ja lähedalt seotud liikideni ning töötlesime suurt hulka massispektromeetrilisi tunnusteooriaid, mis põhinevad teabes sisalduvatel ühendite spektritel. Raamistik optimaalse kaitse (OD) ja liikuva sihtmärgi (MT) teooriate peamiste ennustuste testimiseks. Taimede metaboloomika infokomponent on kooskõlas OD teooriaga, kuid on vastuolus MT teooria peamise ennustusega taimtoiduliste põhjustatud metaboloomika dünaamika kohta. Mikro- kuni makroevolutsioonilisest skaalast identifitseeriti jasmonaadi signaal OD peamise määrajana, samas kui etüleeni signaal pakkus MS/MS molekulaarse võrgustiku poolt annoteeritud taimtoidulisele spetsiifilisele vastusele peenhäälestust.
Erineva struktuuriga spetsiifilised metaboliidid on peamised osalejad taimede keskkonnaga kohanemisel, eriti vaenlaste kaitsmisel (1). Taimedes leiduva spetsiifilise ainevahetuse hämmastav mitmekesistumine on ergutanud aastakümneid kestnud põhjalikku uurimistööd selle paljude ökoloogiliste funktsioonide aspektide kohta ning on moodustanud pika nimekirja taimekaitseteooriatest, mis käsitlevad taimede ja putukate interaktsioonide evolutsioonilist ja ökoloogilist arengut. Empiirilised uuringud annavad olulist juhendamist (2). Need taimekaitseteooriad ei järginud aga hüpoteetilise deduktiivse arutluskäigu normatiivset rada, kus peamised ennustused olid samal analüüsitasemel (3) ja neid testiti eksperimentaalselt, et edendada teoreetilise arengu järgmist tsüklit (4). Tehnilised piirangud piiravad andmete kogumist konkreetsete ainevahetuskategooriatega ja välistavad spetsialiseerunud metaboliitide põhjaliku analüüsi, takistades seega kategooriatevahelist võrdlust, mis on teoreetilise arengu jaoks hädavajalik (5). Põhjalike metaboloomikaandmete ja ühise valuuta puudumine ainevahetusruumi töötlemise töövoo võrdlemiseks erinevate taimerühmade vahel takistab valdkonna teaduslikku küpsust.
Tandem-massispektromeetria (MS/MS) metaboloomika valdkonna uusimad arengud võimaldavad igakülgselt iseloomustada metaboolseid muutusi antud süsteemi klaadi liikide sees ja nende vahel ning neid saab kombineerida arvutusmeetoditega, et arvutada nende keeruliste segude struktuurilist sarnasust. Eelnevad keemiaalased teadmised (5). Täiustatud tehnoloogiate kombinatsioon analüüsis ja arvutustes pakub vajaliku raamistiku paljude metaboolse mitmekesisuse ökoloogiliste ja evolutsiooniliste teooriate ennustuste pikaajaliseks testimiseks. Shannon (6) tutvustas infoteooriat esmakordselt oma 1948. aasta olulises artiklis, pannes aluse info matemaatilisele analüüsile, mida on kasutatud paljudes muudes valdkondades peale selle algse rakenduse. Genoomikas on infoteooriat edukalt rakendatud järjestuse konservatiivse info kvantifitseerimiseks (7). Transkriptoomika uuringutes analüüsib infoteooria transkriptoomi üldisi muutusi (8). Varasemates uuringutes rakendasime infoteooria statistilist raamistikku metaboloomikale, et kirjeldada taimede koe taseme metaboolset ekspertiisi (9). Siin ühendame MS/MS-põhise töövoo infoteooria statistilise raamistikuga, mida iseloomustab metaboolne mitmekesisus ühisrahas, et võrrelda taimtoiduliste poolt indutseeritud metaboliidi taimekaitseteooria peamisi ennustusi.
Taimekaitse teoreetilised raamistikud on tavaliselt vastastikku kaasavad ja neid saab jagada kahte kategooriasse: need, mis püüavad selgitada taimespetsiifiliste metaboliitide jaotust kaitsefunktsioonide põhjal, näiteks optimaalse kaitse (OD) (10), liikuva sihtmärgi (MT) (11) ja välimuse (12) teooria, samas kui teised otsivad mehaanilisi selgitusi selle kohta, kuidas ressursside kättesaadavuse muutused mõjutavad taimede kasvu ja spetsialiseerunud metaboliitide, näiteks süsiniku, akumuleerumist: toitainete tasakaalu hüpotees (13), kasvukiiruse hüpotees (14) ning kasvu ja diferentseerumise tasakaalu hüpotees (15). Need kaks teooriate komplekti on erinevatel analüüsitasanditel (4). Siiski domineerivad taimede konstitutiivse ja indutseeritava kaitse teemalises vestluses kaks teooriat, mis hõlmavad kaitsefunktsioone funktsionaalsel tasandil: OD-teooria, mis eeldab, et taimed investeerivad oma kallistesse keemilistesse kaitsemehhanismidesse ainult vajadusel, näiteks kui neid alla neelatakse. Kui rohuloom ründab, määratakse seega tulevase rünnaku võimalikkuse järgi kaitsefunktsiooniga ühend (10); MT hüpotees väidab, et metaboliidi suunatud muutuste telge ei ole, vaid metaboliit muutub juhuslikult, luues seega võimaluse takistada ründavate taimtoiduliste metaboolset „liikumissihtmärki“. Teisisõnu, need kaks teooriat teevad taimtoiduliste rünnaku järel toimuva metaboolse ümberkujunemise kohta vastandlikke ennustusi: seos kaitsva funktsiooniga metaboliitide ühesuunalise akumuleerumise (OD) ja suunamata metaboolsete muutuste (MT) vahel (11).
OD ja MT hüpoteesid hõlmavad lisaks metaboliidi indutseeritud muutustele ka nende metaboliitide akumuleerumise ökoloogilisi ja evolutsioonilisi tagajärgi, näiteks nende metaboolsete muutuste adaptiivseid kulusid ja eeliseid konkreetses ökoloogilises keskkonnas (16). Kuigi mõlemad hüpoteesid tunnistavad spetsialiseerunud metaboliitide kaitsvat funktsiooni, mis võib olla kulukas või mitte, seisneb OD ja MT hüpoteese eristav peamine ennustus indutseeritud metaboolsete muutuste suundumuses. OD teooria ennustus on seni pälvinud kõige rohkem eksperimentaalset tähelepanu. Need testid hõlmavad spetsiifiliste ühendite erinevate kudede otseste või kaudsete kaitsefunktsioonide uurimist kasvuhoonetes ja looduslikes tingimustes, samuti muutusi taimede arengujärgus (17–19). Siiski on seni, kuna puudub töövoog ja statistiline raamistik mis tahes organismi metaboolse mitmekesisuse globaalseks terviklikuks analüüsiks, kahe teooria peamine erinevuse ennustus (st metaboolsete muutuste suund) veel testimata. Siin pakume sellist analüüsi.
Taimespetsiifiliste metaboliitide üks olulisemaid omadusi on nende äärmuslik struktuuriline mitmekesisus kõigil tasanditel, alates üksikutest taimedest ja populatsioonidest kuni sarnaste liikideni (20). Populatsiooni tasandil võib täheldada paljusid spetsialiseerunud metaboliitide kvantitatiivseid muutusi, samas kui liikide tasandil säilivad tavaliselt tugevad kvalitatiivsed erinevused (20). Seetõttu on taimede ainevahetuslik mitmekesisus funktsionaalse mitmekesisuse peamine aspekt, mis peegeldab kohanemisvõimet erinevate niššidega, eriti nende niššidega, kus on erinevad invasioonivõimalused spetsiifiliste putukate ja tavaliste taimtoiduliste poolt (21). Alates Fraenkeli (22) murrangulisest artiklist taimespetsiifiliste metaboliitide olemasolu põhjuste kohta on interaktsioone erinevate putukatega peetud oluliseks valikurõhuks ja arvatakse, et need interaktsioonid on evolutsiooni käigus taimi kujundanud. Ainevahetusrada (23). Liikidevahelised erinevused spetsialiseerunud metaboliitide mitmekesisuses võivad peegeldada ka füsioloogilist tasakaalu, mis on seotud konstitutiivse ja indutseeritava taimekaitsega taimtoiduliste strateegiate vastu, kuna need kaks liiki on sageli omavahel negatiivses korrelatsioonis (24). Kuigi hea kaitse säilitamine võib olla kasulik igal ajal, pakuvad kaitsega seotud õigeaegsed metaboolsed muutused selgeid eeliseid, võimaldades taimedel eraldada väärtuslikke ressursse muudeks füsioloogilisteks investeeringuteks (19, 24) ja vältida sümbioosi vajadust. Kaasnev kahju (25). Lisaks võivad need putukate taimtoiduliste põhjustatud spetsialiseerunud metaboliitide ümberkorraldused viia populatsioonis destruktiivse levikuni (26) ja kajastada jasmoonhappe (JA) signaali oluliste looduslike muutuste otseseid näite, mis võivad populatsioonis säilida. Kõrged ja madalad JA signaalid on kompromissid taimtoiduliste vastase kaitse ja konkreetsete liikidega konkureerimise vahel (27). Lisaks kaovad ja muutuvad spetsialiseerunud metaboliitide biosünteesi rajad evolutsiooni käigus kiiresti, mille tulemuseks on ebaühtlane metaboolne jaotus lähedaste liikide vahel (28). Neid polümorfisme saab kiiresti tekitada vastusena muutuvatele taimtoiduliste mustritele (29), mis tähendab, et taimtoiduliste koosluste kõikumine on metaboolse heterogeensuse peamine tegur.
Siin lahendasime konkreetselt järgmised probleemid. (I) Kuidas taimtoiduline putukas taime metaboloomi ümber konfigureerib? (Ii) Millised on metaboolse plastilisuse peamised infokomponendid, mida saab kvantifitseerida, et testida pikaajalise kaitse teooria ennustusi? (Iii) Kas taime metaboloomi tuleks ümber programmeerida ründajale ainuomasel viisil ja kui jah, siis millist rolli mängib taimehormoon konkreetse metaboolse reaktsiooni kohandamisel ning millised metaboliidid aitavad kaasa kaitse liigispetsiifilisusele? (Iv) Kuna paljude kaitse teooriate ennustusi saab laiendada bioloogiliste kudede kõikidele tasanditele, küsisime, kui järjepidev on tekitatud metaboolne reaktsioon sisemisest võrdlusest liikidevahelise võrdluseni? Sel eesmärgil oleme süstemaatiliselt uurinud tubaka nikotiini lehtede metaboloomi. See on ökoloogiline mudeltaim, millel on rikkalik spetsialiseerunud metabolism ja mis on efektiivne kahe kohaliku taimsööja, Lepidoptera Datura (Ms) (väga agressiivne, peamiselt söödud) vastsete vastu. Solanaceae ja Spodoptera littoralis (Sl) taimedel on puuvillaussid omamoodi „perekond“, mille peremeestaimed on Solanaceae ja teised perekondade ja sugukondade taimne toit peremeestaimed. Analüüsisime MS/MS metaboloomika spektrit ja ekstraheerisime infoteooria statistilised kirjeldused, et võrrelda OD ja MT teooriaid. Loome spetsiifilisuse kaardid, et paljastada peamiste metaboliitide identiteet. Analüüsi laiendati N. nasi kohalikule populatsioonile ja lähedastele tubakaliikidele, et analüüsida täpsemalt taimehormoonide signaaliülekande ja OD induktsiooni vahelist kovariantsi.
Taimtoidulise tubaka lehemetaboloomi plastilisuse ja struktuuri üldkaardi jäädvustamiseks kasutasime eelnevalt väljatöötatud analüüsi- ja arvutusvoogu, et taimeekstraktidest saadud kõrge eraldusvõimega andmetest sõltumatuid MS/MS spektreid terviklikult koguda ja dekonvolueerida (9). See diferentseerimata meetod (nimetatakse MS/MS-iks) võimaldab konstrueerida mitteredundantseid ühendite spektreid, mida saab seejärel kasutada kõigi siin kirjeldatud ühendite tasemel analüüside jaoks. Need dekonvolueeritud taimemetaboliidid on erinevat tüüpi, koosnedes sadadest kuni tuhandete metaboliitideni (siin umbes 500–1000 s/MS/MS). Siin käsitleme metaboolset plastilisust infoteooria raamistikus ja kvantifitseerime metaboloomi mitmekesisust ja professionaalsust metaboolse sagedusjaotuse Shannoni entroopia põhjal. Kasutades eelnevalt rakendatud valemit (8), arvutasime indikaatorite komplekti, mida saab kasutada metaboloomi mitmekesisuse (Hj indikaator), metaboolse profiili spetsialiseerumise (δj indikaator) ja üksiku metaboliidi metaboolse spetsiifilisuse (Si indikaator) kvantifitseerimiseks. Lisaks rakendasime taimtoiduliste metaboliitide indutseeritavuse kvantifitseerimiseks suhtelise kauguse plastilisuse indeksit (RDPI) (joonis 1A) (30). Selle statistilise raamistiku piires käsitleme MS/MS spektrit põhilise infoühikuna ja töötleme MS/MS suhtelise arvukuse sagedusjaotuse kaardiks ning seejärel kasutame Shannoni entroopiat metaboliitide mitmekesisuse hindamiseks selle põhjal. Metaboloomide spetsialiseerumist mõõdetakse ühe MS/MS spektri keskmise spetsiifilisusega. Seega teisendatakse mõnede MS/MS klasside arvukuse suurenemine pärast taimtoiduliste indutseerimist spektraalseks indutseeritavuseks, RDPI-ks ja spetsialiseerumiseks, st δj indeksi suurenemiseks, kuna toodetakse rohkem spetsialiseeruvaid metaboliite ja tekib kõrge Si indeks. Hj mitmekesisuse indeksi langemine peegeldab kas genereeritud MS/MS arvu vähenemist või profiili sagedusjaotuse muutumist vähem ühtlases suunas, vähendades samal ajal selle üldist ebakindlust. Si indeksi arvutamise abil on võimalik esile tõsta, milliseid MS/MS-e teatud taimtoidulised indutseerivad ja millised MS/MS-id induktsioonile ei reageeri, mis on võtmeindikaator MT ja OD ennustamise eristamiseks.
(A) Statistilised kirjeldused taimtoiduliste (H1 kuni Hx) MS/MS andmete indutseeritavuse (RDPI), mitmekesisuse (Hj indeks), spetsialiseerumise (δj indeks) ja metaboliidi spetsiifilisuse (Si indeks) kohta. Spetsialiseerumise astme (δj) suurenemine näitab, et keskmiselt toodetakse rohkem taimtoidulistele iseloomulikke metaboliite, samas kui mitmekesisuse vähenemine (Hj) näitab metaboliitide tootmise vähenemist või metaboliitide ebaühtlast jaotumist jaotuskaardil. Si väärtus hindab, kas metaboliit on antud seisundile (antud juhul taimtoidulistele) spetsiifiline või vastupidi, püsib samal tasemel. (B) Kaitseteooria ennustamise kontseptuaalne diagramm, kasutades infoteooria telge. OD-teooria ennustab, et taimtoiduliste rünnak suurendab kaitsemetaboliite, suurendades seeläbi δj. Samal ajal väheneb Hj, kuna profiil reorganiseerub metaboolse teabe väiksema ebakindluse suunas. MT-teooria ennustab, et taimtoiduliste rünnak põhjustab metaboloomis suunamata muutusi, suurendades seeläbi Hj kui suurenenud metaboolse teabe ebakindluse indikaatorit ja põhjustades Si juhusliku jaotuse. Samuti pakkusime välja segamudeli, parima MT, milles mõnede kõrgema kaitseväärtusega metaboliitide sisaldus on eriti suurenenud (kõrge Si väärtus), samas kui teistel on juhuslikud reaktsioonid (madalam Si väärtus).
Kasutades infoteooria deskriptoreid, tõlgendame OD-teooriat ennustamaks, et taimtoiduliste poolt indutseeritud spetsiifilised metaboliitide muutused indutseerimata konstitutiivses olekus viivad (i) metaboolse spetsiifilisuse (Si indeksi) suurenemiseni, mis omakorda suurendab metabonoomilist spetsiifilisust (δj indeks) (teatud spetsiifiliste metaboliitide rühmade suurenemine, millel on kõrgem kaitseväärtus), ja (ii) metaboliitide mitmekesisuse (Hj indeks) vähenemiseni metaboolse sageduse jaotuse muutumise tõttu, mis on rohkem leptiini kehajaotuse suunas. Üksiku metaboliidi tasandil on oodata korrastatud Si jaotust, kus metaboliit suurendab Si väärtust vastavalt oma kaitseväärtusele (joonis 1B). Sellega seoses selgitame MT-teooriat ennustamaks, et ergastus viib (i) metaboliitide mittesuunaliste muutusteni, mille tulemuseks on δj indeksi vähenemine, ja (ii) Hj indeksi suurenemiseni metaboolse ebakindluse suurenemise tõttu. Või juhuslikkuseni, mida saab kvantifitseerida Shannoni entroopia abil üldistatud mitmekesisuse kujul. Mis puutub metaboolsesse koostisse, siis MT-teooria ennustab Si juhuslikku jaotust. Võttes arvesse, et teatud metaboliidid esinevad spetsiifilistes tingimustes spetsiifilistes tingimustes ja teised mitte ning nende kaitsev väärtus sõltub keskkonnast, pakkusime välja ka segakaitsemudeli, milles δj ja Hj jaotuvad Si suunas kaheks. Suureneb igas suunas, ainult teatud metaboliidirühmad, millel on kõrgemad kaitseväärtused, suurendavad Si eriti palju, samas kui teistel on juhuslik jaotus (joonis 1B).
Infoteooria deskriptori teljel ümberdefineeritud kaitseteooria ennustuse testimiseks kasvatasime Nepenthes pallens'i lehtedel ekspert- (Ms) või generalist- (Sl) taimtoiduliste vastseid (joonis 2A). MS/MS analüüsi abil saime röövikute söötmise järel kogutud lehtede metanooliekstraktidest 599 mitteredundantset MS/MS spektrit (andmefail S1). RDPI, Hj ja δj indeksite kasutamine MS/MS konfiguratsioonifailide infosisu rekonfiguratsiooni visualiseerimiseks paljastab huvitavaid mustreid (joonis 2B). Üldine trend on see, et nagu infodeskriptor kirjeldab, suureneb röövikute lehtede söömise jätkudes aja jooksul kogu metaboolse reorganiseerumise aste: 72 tundi pärast taimtoidulise söömist suureneb RDPI märkimisväärselt. Võrreldes kahjustamata kontrollgrupiga oli Hj oluliselt vähenenud, mis oli tingitud metaboolse profiili suurenenud spetsialiseerumisest, mida kvantifitseeriti δj indeksiga. See ilmne trend on kooskõlas OD-teooria ennustustega, kuid on vastuolus MT-teooria peamiste ennustustega, mis usuvad, et metaboliitide taseme juhuslikke (mittesuunalisi) muutusi kasutatakse kaitsva kamuflaažina (joonis 1B). Kuigi nende kahe taimtoidulise looma suukaudse sekreedi (OS) esilekutsujate sisaldus ja toitumiskäitumine on erinevad, põhjustas nende otsene söötmine sarnaseid muutusi Hj ja δj suundades 24-tunnise ja 72-tunnise kogumisperioodi jooksul. Ainus erinevus ilmnes 72 tundi RDPI-d. Võrreldes Ms-söötmise poolt põhjustatud metabolismiga oli Sl-söötmise poolt indutseeritud üldine metabolism suurem.
(A) Katse ülesehitus: harilikke sigasid (S1) või eksperte (Ms) toidetakse kanntaimede magestatud lehtedega, simuleeritud taimtoidulisuse puhul aga kasutatakse standardiseeritud lehtede haavade punkteerimiseks Ms (W + OSM) OS-i. S1 (W + OSSl) vastsed või vesi (W + W). Kontroll (C) on kahjustamata leht. (B) Indutseeritavuse (RDPI võrreldes kontrolldiagrammiga), mitmekesisuse (Hj indeks) ja spetsialiseerumise (δj indeks) indeks arvutati spetsiaalse metaboliidikaardi (599 MS/MS; andmefail S1) jaoks. Tärnid näitavad olulisi erinevusi otsese taimtoiduliste söötmise ja kontrollrühma vahel (Studenti t-test paarilise t-testiga, *P<0,05 ja ***P<0,001). ns, pole oluline. (C) Peamise (sinine kast, aminohape, orgaaniline hape ja suhkur; andmefail S2) ja spetsiaalse metaboliidi spektri (punane kast 443 MS/MS; andmefail S1) ajaresolutsiooni indeks pärast simuleeritud taimtoiduliste töötlemist. Värviline riba tähistab 95% usaldusvahemikku. Tärn näitab olulist erinevust töötlemist ja kontrolli [variatsiooni ruutanalüüs (ANOVA), millele järgneb Tukey ausalt oluline erinevus (HSD) post hoc mitmekordsete võrdluste jaoks, *P<0,05, **P<0,01 ja *** P <0,001]. (D) Hajumisdiagrammide ja spetsiaalsete metaboliidiprofiilide spetsialiseerumine (korduvad proovid erinevate töötlustega).
Et uurida, kas taimtoiduliste poolt indutseeritud ümberkujunemine metaboloomi tasandil kajastub üksikute metaboliitide taseme muutustes, keskendusime kõigepealt metaboliitidele, mida on varem uuritud Nepenthes pallens'i lehtedes, millel on tõestatud taimtoiduliste resistentsus. Fenoolamiidid on hüdroksütsinnaamiid-polüamiini konjugaadid, mis akumuleeruvad putukate taimtoidulise protsessi käigus ja mis teadaolevalt vähendavad putukate sooritusvõimet (32). Otsisime vastavate MS/MS eelkäijaid ja joonistasime graafikule nende kumulatiivsed kineetilised kõverad (joonis S1). Pole üllatav, et fenooli derivaadid, mis ei ole otseselt seotud taimtoiduliste vastase kaitsega, näiteks klorogeenhape (CGA) ja rutiin, on pärast taimtoidulist eluviisi allareguleeritud. Seevastu taimtoidulised võivad muuta fenooliamiidid väga tugevaks. Kahe taimtoidulise pidev toitumine andis tulemuseks peaaegu sama fenooliamiidide ergastusspektri ja see muster oli eriti ilmne fenooliamiidide de novo sünteesi puhul. Sama nähtust täheldatakse ka 17-hüdroksügeranüülnonanedioolditerpeenglükosiidide (17-HGL-DTG) raja uurimisel, mis toodab suurt hulka atsüklilisi diterpeene, millel on tõhusad taimtoiduvastased funktsioonid (33), millest Ms söötmine Sl-ga vallandas sarnase ekspressiooniprofiili (joonis S1).
Otsese taimtoiduliste söötmise katsete võimalik puudus on taimtoiduliste lehtede tarbimise kiiruse ja söömisaja erinevus, mis raskendab haavade ja taimtoiduliste põhjustatud taimtoidulistele omaste mõjude kõrvaldamist. Taimtoiduliste liikide spetsiifilisuse paremaks lahendamiseks indutseeritud lehtede ainevahetusreaktsioonis simuleerisime Ms ja Sl vastsete toitumist, rakendades värskelt kogutud OS-i (OSM ja OSS1) koheselt standardsele W punktsioonile järjepidevate lehtede positsioonide korral. Seda protseduuri nimetatakse W + OS-töötluseks ja see standardiseerib indutseerimist, ajastades täpselt taimtoidulise esilekutsutud reaktsiooni algust, põhjustamata kudede kadumise kiiruse või koguse erinevuste segavaid mõjusid (joonis 2A) (34). MS/MS analüüsi ja arvutusprotsessi abil saime 443 MS/MS spektrit (andmefail S1), mis kattusid varem otsese söötmise katsetest kokku pandud spektritega. Selle MS/MS andmestiku infoteoreetiline analüüs näitas, et lehtedele spetsialiseerunud metaboloomide ümberprogrammeerimine taimtoiduliste simuleerimise teel näitas OS-spetsiifilisi indutseerimisi (joonis 2C). Täpsemalt, võrreldes OSS1-töötlusega põhjustas OSM metaboloomide spetsialiseerumise suurenemise 4 tunni pärast. Väärib märkimist, et võrreldes otsese taimtoiduliste söötmise eksperimentaalse andmekogumiga, visualiseeriti kahemõõtmelises ruumis metaboolne kineetika, kasutades koordinaatidena Hj ja δj, ning metaboloomide spetsialiseerumise suund vastusena simuleeritud taimtoiduliste töötlemisele aja jooksul järjepidevalt (joonis 2D). Samal ajal kvantifitseerisime aminohapete, orgaaniliste hapete ja suhkrute sisaldust (andmefail S2), et uurida, kas see metaboloomide asjatundlikkuse sihipärane suurenemine on tingitud tsentraalse süsiniku metabolismi ümberkonfiguratsioonist vastusena simuleeritud taimtoidulistele (joonis S2). Selle mustri paremaks selgitamiseks jälgisime täiendavalt eelnevalt käsitletud fenolamiidi ja 17-HGL-DTG radade metaboolse akumulatsiooni kineetikat. Taimtoiduliste OS-spetsiifiline indutseerimine muundub fenolamiidi metabolismi diferentsiaalseks ümberkorraldusmustriks (joonis S3). OSS1 indutseerib eelistatult kumariini ja kofeüülfragmente sisaldavaid fenoolamiide, samas kui OSM-id käivitavad spetsiifilise ferulüülkonjugaatide induktsiooni. 17-HGL-DTG raja puhul tuvastati diferentsiaalne OS-i indutseerimine allavoolu malonüülimise ja dimalonüülimise produktide poolt (joonis S3).
Järgmisena uurisime OS-i indutseeritud transkriptoomi plastilisust, kasutades ajalise kulgemise mikrokiibi andmekogumit, mis simuleerib OSM-ide kasutamist rosetitaimede lehtede töötlemiseks taimtoidulistel. Proovivõtu kineetika kattub põhimõtteliselt käesolevas metaboloomika uuringus kasutatud kineetikaga (35). Võrreldes metaboloomi rekonfiguratsiooniga, kus metaboolne plastilisus aja jooksul eriti suureneb, täheldame Ms-i indutseeritud lehtedes mööduvaid transkriptsioonipurskeid, kus transkriptoomi indutseeritavus (RDPI) ja spetsialiseerumine (δj) on 1. Sellel ajahetkel täheldati tundide ja mitmekesisuse (Hj) olulist suurenemist, BMP1 ekspressioon vähenes oluliselt, millele järgnes transkriptoomi spetsialiseerumise leevenemine (joonis S4). Metaboolsed geeniperekonnad (nagu P450, glükosüültransferaas ja BAHD atsüültransferaas) osalevad spetsiaalsete metaboliitide kokkupanemise protsessis primaarsest metabolismist saadud struktuuriüksustest, järgides eelpool mainitud varajast kõrge spetsialiseerumise mudelit. Juhtumiuuringuna analüüsiti fenüülalaniini rada. Analüüs kinnitas, et fenolamiidi metabolismi põhigeenid on taimtoidulistel võrreldes ligitõmbamata taimedega tugevalt OS-indutseeritud ning nende ekspressioonimustrid on omavahel tihedalt seotud. Transkriptsioonifaktor MYB8 ja struktuurgeenid PAL1, PAL2, C4H ja 4CL selle raja ülesvoolu näitasid transkriptsiooni varajast initsiatsiooni. Atsüültransferaasid, millel on roll fenolamiidi lõplikus kokkupanekus, näiteks AT1, DH29 ja CV86, näitavad pikaajalist ülesreguleerimise mustrit (joonis S4). Ülaltoodud tähelepanekud näitavad, et transkriptoomi spetsialiseerumise varajane initsiatsioon ja metaboloomika spetsialiseerumise hilisem süvenemine on seotud režiimiga, mis võib olla tingitud sünkroonsest regulatsioonisüsteemist, mis käivitab võimsa kaitsereaktsiooni.
Taimehormoonide signaaliülekande rekonfiguratsioon toimib regulatiivse kihina, mis integreerib taimtoidulise informatsiooni taimede füsioloogia ümberprogrammeerimiseks. Pärast taimtoiduliste simulatsiooni mõõtsime peamiste taimehormoonide kategooriate kumulatiivset dünaamikat ja visualiseerisime nendevahelise ajalist koekspressiooni [Pearsoni korrelatsioonikordaja (PCC) > 0,4] (joonis 3A). Nagu oodatud, on biosünteesiga seotud taimehormoonid taimehormoonide koekspressioonivõrgustikus seotud. Lisaks kaardistatakse sellesse võrgustikku metaboolne spetsiifilisus (Si indeks), et esile tõsta erinevate töötluste poolt indutseeritud taimehormoone. Joonisel on välja toodud kaks peamist taimtoiduliste spetsiifilise vastuse valdkonda: üks on JA klastris, kus JA (selle bioloogiliselt aktiivne vorm JA-Ile) ja teised JA derivaadid näitavad kõrgeimat Si skoori; teine ​​on etüleen (ET). Giberelliin näitas taimtoiduliste spetsiifilisuses vaid mõõdukat suurenemist, samas kui teistel taimehormoonidel, nagu tsütokiniin, auksiin ja abstsisiinhape, oli taimtoiduliste suhtes madal induktsioonispetsiifilisus. Võrreldes ainult W + W kasutamisega, saab JA derivaatide tippväärtuse võimendamist OS-i rakenduse (W + OS) kaudu põhimõtteliselt muuta JA-de tugevaks spetsiifiliseks indikaatoriks. Ootamatult on teada, et erineva elicitori sisaldusega OSM ja OSS1 põhjustavad JA ja JA-Ile sarnast akumuleerumist. Erinevalt OSS1-st indutseerivad OSM-id OSM-i spetsiifiliselt ja tugevalt, samas kui OSS1 ei võimenda basaalhaavade vastust (joonis 3B).
(A) Koekspressioonivõrgustiku analüüs, mis põhineb taimtoiduliste poolt indutseeritud taimehormoonide akumuleerumise kineetika simulatsiooni PCC arvutamisel. Sõlm esindab üksikut taimehormooni ja sõlme suurus esindab taimehormoonile spetsiifilist Si indeksit töötluste vahel. (B) JA, JA-Ile ja ET akumuleerumine lehtedes erinevate töötluste tagajärjel, mida tähistavad erinevad värvid: aprikoos, W + OSM; sinine, W + OSSl; must, W + W; hall, C (kontroll). Tärnid näitavad olulisi erinevusi töötluste ja kontrollrühma vahel (kahesuunaline ANOVA, millele järgneb Tukey HSD post hoc mitmekordne võrdlus, *** P <0,001). (C)697 MS/MS (andmefail S1) infoteoreetiline analüüs JA biosünteesi ja häiritud tajuspektri (irAOC ja irCOI1) ning (D)585 MS/MS (andmefail S1) infoteoreetiline analüüs ETR1-s häiritud ET signaaliga. Kaks simuleeritud taimtoiduliste töötlust käivitasid taimeliinid ja tühja vehiikliga (EV) kontrolltaimed. Tärnid näitavad olulisi erinevusi W+OS-i töötlemise ja kahjustamata kontrollrühma vahel (kahesuunaline ANOVA, millele järgneb Tukey HSD post hoc mitmekordne võrdlus, *P<0,05, **P<0,01 ja ***P<0,001). (E) Hajutatud graafikud, mis kujutavad hajutatud vastuseisi spetsialiseerumisele. Värvid tähistavad erinevaid geneetiliselt muundatud tüvesid; sümbolid tähistavad erinevaid töötlemismeetodeid: kolmnurk, W + OSS1; ristkülik, W + OSM; ring C
Järgmisena kasutame JA ja ET biosünteesi (irAOC ja irACO) ning taju (irCOI1 ja sETR1) võtmeetappides nõrgestatud Nepenthes'i geneetiliselt muundatud tüve (irCOI1 ja sETR1), et analüüsida nende kahe taimehormooni metabolismi taimtoidulistel. Ümberprogrammeerimise suhteline panus. Kooskõlas varasemate katsetega kinnitasime taimtoiduliste OS-i indutseerimist tühjades kandjates (EV) taimedes (joonis 3, C kuni D) ja OSM-i poolt põhjustatud Hj indeksi üldist langust, samal ajal kui δj indeks suurenes. Vastus on väljendunud rohkem kui OSS1 poolt esile kutsutud vastus. Kahejooneline graafik, kus Hj ja δj on koordinaatidena, näitab spetsiifilist deregulatsiooni (joonis 3E). Kõige ilmsem trend on see, et JA signaalita tüvedel on taimtoiduliste poolt põhjustatud metaboloomide mitmekesisus ja spetsialiseerumise muutused peaaegu täielikult välistatud (joonis 3C). Seevastu vaikne ET-taju sETR1 taimedes, kuigi selle üldine mõju taimtoiduliste ainevahetuse muutustele on palju väiksem kui JA signaaliülekandel, nõrgestab see Hj ja δj indeksite erinevust OSM ja OSS1 ergastuste vahel (joonis 3D ja joonis S5). See näitab, et lisaks JA signaaliülekande põhifunktsioonile toimib ET-signaaliülekanne ka taimtoiduliste liigispetsiifilise ainevahetusreaktsiooni peenhäälestamiseks. Kooskõlas selle peenhäälestusfunktsiooniga ei täheldatud sETR1 taimedes üldise metaboliidi indutseeritavuse muutust. Teisest küljest, võrreldes sETR1 taimedega, indutseerisid irACO taimed taimtoiduliste põhjustatud ainevahetuslike muutuste üldise amplituudi sarnaselt, kuid näitasid OSM ja OSS1 stimuleerimise vahel oluliselt erinevaid Hj ja δj skoori (joonis S5).
Selleks, et tuvastada spetsialiseerunud metaboliite, millel on oluline panus taimtoiduliste liigispetsiifilises reaktsioonis, ja täpsustada nende tootmist ET-signaalide abil, kasutasime eelnevalt väljatöötatud struktuurset MS/MS-meetodit. See meetod tugineb bi-klastrite meetodile, et järeldada metaboolset perekonda MS/MS-fragmentide [normaliseeritud skalaarkorrutis (NDP)] ja neutraalse kao (NL) põhjal sarnasuse skooriga. ET-transgeensete liinide analüüsi teel loodud MS/MS-andmestik andis 585 MS/MS-i (andmefail S1), mis eraldati, klasterdades need seitsmeks peamiseks MS/MS-mooduliks (M) (joonis 4A). Mõned neist moodulitest on tihedalt pakitud eelnevalt iseloomustatud spetsiifiliste metaboliitidega: näiteks M1, M2, M3, M4 ja M7 on rikkad mitmesuguste fenooliderivaatide (M1), flavonoidglükosiidide (M2), atsüülsuhkrute (M3 ja M4) ja 17-HGL-DTG (M7) poolest. Lisaks arvutatakse iga mooduli üksiku metaboliidi ainevahetusspetsiifiline teave (Si indeks) ja selle Si jaotust on intuitiivselt näha. Lühidalt öeldes iseloomustavad kõrge taimtoidulisuse ja genotüübi spetsiifilisusega MS/MS spektreid kõrged Si väärtused ning ekstsesssuse statistika näitab karva jaotumist paremas sabanurgas. Üks selline lahja kolloidjaotus tuvastati M1-s, kus fenoolamiid näitas kõrgeimat Si fraktsiooni (joonis 4B). Eelnevalt mainitud taimtoiduliste poolt indutseeritav 17-HGL-DTG M7-s näitas mõõdukat Si skoori, mis näitab mõõdukat diferentsiaalse regulatsiooni astet kahe OS-tüübi vahel. Seevastu on enamik konstitutiivselt toodetud spetsialiseerunud metaboliite, nagu rutiin, CGA ja atsüülsuhkrud, madalaimate Si skooridega. Spetsiifiliste metaboliitide struktuurilise keerukuse ja Si jaotuse paremaks uurimiseks konstrueeriti iga mooduli jaoks molekulaarne võrgustik (joonis 4B). OD-teooria oluline ennustus (kokku võetud joonisel 1B) on see, et spetsiaalsete metaboliitide reorganiseerumine pärast taimtoidulist eluviisi peaks viima ühesuunaliste muutusteni kõrge kaitseväärtusega metaboliitides, eriti suurendades nende spetsiifilisust (erinevalt juhuslikust jaotusest) (Mood). MT-teooria ennustatud kaitsemetaboliit. Enamik M1-s akumuleerunud fenooli derivaatidest on funktsionaalselt seotud putukate sooritusvõime langusega (32). 24 tunni möödudes indutseeritud lehtede ja EV kontrolltaimede koostisosade lehtede M1 metaboliitide Si väärtuste võrdlemisel täheldasime, et paljude metaboliitide metaboolne spetsiifilisus pärast taimtoidulisi putukaid näitab olulist kasvutrendi (joonis 4C). Si väärtuse spetsiifilist suurenemist tuvastati ainult kaitsvates fenooliamiidides, kuid teistes selles moodulis koos esinevates fenoolides ja tundmatutes metaboliitides Si väärtuse suurenemist ei tuvastatud. See on spetsiifiline mudel, mis on seotud OD-teooriaga. Taimtoiduliste põhjustatud metaboolsete muutuste peamised ennustused on kooskõlas. Selleks, et testida, kas OS-spetsiifiline ET indutseeris seda fenolamiidide spektri eripära, joonistasime graafikule metaboliidi Si indeksi ja põhjustasime OSM-i ja OSS1 ekspressiooniväärtuse erinevuse EV ja sETR1 genotüüpides (joonis 4D). sETR1 puhul oli fenolamiidide poolt indutseeritud erinevus OSM-i ja OSS1 vahel oluliselt vähenenud. Kaheklasterdamise meetodit rakendati ka MS/MS andmetele, mis koguti tüvedest, millel oli ebapiisav JA, et järeldada JA-reguleeritud metaboolse spetsialiseerumisega seotud peamisi MS/MS mooduleid (joonis S6).
(A) 585 MS/MS klastrite tulemused, mis põhinevad jagatud fragmendi (NDP sarnasus) ja jagatud neutraalse kaotuse (NL sarnasus) põhjal, näitavad, et moodul (M) on kooskõlas teadaoleva ühendite perekonnaga või tundmatu või halvasti metaboliseeruva metaboliidi koostisega. Iga mooduli kõrval on näidatud metaboliidi (MS/MS) spetsiifiline (Si) jaotus. (B) Modulaarne molekulaarne võrgustik: sõlmed esindavad MS/MS-i ja servi, NDP (punane) ja NL (sinine) MS/MS skoori (piirväärtus > 0,6). Astmeline metaboliidi spetsiifilisuse indeks (Si), mis on värvitud mooduli põhjal (vasakul) ja kaardistatud molekulaarse võrgustikuga (paremal). (C) EV taime moodul M1 konstitutiivses (kontroll) ja indutseeritud olekus (simuleeritud taimtoiduline) 24 tunni möödudes: molekulaarse võrgustiku diagramm (Si väärtus on sõlme suurus, kaitsev fenolamiid on esile tõstetud sinisega). (D) Spektrijoone sETR1 M1 molekulaarvõrgustiku diagramm, millel on häiritud EV ja ET taju: rohelise ringi sõlmega esindatud fenoolne ühend ja oluline erinevus (P-väärtus) W + OSM ja W + OSS1 töötluste vahel sõlme suurusena. CP, N-kofeüültürosiin; CS, N-kofeüülspermidiin; FP, N-feruulhappe ester-kusihape; FS, N-ferulüülspermidiin; CoP, N', N“-kumarolüültürosiin; DCS, N', N”-dikafeüülspermidiin; CFS, N', N”-kofeüül, feruloüülspermidiin; Lycium barbarum hundimarjas Son; Nick. O-AS, O-atsüülsuhkur.
Laiendasime analüüsi ühelt nõrgestatud Nepenthes genotüübilt looduslikele populatsioonidele, kus varem on looduslikes populatsioonides kirjeldatud tugevaid liikisisesi muutusi taimtoiduliste JA tasemetes ja spetsiifiliste metaboliitide tasemetes (26). Kasutage seda andmekogumit 43 germplasmi hõlmamiseks. Need germplasmid koosnevad 123 taimeliigist liigist N. pallens. Need taimed võeti seemnetest, mis on kogutud erinevatest looduslikest elupaikadest Utah's, Nevadas, Arizonas ja Californias (joonis S7), arvutasime metaboloomide mitmekesisuse (siin nimetatakse seda populatsiooni tasemeks) β mitmekesisuse ja OSM-i põhjustatud spetsialiseerumise. Kooskõlas varasemate uuringutega täheldasime laia valikut metaboolseid muutusi Hj ja δj telgedel, mis näitab, et germplasmidel on olulisi erinevusi oma metaboolsete reaktsioonide plastilisuses taimtoidulistele (joonis S7). See organisatsioon meenutab varasemaid tähelepanekuid taimtoiduliste põhjustatud JA muutuste dünaamilise ulatuse kohta ja on säilitanud väga kõrge väärtuse ühes populatsioonis (26, 36). Kasutades JA ja JA-Ile abil Hj ja δj vahelise üldise taseme korrelatsiooni testimist, leidsime, et JA ja metaboliidi β mitmekesisuse ja spetsialiseerumise indeksi vahel on oluline positiivne korrelatsioon (joonis S7). See viitab sellele, et taimtoiduliste poolt indutseeritud heterogeensus JA-de indutseerimisel populatsiooni tasandil võib olla tingitud putukate taimtoiduliste seast selektsiooni põhjustatud peamistest metaboolsetest polümorfismidest.
Varasemad uuringud on näidanud, et tubakatüübid erinevad oluliselt tüübi ja indutseeritud ja konstitutiivsete metaboolsete kaitsemehhanismide suhtelise sõltuvuse poolest. Arvatakse, et neid muutusi taimtoiduliste vastastes signaaliülekannetes ja kaitsevõimetes reguleerivad putukate populatsiooni surve, taime elutsükkel ja kaitse tootmiskulud nišis, kus antud liik kasvab. Uurisime kuue Põhja- ja Lõuna-Ameerikast pärit Nicotiana liigi taimtoiduliste poolt esile kutsutud lehtede metaboloomide ümberkujunemise järjepidevust. Need liigid on tihedalt seotud Nepenthes North Americaga, nimelt Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. attenuated grass, Nicotiana tabacum, lineaarne tubakas, tubakas (Nicotiana spegazzinii) ja tubakalehe tubakas (Nicotiana obtusifolia) (joonis 5A) (37). Kuus neist liikidest, sealhulgas hästi iseloomustatud liik N. please, on petuuniate klaadi üheaastased taimed ja obtusifolia N. on Trigonophyllae õeklaadi püsikud (38). Seejärel viidi nende seitsme liigi puhul läbi W + W, W + OSM ja W + OSS1 induktsioon, et uurida putukate toitumise liigitasemel metaboolset ümberkorraldust.
(A) Maksimaalse tõenäosuse põhjal koostatud bootstrapi fülogeneetiline puu [tuuma glutamiini sünteesi jaoks (38)] ja seitsme lähedalt seotud Nicotiana liigi (erinevad värvid) (37) geograafilise jaotuse põhjal. (B) Seitsme Nicotiana liigi metaboolsete profiilide spetsialiseeritud mitmekesisuse hajuvusdiagramm (939 MS/MS; andmefail S1). Liigi tasandil on metaboloomide mitmekesisus negatiivses korrelatsioonis spetsialiseerumise astmega. Liigi tasandil korrelatsiooni analüüs metaboolse mitmekesisuse ja spetsialiseerumise ning JA akumuleerumise vahel on näidatud joonisel 2. S9. Värv, erinevad tüübid; kolmnurk, W + OSS1; ristkülik, W + OSM; (C) Nicotiana JA ja JA-Ile dünaamikad on järjestatud OS-i ergastusamplituudi järgi (kahesuunaline ANOVA ja Tukey HSD pärast mitmekordset võrdlust, * P <0,05, ** P <0,01 ja * ** W + OS ja W + W võrdluseks P <0,001). Iga liigi (D) mitmekesisuse ja (E) spetsialiseerumise kastidiagramm pärast taimtoidulise ja metüül-JA (MeJA) simuleerimist. Tärn näitab olulist erinevust W + OS ja W + W või lanoliin pluss W (Lan + W) või Lan pluss MeJA (Lan + MeJa) ja Lan kontrollrühma vahel (kahesuunaline dispersioonanalüüs, millele järgnes Tukey HSD post hoc mitmekordne võrdlus, *P<0,05, **P<0,01 ja ***P<0,001).
Kasutades kahekordse klastri meetodit, tuvastasime 9 moodulit 939 MS/MS-iga (andmefail S1). Erinevate töötluste abil ümberkonfigureeritud MS/MS-i koostis varieerub liikide lõikes oluliselt (joonis S8). Hj (siin nimetatakse seda liigitaseme γ-mitmekesisuseks) ja δj visualiseerimine näitab, et erinevad liigid agregeeruvad metaboolses ruumis väga erinevatesse rühmadesse, kus liigitaseme jaotus on tavaliselt silmapaistvam kui ergastus. Välja arvatud N. linear ja N. obliquus, näitavad nad induktsiooniefektide laia dünaamilist ulatust (joonis 5B). Seevastu sellistel liikidel nagu N. purpurea ja N. obtusifolia on metaboolne vastus töötlusele vähem ilmne, kuid metaboloom on mitmekesisem. Indutseeritud metaboolse vastuse liigispetsiifiline jaotus andis tulemuseks olulise negatiivse korrelatsiooni spetsialiseerumise ja gamma mitmekesisuse vahel (PCC = -0,46, P = 4,9×10-8). OS-i indutseeritud muutused JA-de tasemetes on positiivses korrelatsioonis metaboloomi spetsialiseerumisega ja negatiivses korrelatsioonis iga liigi metaboolse gamma mitmekesisusega (joonis 5B ja joonis S9). Väärib märkimist, et joonisel 5C kõnekeeles „signaalvastusega“ liikideks nimetatud liigid, näiteks Nepenthes nematodes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute ja Nepenthes attenuated, põhjustasid olulisi märke 30 minuti pärast. Hiljutised OS-spetsiifilised JA ja JA-Ile puhangud, samas kui teised „signaalile mittereageerivad“ bakterid, näiteks Nepenthes mills, Nepenthes powdery ja N. obtusifolia, näitavad ainult JA-Ile Edge induktsiooni ilma OS-spetsiifilisuseta (joonis 5C). Nagu eespool mainitud, näitasid nõrgestatud Nepenthes'i puhul metaboolsel tasandil signaalile reageerivad ained OS-spetsiifilisust ja suurendasid oluliselt δj, vähendades samal ajal Hj. Seda OS-spetsiifilist eelreaktsiooni efekti ei tuvastatud signaalile mittereageerivate liikidena klassifitseeritud liikidel (joonis 5, D ja E). OS-spetsiifilisi metaboliite jagatakse sagedamini signaalile reageerivate liikide vahel ja need signaaliklastrid koonduvad nõrgema signaalivastusega liikidega, samas kui nõrgema signaalivastusega liikidel on väiksem vastastikune sõltuvus (joonis S8). See tulemus näitab, et JA-de OS-spetsiifiline indutseerimine ja allavoolu metaboliidi OS-spetsiifiline ümberkonfiguratsioon on liikide tasandil seotud.
Järgmisena kasutasime taimede töötlemiseks metüül-JA-d (MeJA) sisaldavat lanoliinipastat, et uurida, kas neid sidumisviise piirab JA kättesaadavus, mida manustab eksogeenne JA taimede tsütoplasmas. Kiire deesterifikatsioon on JA. Leidsime sama trendi järkjärgulise muutumise kohta signaalile reageerivatelt liikidelt signaalile mittereageerivateks liikideks, mis on põhjustatud JA pidevast tarnimisest (joonis 5, D ja E). Lühidalt öeldes programmeeris MeJA-töötlus tugevalt ümber lineaarsete nematoodide N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens ja N. mikimotoi metaboloome, mille tulemuseks oli δj oluline suurenemine ja Hj vähenemine. N. purpurea näitas ainult δj suurenemist, kuid mitte Hj. N. obtusifolia, millel on varem näidatud akumuleerivat äärmiselt madalaid JA-tasemeid, reageerib MeJA-töötlusele samuti halvasti metaboloomide rekonfiguratsiooni osas. Need tulemused näitavad, et JA tootmine või signaaliülekanne on signaalile mittereageerivatel liikidel füsioloogiliselt piiratud. Selle hüpoteesi kontrollimiseks uurisime nelja liiki (N. pallens, N. mills, N. pink ja N. microphylla), mida indutseerisid W + W, W + OSM-id ja W + OSS1 transkriptoom (39). Kooskõlas metaboloomide ümberehituse mustriga on liigid transkriptoomiruumis hästi eraldatud, kusjuures N. attenuated näitas kõrgeimat OS-indutseeritud RDPI-d, samas kui N. gracilis'el oli madalaim (joonis 6A). Siiski leiti, et N. oblonga indutseeritud transkriptoomide mitmekesisus oli nelja liigi seas madalaim, vastupidiselt N. oblonga kõrgeimale metabonoomilisele mitmekesisusele, mida varem täheldati seitsme liigi puhul. Varasemad uuringud on näidanud, et varajaste kaitsesignaalidega, sealhulgas JA-signaalidega seotud geenide komplekt selgitab Nicotiana liikidel taimtoidulistega seotud elicitorite poolt indutseeritud varajaste kaitsereaktsioonide spetsiifilisust (39). JA-signaaliradade võrdlus nende nelja liigi vahel näitas huvitavat mustrit (joonis 6B). Enamik selle raja geene, näiteks AOC, OPR3, ACX ja COI1, näitasid nendes neljas liigis suhteliselt kõrget induktsioonitaset. Kuid võtmegeen, JAR4, muundab JA selle bioloogiliselt aktiivseks JA-Ile akumuleeritud transkriptide vormiks ja selle transkriptsioonitase on väga madal, eriti N. millsis, Nepenthes pierisis ja N. microphyllas. Lisaks ei tuvastatud N. bifidumis ainult teise geeni AOS transkripti. Need geeniekspressiooni muutused võivad olla vastutavad äärmuslike fenotüüpide eest, mille on esile kutsunud signaalanergiliste liikide madal JA produktsioon ja N. gracilis'e indutseerimine.
(A) Nelja lähedaselt suguluses oleva tubakaliigi varajaste transkriptsiooniliste vastuste ümberprogrammeerimise infoteoreetiline analüüs, mis viidi läbi 30 minutit pärast herbivooride indutseerimist. RDPI arvutatakse herbivooride OS-i poolt indutseeritud lehtede ja haavakontrolli vahel võrdlemisel. Värvid tähistavad erinevaid liike ja sümbolid erinevaid töötlemismeetodeid. (B) Geeniekspressiooni analüüs JA signaaliradades nelja liigi vahel. Lihtsustatud JA rada on näidatud kastidiagrammi kõrval. Erinevad värvid tähistavad erinevaid töötlemismeetodeid. Tärn näitab, et W + OS-i töötlemise ja W + W kontrolli vahel on oluline erinevus (Studendi t-testi puhul paarikaupa erinevuste jaoks *P<0,05, **P<0,01 ja ***P<0,001). OPDA, 12-oksofütodieenhape; OPC-8: 0,3-okso-2(2'(Z)-pentenüül)-tsüklopentaan-1-oktaanhape.
Viimases osas uurisime, kuidas erinevate taimeliikide metaboloomi putukaliigipõhine ümberkujunemine võib olla taimtoiduliste suhtes resistentne. Varasemad uuringud rõhutasid Nicotiana perekonda. Nende resistentsus Ms ja vastsete suhtes on väga erinev (40). Siin uurisime selle mudeli ja nende metaboolse plastilisuse vahelist seost. Kasutades ülaltoodud nelja tubakaliiki ja testides korrelatsiooni taimtoiduliste põhjustatud metaboloomi mitmekesisuse ja spetsialiseerumise ning taimede resistentsuse Ms ja Sl suhtes vahel, leidsime, et resistentsus, mitmekesisus ja spetsialiseerumine generalistliku Sl All suhtes on positiivses korrelatsioonis, samas kui korrelatsioon ekspertide resistentsuse ja spetsialiseerumise vahel on nõrk ning korrelatsioon mitmekesisusega ei ole oluline (joonis S10). Mis puudutab S1 resistentsust, siis nii nõrgestatud N. chinensis kui ka N. gracilis, millel varem on näidatud nii JA signaaliülekande taset kui ka metaboloomi plastilisust, reageerisid taimtoiduliste indutseerimisele väga erinevalt ja neil oli ka sarnane kõrge resistentsus. Sugu.
Viimase kuuekümne aasta jooksul on taimekaitseteooria pakkunud teoreetilise raamistiku, mille põhjal on teadlased ennustanud märkimisväärsel hulgal taimedele spetsialiseerunud metaboliitide evolutsiooni ja funktsioone. Enamik neist teooriatest ei järgi tavapärast tugevate järelduste protseduuri (41). Nad pakuvad välja võtmeennustused (3) samal analüüsi tasemel. Kui võtmeennustuste testimine võimaldab konkreetseid teooriaid analüüsida, muudab see valdkonna edasiliikumise keeruliseks. Seda teooriat toetatakse, kuid teised lükatakse tagasi (42). Selle asemel teeb uus teooria ennustusi erinevatel analüüsi tasemetel ja lisab uue kirjeldavate kaalutluste kihi (42). Kuid kahte funktsionaalsel tasandil pakutud teooriat, MT ja OD, saab hõlpsasti seletada kui olulisi ennustusi taimtoiduliste põhjustatud spetsialiseerunud ainevahetusmuutuste kohta: OD teooria usub, et muutused spetsialiseerunud ainevahetusruumis on väga suunatud. MT teooria usub, et need muutused on suunamata ja paiknevad ainevahetusruumis juhuslikult ning neil on tavaliselt kõrge kaitseväärtusega metaboliidid. Varasemaid OD ja MT ennustuste uuringuid on testitud kitsa a priori "kaitse"ühendite komplekti abil. Need metaboliidikesksed testid välistavad võimaluse analüüsida metaboloomi ümberkonfiguratsiooni ulatust ja trajektoori taimtoidulise eluviisi ajal ning ei võimalda järjepideva statistilise raamistiku piires testimist, mis nõuaks võtmeprognoose, mida saab tervikuna käsitleda. Kvantifitseerige taime metaboloomi muutusi. Siin kasutasime arvutuslikul MS-il põhinevat uuenduslikku metaboloomika tehnoloogiat ja teostasime dekonvolutsiooni-MS-analüüsi infoteooria üldise valuuta kirjeldustes, et testida kahe pakutud teooria erinevust globaalsel metaboloomika tasandil. Selle teooria peamine ennustus. Infoteooriat on rakendatud paljudes valdkondades, eriti bioloogilise mitmekesisuse ja toitainete voo uuringute kontekstis (43). Meie teada on see aga esimene rakendus, mida kasutatakse taimede metaboolse inforuumi kirjeldamiseks ja ajutiste metaboolsete muutustega seotud ökoloogiliste probleemide lahendamiseks vastusena keskkonnamärkidele. Eelkõige seisneb selle meetodi võime võrrelda mustreid taimeliikide sees ja nende vahel, et uurida, kuidas taimtoidulised on arenenud erinevatest liikidest liikidevahelisteks makroevolutsioonilisteks mustriteks erinevatel evolutsioonitasanditel. Ainevahetus.
Peakomponentide analüüs (PCA) teisendab mitmemõõtmelise andmekogumi dimensionaalsuse vähendamise ruumi, nii et andmete peamist trendi saab selgitada, seega kasutatakse seda tavaliselt uurimusliku tehnikana andmekogumi parsimiseks, näiteks dekonvolutsioonimetaboloomi analüüsimiseks. Mõõtmenõtmise käigus kaotatakse aga osa andmekogumi infosisust ja PCA ei saa anda kvantitatiivset teavet ökoloogilise teooria jaoks eriti oluliste omaduste kohta, näiteks: kuidas taimtoidulised ümber kujundavad mitmekesisust spetsialiseeritud valdkondades (näiteks rikkus, levik ja arvukus) ja metaboliidid? Millised metaboliidid on antud taimtoidulise indutseeritud seisundi ennustajad? Spetsiifilisuse, mitmekesisuse ja indutseeritavuse vaatenurgast laguneb lehespetsiifilise metaboliidiprofiili infosisu ja leitakse, et taimtoiduliste söömine võib aktiveerida spetsiifilist ainevahetust. Ootamatult täheldasime, et nagu on kirjeldatud rakendatud infoteooria näitajates, on saadud ainevahetusolukorral suur kattumine pärast kahe taimtoidulise (öösööja generalisti Sl) ja Solanaceae eksperdi pr. rünnakuid. Kuigi nende toitumiskäitumine ja kontsentratsioon on oluliselt erinevad. Rasvhappe-aminohappe konjugaadi (FAC) initsiaator OS-is (31). Kasutades taimtoiduliste OS-i standardiseeritud torkehaavade raviks, näitas simuleeritud taimtoiduliste ravi sarnast trendi. See standardiseeritud protseduur taimede reageerimise simuleerimiseks taimtoiduliste rünnakutele kõrvaldab segavad tegurid, mis on põhjustatud taimtoiduliste söömiskäitumise muutustest, mis põhjustavad eri aegadel erineva kahjustuse astme (34). FAC, mis on teadaolevalt OSM-i peamine põhjus, vähendab JAS-i ja teiste taimehormoonide reaktsioone OSS1-s, samas kui OSS1 vähendab seda sadu kordi (31). Siiski põhjustas OSS1 sarnase JA akumuleerumise taseme võrreldes OSM-iga. Varem on näidatud, et JA-vastus nõrgestatud Nepenthes'is on OSM-i suhtes väga tundlik, kus FAC suudab säilitada oma aktiivsuse isegi siis, kui seda lahjendatakse veega vahekorras 1:1000 (44). Seega, võrreldes OSM-iga, kuigi FAC on OSS1-s väga madal, on see piisav JA puhangu esilekutsumiseks. Varasemad uuringud on näidanud, et poriinilaadseid valke (45) ja oligosahhariide (46) saab kasutada molekulaarsete vihjetena taimekaitsereaktsioonide käivitamiseks OSS1-s. Siiski on endiselt ebaselge, kas need OSS1-s esinevad elicitorid vastutavad käesolevas uuringus täheldatud JA akumuleerumise eest.
Kuigi on vähe uuringuid, mis kirjeldavad erinevate taimtoiduliste või eksogeense JA või SA (salitsüülhappe) manustamise põhjustatud diferentsiaalseid metaboolseid sõrmejälgi (47), pole keegi uurinud taimtoiduliste liigispetsiifilist häiritust taimerohu võrgustikus ja selle mõju spetsiifilisele isikuandmetele. Ainevahetuse üldist mõju uuritakse süstemaatiliselt. See analüüs kinnitas veelgi, et sisemise hormoonvõrgustiku seos teiste taimehormoonidega peale JA-de kujundab taimtoiduliste põhjustatud metaboolse reorganiseerimise spetsiifilisust. Eelkõige tuvastasime, et OSM-i põhjustatud ET oli oluliselt suurem kui OSS1 põhjustatud. See režiim on kooskõlas suurema FAC-sisaldusega OSM-is, mis on vajalik ja piisav tingimus ET-purske käivitamiseks (48). Taimede ja taimtoiduliste vastastikmõju kontekstis on ET signaalifunktsioon taimespetsiifilisele metaboliitide dünaamikale endiselt juhuslik ja suunatud ainult ühele ühendite rühmale. Lisaks on enamik uuringuid kasutanud ET või selle eellaste või erinevate inhibiitorite eksogeenset manustamist ET regulatsiooni uurimiseks, mille hulgas need eksogeensed keemilised rakendused tekitavad palju mittespetsiifilisi kõrvaltoimeid. Meie teada on see uuring esimene ulatuslik süstemaatiline uurimus ET rollist ET kasutamises kahjustatud transgeensete taimede tootmiseks ja tajumiseks, et koordineerida taimede metaboloomi dünaamikat. Taimtoidulistele omane ET indutseerimine võib lõppkokkuvõttes moduleerida metaboloomi vastust. Kõige olulisem on ET biosünteesi (ACO) ja taju (ETR1) geenide transgeenne manipuleerimine, mis näitas taimtoidulistele omast fenolamiidide de novo akumuleerumist. Varem on näidatud, et ET suudab JA-indutseeritud nikotiini akumuleerumist peenhäälestada, reguleerides putrestsiini N-metüültransferaasi (49). Mehaanilisest vaatenurgast pole aga selge, kuidas ET fenolamiidide indutseerimist peenhäälestab. Lisaks ET signaaliülekande funktsioonile saab metaboolse voo suunata ka S-adenosüül-1-metioniinile, et reguleerida investeerimist polüaminofenoolamiidide moodustamisse. S-adenosüül-1-metioniin on ET ja polüamiini biosünteesi raja tavaline vaheühend. Mehhanism, mille abil ET-signaal reguleerib fenolamiidide taset, vajab täiendavat uurimist.
Pikka aega ei ole tundmatu struktuuriga spetsiifiliste metaboliitide suure hulga tõttu olnud intensiivne tähelepanu spetsiifilistele ainevahetuskategooriatele võimeline rangelt hindama ainevahetusliku mitmekesisuse ajalisi muutusi pärast bioloogilisi interaktsioone. Praegu on infoteooria analüüsi põhjal MS/MS spektri omandamise peamine tulemus erapooletute metaboliitide põhjal see, et taimtoidulised, kes söövad või imiteerivad taimtoidulisi, vähendavad jätkuvalt lehe metaboloomi üldist ainevahetuslikku mitmekesisust, suurendades samal ajal selle spetsialiseerumise astet. See taimtoiduliste põhjustatud ajutine metaboloomi spetsiifilisuse suurenemine on seotud transkriptoomi spetsiifilisuse sünergilise suurenemisega. Omadus, mis aitab kõige rohkem kaasa sellele suuremale metaboloomi spetsialiseerumisele (millel on kõrgem Si väärtus), on eelnevalt iseloomustatud taimtoidulise funktsiooniga eriline metaboliit. See mudel on kooskõlas OD-teooria ennustusega, kuid metaboloomi ümberprogrammeerimise juhuslikkusega seotud MT ennustus ei ole kooskõlas. Siiski on need andmed kooskõlas ka segamudeli ennustusega (parim MT; joonis 1B), sest teised iseloomustamata metaboliidid, millel on teadmata kaitsefunktsioonid, võivad siiski järgida juhuslikku Si jaotust.
Märkimisväärne muster, mida see uuring veelgi enam tabas, on see, et mikroevolutsiooni tasandilt (üksikute taimede ja tubakapopulatsioon) kuni suurema evolutsioonilise skaalani (lähedaselt suguluses olevad tubakaliigid) on evolutsioonilise organiseerituse erinevad tasemed „parimas kaitses“. Taimtoiduliste võimetes on olulisi erinevusi. Moore jt (20) ning Kessler ja Kalske (1) pakkusid iseseisvalt välja, et Whittakeri (50) poolt algselt eristatavad kolm bioloogilise mitmekesisuse funktsionaalset taset teisendatakse keemilise mitmekesisuse konstitutiivseteks ja indutseeritud ajalisteks muutusteks; need autorid ei ole kokku võtnud ka seda, kuidas nende andmete põhjal metaboolset mitmekesisust arvutada. Suuremahulise metaboloomiandmete kogumise protseduurid ei kirjelda ka seda, kuidas nende andmete põhjal metaboolset mitmekesisust arvutada. Selles uuringus käsitletakse Whittakeri funktsionaalse klassifikatsiooni väiksemate kohandustega α-metaboolset mitmekesisust antud taime MS/MS spektrite mitmekesisusena ja β-metaboolset mitmekesisust populatsioonide rühma põhilise liigisisese metabolismina ning γ-metaboolne mitmekesisus on sarnaste liikide analüüsi laiendus.
JA-signaal on oluline laiaulatuslike taimtoiduliste metaboolsete reaktsioonide jaoks. Siiski puuduvad ranged kvantitatiivsed testid JA biosünteesi liigisisese regulatsiooni panuse kohta metaboloomide mitmekesisusse ning on endiselt ebaselge, kas JA-signaal on stressist tingitud metaboolse mitmekesistumise üldine koht kõrgemal makroevolutsioonilisel skaalal. Täheldasime, et Nepenthes taimtoidulise liigi taimtoiduline olemus kutsub esile metaboloomide spetsialiseerumise ning metaboloomide spetsialiseerumise varieeruvus Nicotiana liikide populatsioonis ja lähedaste Nicotiana liikide vahel on süstemaatiliselt positiivses korrelatsioonis JA signaaliülekandega. Lisaks, kui JA-signaal on häiritud, siis ühe genotüübiga taimtoidulise liigi poolt indutseeritud metaboolne spetsiifilisus tühistatakse (joonis 3, C ja E). Kuna looduslikult nõrgestatud Nepenthes populatsioonide metaboolse spektri muutused on enamasti kvantitatiivsed, võivad metaboolse β-mitmekesisuse ja spetsiifilisuse muutused selles analüüsis olla suuresti põhjustatud metaboliitide poolest rikaste ühendite kategooriate tugevast ergastumisest. Need ühendite klassid domineerivad metaboloomide profiili osas ja viivad positiivse korrelatsioonini JA-signaalidega.
Kuna lähedalt suguluses olevate tubakaliikide biokeemilised mehhanismid on väga erinevad, identifitseeritakse metaboliidid spetsiifiliselt kvalitatiivses aspektis, mistõttu on see analüütilisem. Infoteooria töötleb jäädvustatud metaboolset profiili ja näitab, et taimtoiduliste indutseerimine süvendab kompromissi metaboolse gamma mitmekesisuse ja spetsialiseerumise vahel. JA-signaalil on selles kompromissis keskne roll. Metaboloomi spetsialiseerumise suurenemine on kooskõlas peamise OD-ennustusega ja on positiivses korrelatsioonis JA-signaaliga, samas kui JA-signaal on negatiivses korrelatsioonis metaboolse gamma mitmekesisusega. Need mudelid näitavad, et taimede OD-võime määrab peamiselt JA plastilisus, olgu see siis mikroevolutsioonilisel skaalal või laiemal evolutsioonilisel skaalal. Eksogeensed JA-rakenduskatsed, mis möödahiilivad JA biosünteesi defekte, näitavad lisaks, et lähedalt suguluses olevaid tubakaliike saab eristada signaalile reageerivateks ja signaalile mitte reageerivateks liikideks, nagu ka nende JA-režiimi ja taimtoiduliste poolt indutseeritud metaboloomide plastilisust. Signaalile mitte reageerivad liigid ei saa reageerida, kuna nad ei suuda toota endogeenset JA-d ja on seetõttu füsioloogiliste piirangute all. Selle põhjuseks võivad olla mutatsioonid mõnedes JA signaaliülekande raja võtmegeenides (AOS ja JAR4 N. crescensis). See tulemus rõhutab, et need liikidevahelised makroevolutsioonilised mustrid võivad olla peamiselt tingitud muutustest sisemiste hormoonide tajumises ja reageerimisvõimes.
Lisaks taimede ja taimtoiduliste vastastikmõjule on metaboolse mitmekesisuse uurimine seotud kõigi oluliste teoreetiliste edusammudega bioloogilise keskkonnaga kohanemise ja keerukate fenotüüpiliste tunnuste evolutsiooni uurimisel. Tänapäevaste MS-instrumentide abil kogutud andmete hulga suurenemisega saab metaboolse mitmekesisuse hüpoteeside testimine nüüd ületada individuaalsete/kategooriate metaboliitide erinevusi ja teha globaalset analüüsi, et paljastada ootamatuid mustreid. Suuremahulise analüüsi protsessis on oluliseks metafooriks idee luua sisukaid kaarte, mida saab kasutada andmete uurimiseks. Seetõttu on praeguse erapooletu MS/MS-metaboloomika ja infoteooria kombinatsiooni oluline tulemus see, et see pakub lihtsat mõõdikut, mida saab kasutada kaartide koostamiseks, et sirvida metaboolset mitmekesisust erinevatel taksonoomilistel skaaladel. See on selle meetodi põhinõue. Mikro/makro evolutsiooni ja koosluste ökoloogia uurimine.
Makroevolutsioonilisel tasandil on Ehrlichi ja Raveni (51) taime-putuka koevolutsiooniteooria tuum ennustada, et liikidevahelise ainevahetusliku mitmekesisuse varieeruvus on taimeliinide mitmekesistumise põhjus. Kuid selle murrangulise töö avaldamisest möödunud viiekümne aasta jooksul on seda hüpoteesi harva testitud (52). See on suuresti tingitud võrreldavate ainevahetuslike omaduste fülogeneetilistest omadustest pikamaa taimeliinide lõikes. Seda haruldust saab kasutada sihtanalüüsi meetodite ankurdamiseks. Praegune infoteooria abil töödeldud MS/MS töövoog kvantifitseerib tundmatute metaboliitide MS/MS struktuurilist sarnasust (ilma eelneva metaboliitide valikuta) ja teisendab need MS/MS-id MS/MS-ide komplektiks, seega professionaalses ainevahetuses. Neid makroevolutsioonilisi mudeleid võrreldakse klassifitseerimisskaalal. Lihtsad statistilised näitajad. Protsess sarnaneb fülogeneetilise analüüsiga, mis saab järjestuse joondamist kasutada mitmekesistumise kiiruse või iseloomu evolutsiooni kvantifitseerimiseks ilma eelneva ennustamiseta.
Biokeemilisel tasandil näitab Firni ja Jonesi (53) sõelumishüpotees, et metaboolset mitmekesisust säilitatakse erinevatel tasemetel, et pakkuda toorainet eelnevalt mitteseotud või asendatud metaboliitide bioloogilise aktiivsuse avaldamiseks. Infoteooria meetodid pakuvad raamistiku, mille abil saab neid metaboliidispetsiifilisi evolutsioonilisi üleminekuid, mis toimuvad metaboliitide spetsialiseerumise ajal, kvantifitseerida osana kavandatud evolutsioonilisest sõelumisprotsessist: bioloogiliselt aktiivne kohandumine madalast spetsiifilisusest kõrge spetsiifilisuseni antud keskkonna inhibeeritud metaboliidid.
Kokkuvõttes töötati molekulaarbioloogia algusaegadel välja olulisi taimekaitseteooriaid ning deduktiivseid hüpoteesil põhinevaid meetodeid peetakse laialdaselt ainsaks teadusliku progressi vahendiks. See on suuresti tingitud kogu metaboloomi mõõtmise tehnilistest piirangutest. Kuigi hüpoteesil põhinevad meetodid on eriti kasulikud teiste põhjuslike mehhanismide valimisel, on nende võime edendada meie arusaamist biokeemilistest võrgustikest piiratum kui tänapäeva andmemahukas teaduses praegu saadaolevatel arvutusmeetoditel. Seetõttu jäävad ennustamatud teooriad olemasolevate andmete ulatusest kaugele välja, seega ei saa teadusvaldkonna edusammude hüpoteetilist valemi/testi tsüklit kaotada (4). Me näeme ette, et siin tutvustatud metaboloomika arvutuslik töövoog võib taas äratada huvi metaboolse mitmekesisuse hiljutiste (kuidas) ja lõplike (miks) küsimuste vastu ning aidata kaasa teoreetiliselt juhitud andmeteaduse uuele ajastule. See ajastu uuris uuesti olulisi teooriaid, mis inspireerisid eelmisi põlvkondi.
Taimtoiduliste otsene toitmine toimub teise staadiumi vastse ehk Sl-vastse kasvatamise teel ühe õitseva roositaime ühel heledal kanntaime lehel, iga taime kohta 10 taimekordust. Putukavastsed kinnitati klambritega ning ülejäänud lehekude koguti 24 ja 72 tundi pärast nakatamist, kiirkülmutati ja metaboliidid ekstraheeriti.
Simuleerige taimtoiduliste töötlemist väga sünkroniseeritud viisil. Meetod seisneb selles, et kangamustriga rataste abil torgatakse kangapärja kasvufaasis taime kolme täielikult laienenud lehe keskmise roo mõlemal küljel kolm rida okkaid ja kantakse kohe peale 1:5 lahjendatud Ms. Või kasutage kinnastega sõrmi, et sisestada torkehaavasse S1 OS. Koristage ja töödelge leht nagu eespool kirjeldatud. Kasutage eelnevalt kirjeldatud meetodit primaarsete metaboliitide ja taimehormoonide ekstraheerimiseks (54).
Eksogeense JA-rakenduste puhul töödeldakse iga liigi kuue õitseva roositaime kolme leherootsu lehte 20 μl lanoliinipastaga, mis sisaldab 150 μg MeJA-d (Lan + MeJA), ja 20 μl lanoliini koos haavaravimiga (Lan + W) või kasutatakse kontrollina 20 μl puhast lanoliini. Lehed koristati 72 tundi pärast töötlemist, külmutati kiirkülmutatud vedelas lämmastikus ja säilitati temperatuuril -80 °C kuni kasutamiseni.
Meie uurimisrühmas on identifitseeritud neli JA ja ET transgeenset liini, nimelt irAOC (36), irCOI1 (55), irACO ja sETR1 (48). irAOC näitas JA ja JA-Ile taseme tugevat langust, samas kui irCOI1 ei olnud JA-de suhtes tundlik. Võrreldes EV-ga suurenes JA-Ile akumuleerumine. Samamoodi vähendab irACO ET tootmist ja võrreldes EV-ga suurendab ET-de suhtes tundetu sETR1 ET tootmist.
ET-mõõtmine mitte-invasiivselt teostatakse fotoakustilise laserspektromeetriga (Sensor Sense ETD-300 reaalajas ET-andur). Kohe pärast töötlemist lõigati pooled lehtedest ära ja viidi 4 ml suletud klaasviaali ning õhupinnal lasti 5 tunni jooksul akumuleeruda. Mõõtmise ajal loputati iga viaali 8 minuti jooksul 2 liitri/tunnis puhta õhu vooluga, mis oli eelnevalt läbinud Sensor Sense'i pakutava katalüsaatori CO2 ja vee eemaldamiseks.
Mikrokiibi andmed avaldati algselt artiklis (35) ja salvestati Riikliku Biotehnoloogia Informatsiooni Keskuse (NCBI) geeniekspressiooni põhjalikku andmebaasi (liitumisnumber GSE30287). Selle uuringu jaoks ekstraheeriti andmed W + OSM-idega töödeldud lehtede ja kahjustamata kontrollrühma poolt tekitatud kahjustuste kohta. Töötlemata intensiivsus on log2. Enne statistilist analüüsi teisendati ja normaliseeriti baasjoon R tarkvarapaketi abil 75. protsentiilini.
Nicotiana liikide algsed RNA sekveneerimise (RNA-seq) andmed saadi NCBI lühilugemise arhiivist (SRA), projekti number on PRJNA301787, mille avaldasid Zhou jt (39) ja mida jätkatakse vastavalt kirjeldusele (56). Käesolevas uuringus analüüsimiseks valiti välja Nicotiana liikidele vastavad W + W, W + OSM ja W + OSS1 poolt töödeldud toorandmed ning neid töödeldi järgmiselt: esiteks teisendati toor-RNA sekveneerimise näidud FASTQ-vormingusse. HISAT2 teisendab FASTQ SAM-iks ja SAMtools teisendab SAM-failid sorteeritud BAM-failideks. Geeniekspressiooni arvutamiseks kasutatakse StringTie'd ja selle ekspressioonimeetod on see, et fragmente on tuhande alusfragmendi ja miljoni sekveneeritud transkriptsioonifragmendi kohta.
Analüüsis kasutatud Acclaim kromatograafiline kolonn (150 mm x 2,1 mm; osakeste suurus 2,2 μm) ja 4 mm x 4 mm kaitsekolonn on valmistatud samast materjalist. Dionex UltiMate 3000 ülikõrge jõudlusega vedelikkromatograafia (UHPLC) süsteemis kasutatakse järgmist binaarset gradienti: 0 kuni 0,5 minutit, isokraatiline 90% A [deioniseeritud vesi, 0,1% (v/v) atsetonitriil ja 0,05% sipelghape], 10% B (atsetonitriil ja 0,05% sipelghape); 0,5 kuni 23,5 minutit, gradiendifaas on vastavalt 10% A ja 90% B; 23,5 kuni 25 minutit, isokraatiline 10% A ja 90% B. Voolukiirus on 400 μl/min. Kõikide MS-analüüside puhul süstige kolonni eluent kvadrupool- ja lennuaja (qTOF) analüsaatorisse, mis on varustatud positiivse ionisatsiooni režiimis töötava elektropihustusallikaga (kapillaarpinge 4500 V; kapillaari väljund 130 V; kuivatustemperatuur 200 °C; kuivatava õhuvoolu kiirus 10 liitrit/min).
Üldise tuvastatava ainevahetusprofiili struktuuriinformatsiooni saamiseks tehke andmetest ebaoluline või eristamatu MS/MS fragmentide analüüs (edaspidi MS/MS). Valimatu MS/MS meetodi kontseptsioon tugineb asjaolule, et kvadrupoolil on väga suur massiisolatsiooni aken [seetõttu käsitlege kõiki massi ja laengu suhte (m/z) signaale fragmentidena]. Sel põhjusel, kuna Impact II instrument ei suutnud tekitada CE kallet, viidi läbi mitu sõltumatut analüüsi, kasutades suurenenud kokkupõrkest tingitud dissotsiatsiooni kokkupõrkeenergia (CE) väärtusi. Lühidalt, analüüsige esmalt proovi UHPLC-elektropihustus-ionisatsiooni/qTOF-MS abil, kasutades ühe massispektromeetria režiimi (madala fragmentatsiooni tingimused, mis tekivad allika sisemise fragmentatsiooni abil), skaneerides m/z vahemikus 50 kuni 1500 kordussagedusega 5 Hz. Kasutage MS/MS analüüsi jaoks kokkupõrkegaasina lämmastikku ja tehke sõltumatud mõõtmised järgmistel neljal erineval kokkupõrkest tingitud dissotsiatsioonipingel: 20, 30, 40 ja 50 eV. Kogu mõõtmisprotsessi vältel on kvadrupoolil suurim massiisolatsiooni aken, m/z 50-st kuni 1500-ni. Kui esikeha m/z ja isolatsiooni laiuse katse on seatud väärtusele 200, aktiveerib instrumendi tarkvara massivahemiku automaatselt ja see on 0 Da. Massifragmentide skaneerimine toimub nagu üksikmassi režiimis. Massi kalibreerimiseks kasutage naatriumformiaati (50 ml isopropanooli, 200 μl sipelghapet ja 1 ml 1M NaOH vesilahust). Brukeri ülitäpse kalibreerimisalgoritmi abil kalibreeritakse andmefail pärast keskmise spektri käivitamist antud ajaperioodil. Toorandmefailide teisendamiseks NetCDF-vormingusse kasutage Data Analysis v4.0 tarkvara (Brook Dalton, Bremen, Saksamaa) ekspordifunktsiooni. MS/MS andmestik on salvestatud avatud metaboloomika andmebaasi MetaboLights (www.ebi.ac.uk) juurdepääsunumbriga MTBLS1471.
MS/MS kokkupanekut saab teostada MS1 ja MS/MS kvaliteedisignaalide vahelise korrelatsioonianalüüsi abil madala ja kõrge kokkupõrkeenergia ning äsja rakendatud reeglite abil. R-skripti kasutatakse prekursori jaotumise korrelatsioonianalüüsi teostamiseks tootes ja C#-skripti (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) kasutatakse reeglite rakendamiseks.
Ainult vähestes proovides teatud m/z tunnuste tuvastamisest tingitud valepositiivsete vigade ja valekorrelatsiooni vähendamiseks kasutame R-paketi XCMS-i funktsiooni „täidetud tipp“ (taustamüra korrigeerimiseks). Seda tuleks kasutada „NA“ (tuvastamata tipp) intensiivsuse asendamiseks. Täidetud tippfunktsiooni kasutamisel on andmekogumis endiselt palju „0“ intensiivsuse väärtusi, mis mõjutavad korrelatsiooni arvutamist. Seejärel võrdleme täidetud tippfunktsiooni kasutamisel ja ilma selleta saadud andmetöötlustulemusi ning arvutame taustmüra väärtuse korrigeeritud keskmise hinnangulise väärtuse põhjal ja asendame need 0 intensiivsuse väärtused arvutatud taustväärtusega. Arvesse võtsime ka ainult neid tunnuseid, mille intensiivsus ületas taustväärtust kolm korda, ja pidasime neid „tõelisteks tippudeks“. PCC arvutuste puhul võetakse arvesse ainult proovi eelkäija (MS1) ja vähemalt kaheksa tõelise piigiga fragmentide andmekogumite m/z signaale.
Kui prekursori kvaliteeditunnuse intensiivsus kogu proovis on oluliselt korrelatsioonis sama kvaliteeditunnuse vähenenud intensiivsusega, mis on allutatud madalale või kõrgele kokkupõrkeenergiale, ja tunnust ei ole CAMERA abil isotooppiigiks märgistatud, saab seda täpsemalt defineerida. Seejärel, arvutades välja kõik võimalikud prekursori-saaduse paarid 3 sekundi jooksul (piigi retentsiooni hinnanguline retentsiooniaja aken), teostatakse korrelatsioonianalüüs. Fragmendiks loetakse seda ainult siis, kui m/z väärtus on madalam kui prekursori väärtus ja MS/MS fragmentatsioon toimub andmestikus samas proovi asukohas kui prekursor, millest see tuletati.
Nende kahe lihtsa reegli põhjal välistame kindlaksmääratud fragmendid, mille m/z väärtused on suuremad kui tuvastatud eelkäija m/z väärtused, lähtudes proovi positsioonist, kus eelkäija esineb, ja täpsustatud fragmendist. Samuti on võimalik valida MS1 režiimis genereeritud paljude allikasiseste fragmentide loodud kvaliteeditunnused kandidaat-eelkäijateks, genereerides seeläbi redundantseid MS/MS ühendeid. Selle andmete redundantsuse vähendamiseks ühendame need, kui spektrite NDP sarnasus ületab 0,6 ja need kuuluvad CAMERA poolt annoteeritud kromatogrammi „pcgroup“. Lõpuks ühendame kõik neli eelkäija ja fragmentidega seotud CE tulemust lõplikuks dekonvolueeritud liitspektriks, valides kõigi sama m/z väärtusega kandidaatpiikide hulgast erinevatel kokkupõrkeenergiatel kõrgeima intensiivsusega piigi. Järgnevad töötlemisetapid põhinevad liitspektri kontseptsioonil ja võtavad arvesse erinevaid CE tingimusi, mis on vajalikud fragmentatsiooni tõenäosuse maksimeerimiseks, kuna mõnda fragmenti saab tuvastada ainult kindla kokkupõrkeenergia korral.
Ainevahetusprofiili indutseeritavuse arvutamiseks kasutati RDPI-d (30). Ainevahetusspektri mitmekesisus (Hj indeks) tuletatakse MS/MS eelkäijate arvukusest, kasutades MS/MS sagedusjaotuse Shannoni entroopiat, kasutades järgmist Martínez jt (8) kirjeldatud võrrandit. Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij), kus Pij vastab i-nda MS/MS suhtelisele sagedusele j-ndas valimis (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
Metaboolne spetsiifilisus (Si indeks) on defineeritud kui antud MS/MS ekspressiooni identsus seoses uuritavate proovide sagedusega. MS/MS spetsiifilisus arvutatakse järgmiselt: Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi).
Kasutage järgmist valemit iga j proovi metaboloomispetsiifilise δj indeksi ja MS/MS spetsiifilisuse keskmise δj = ∑i = 1mPijSi mõõtmiseks.
MS/MS spektrid joondatakse paaridena ja sarnasus arvutatakse kahe skoori põhjal. Esmalt, kasutades standardset NDP-d (tuntud ka kui koosinuskorrelatsiooni meetod), kasutage spektrite segmentide sarnasuse hindamiseks järgmist võrrandit: NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2, kus S1 ja S2 Vastavalt spektri 1 ja spektri 2 ning WS1, i ja WS2 puhul tähistab i piigi intensiivsusel põhinevat kaalu, mille puhul kahe spektri i-nda ühise piigi erinevus on väiksem kui 0,01 Da. Kaal arvutatakse järgmiselt: W = [tipu intensiivsus] m [kvaliteet] n, m = 0,5, n = 2, nagu soovitab MassBank.
Rakendati teine ​​hindamismeetod, mis hõlmas MS/MS vahel jagatud NL-i analüüsimist. Selleks kasutasime samaaegselt 52 NL-i loendit, mida MS fragmenteerimisprotsessi käigus sageli esineb, ja spetsiifilisemat NL-i (andmefail S1), mis on eelnevalt annoteeritud nõrgestatud Nepenthes liigi sekundaarsete metaboliitide MS/MS-spektri jaoks (9, 26). Looge iga MS/MS jaoks binaarne vektor 1 ja 0, mis vastavad vastavalt mõne NL-i praegusele ja puudumisele. Eukleidese kauguse sarnasuse põhjal arvutatakse NL-i sarnasuse skoor iga binaarsete NL-vektorite paari jaoks.
Topeltklasterdamise teostamiseks kasutasime R-paketti DiffCoEx, mis põhineb kaalutud geenide koekspressiooni analüüsi (WGCNA) laiendusel. MS/MS-spektrite NDP ja NL skoorimismaatrikseid kasutades arvutasime DiffCoExi abil võrdleva korrelatsioonimaatriksi. Binaarne klasterdamine teostatakse, määrates parameetri „cutreeDynamic“ väärtuseks method = „hybrid“, cutHeight = 0,9999, deepSplit = T ja minClusterSize = 10. DiffCoExi R-lähtekoodi laadisid alla Tesson jt (57) lisafailist 1; vajalik R WGCNA tarkvarapakett asub aadressil https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
MS/MS molekulaarse võrgu analüüsi tegemiseks arvutasime NDP ja NL sarnasustüüpide põhjal paarisspektraalse ühenduvuse ning visualiseerisime võrgu topoloogiat Cytoscape'i tarkvara abil, kasutades orgaanilist paigutust CyFilescape'i yFiles'i paigutusalgoritmi laiendusrakenduses.
Andmete statistiliseks analüüsiks kasutage R versiooni 3.0.1. Statistilist olulisust hinnati kahesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil, millele järgnes Tukey ausalt olulise erinevuse (HSD) post-hoc test. Taimtoiduliste ja kontrollgrupi erinevuse analüüsimiseks analüüsiti kahe sama dispersiooniga valimirühma kahepoolset jaotust Studendi t-testi abil.
Selle artikli lisamaterjalide saamiseks külastage palun veebilehte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1.
See on avatud juurdepääsuga artikkel, mis on levitatud Creative Commonsi litsentsi "Autorile viitamine + Mitteäriline eesmärk" tingimuste kohaselt, mis lubab kasutamist, levitamist ja reprodutseerimist mis tahes meediumis, kui lõppkasutus ei ole ärilise kasu saamiseks ja eelduseks on algse teose õigsus. Viide.
Märkus: Palume teil oma e-posti aadressi esitada ainult selleks, et lehele soovitatud inimene teaks, et soovite talle e-kirja näidata ja et see pole rämpspost. Me ei salvesta ühtegi e-posti aadressi.
Selle küsimuse abil kontrollitakse, kas olete külastaja, ja takistatakse automaatset rämpsposti saatmist.
Infoteooria pakub universaalset valuutat spetsiaalsete metaboloomide võrdlemiseks ja testikaitseteooriate ennustamiseks.
Infoteooria pakub universaalset valuutat spetsiaalsete metaboloomide võrdlemiseks ja testikaitseteooriate ennustamiseks.
©2021 American Association for the Advanced of Science of Science. kõik õigused kaitstud. AAAS on HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ja COUNTER partner. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.