Täname teid nature.com külastamise eest. Teie kasutataval brauseriversioonil on piiratud CSS-i tugi. Parima kogemuse saamiseks soovitame teil kasutada brauseri uusimat versiooni (või lülitada Internet Exploreris ühilduvusrežiim välja). Lisaks ei sisalda see sait jätkuva toe tagamiseks stiile ega JavaScripti.
Tolmutormid kujutavad endast tõsist ohtu paljudele riikidele üle maailma, kuna need avaldavad hävitavat mõju põllumajandusele, inimeste tervisele, transpordivõrkudele ja infrastruktuurile. Seetõttu peetakse tuuleerosiooni globaalseks probleemiks. Üks keskkonnasõbralikke lähenemisviise tuuleerosiooni ohjeldamiseks on mikroobide poolt indutseeritud karbonaadi sadestamine (MICP). Karbamiidi lagundamisel põhineva MICP kõrvalsaadused, näiteks ammoniaak, ei ole aga suurtes kogustes toodetuna ideaalsed. Käesolevas uuringus esitatakse kaks kaltsiumformiaadi bakterite preparaati MICP lagundamiseks ilma karbamiidi tootmata ja võrreldakse põhjalikult nende toimivust kahe ammoniaaki mittetootva kaltsiumatsetaatbakterite preparaadiga. Vaadeldavad bakterid on Bacillus subtilis ja Bacillus amyloliquefaciens. Esmalt määrati CaCO3 moodustumist kontrollivate tegurite optimeeritud väärtused. Seejärel viidi läbi tuuletunneli katsed optimeeritud preparaatidega töödeldud liivaluidete proovidega ning mõõdeti tuuleerosiooni vastupidavust, eraldumislävi kiirust ja liivapommitamise vastupidavust. Kaltsiumkarbonaadi (CaCO3) allomorfe hinnati optilise mikroskoopia, skaneeriva elektronmikroskoopia (SEM) ja röntgendifraktsioonianalüüsi abil. Kaltsiumformiaadil põhinevad preparaadid toimisid kaltsiumkarbonaadi moodustumise osas oluliselt paremini kui atsetaadil põhinevad preparaadid. Lisaks tootis B. subtilis rohkem kaltsiumkarbonaati kui B. amyloliquefaciens. SEM-mikrofotod näitasid selgelt aktiivsete ja inaktiivsete bakterite seondumist ja kleepumist kaltsiumkarbonaadile settimise teel. Kõik preparaadid vähendasid oluliselt tuuleerosiooni.
Tuuleerosiooni on juba ammu peetud peamiseks probleemiks, mis seisab silmitsi selliste kuivade ja poolkuivade piirkondadega nagu USA edelaosa, Lääne-Hiina, Sahara-väline Aafrika ja suur osa Lähis-Idast1. Vähene sademete hulk kuivas ja ülikuivas kliimas on muutnud suured osad nendest piirkondadest kõrbeteks, liivaluideteks ja harimata maadeks. Jätkuv tuuleerosioon kujutab endast keskkonnaohtu infrastruktuurile, nagu transpordivõrgud, põllumajandusmaa ja tööstusmaa, mis toob kaasa halvad elutingimused ja linnaarenduse kõrged kulud nendes piirkondades2,3,4. Oluline on see, et tuuleerosioon ei mõjuta mitte ainult asukohta, kus see toimub, vaid põhjustab ka tervise- ja majandusprobleeme kaugemates kogukondades, kuna see transpordib osakesi tuulega allikast kaugel asuvatesse piirkondadesse5,6.
Tuuleerosiooni tõrje on endiselt ülemaailmne probleem. Tuuleerosiooni tõrjeks kasutatakse mitmesuguseid pinnase stabiliseerimise meetodeid. Nende meetodite hulka kuuluvad sellised materjalid nagu vee pealekandmine7, õlimultšid8, biopolümeerid5, mikroobide indutseeritud karbonaadi sadestamine (MICP)9,10,11,12 ja ensüümide indutseeritud karbonaadi sadestamine (EICP)1. Pinnase niisutamine on standardne tolmu summutamise meetod põllul. Selle kiire aurustumine muudab selle meetodi aga kuivades ja poolkuivades piirkondades piiratud efektiivsusega1. Õlimultšimisegude kasutamine suurendab liiva sidusust ja osakestevahelist hõõrdumist. Nende sidus omadus seob liivaterad kokku; õlimultšid tekitavad aga ka muid probleeme; nende tume värvus suurendab soojuse neeldumist ja viib taimede ja mikroorganismide surmani. Nende lõhn ja aurud võivad põhjustada hingamisprobleeme ning mis kõige märkimisväärsem, nende kõrge hind on veel üks takistus. Biopolümeerid on üks hiljuti pakutud keskkonnasõbralikke meetodeid tuuleerosiooni leevendamiseks; neid ekstraheeritakse looduslikest allikatest, nagu taimed, loomad ja bakterid. Ksantaankummi, guarkummi, kitosaan ja gellankummi on insenerirakendustes kõige sagedamini kasutatavad biopolümeerid5. Vees lahustuvad biopolümeerid võivad aga veega kokkupuutel kaotada tugevust ja pinnasest välja leostuda13,14. EICP on osutunud tõhusaks tolmu summutamise meetodiks mitmesugustes rakendustes, sealhulgas sillutamata teedel, jäätmebasseinides ja ehitusplatsidel. Kuigi selle tulemused on julgustavad, tuleb arvestada mõnede võimalike puudustega, nagu maksumus ja tuumastumiskohtade puudumine (mis kiirendab CaCO3 kristallide moodustumist ja sadestumist15,16).
MICP-d kirjeldasid esmakordselt 19. sajandi lõpus Murray ja Irwin (1890) ning Steinmann (1901) oma uuringus, mis käsitles uurea lagunemist meremikroorganismide poolt17. MICP on looduslikult esinev bioloogiline protsess, mis hõlmab mitmesuguseid mikroobseid tegevusi ja keemilisi protsesse, mille käigus sadestub kaltsiumkarbonaat mikroobsete metaboliitide karbonaatioonide reaktsioonil keskkonnas leiduvate kaltsiumiioonidega18,19. Uureat lagundava lämmastikutsükliga seotud MICP (uureat lagundav MICP) on kõige levinum mikroobide poolt indutseeritud karbonaadi sadestumise tüüp, mille puhul bakterite toodetud ureaas katalüüsib uurea hüdrolüüsi20,21,22,23,24,25,26,27 järgmiselt:
MICP-s, mis hõlmab orgaanilise soola oksüdeerimise süsinikuringet (MICP ilma uurea lagundamata tüüp), kasutavad heterotroofsed bakterid karbonaatmineraalide tootmiseks energiaallikatena orgaanilisi sooli nagu atsetaat, laktaat, tsitraat, suktsinaat, oksalaat, malaat ja glüoksülaat28. Kaltsiumlaktaadi kui süsinikuallika ja kaltsiumiioonide juuresolekul on kaltsiumkarbonaadi moodustumise keemiline reaktsioon näidatud võrrandis (5).
MICP protsessis pakuvad bakterirakud tuumastumiskohti, mis on eriti olulised kaltsiumkarbonaadi sadestamiseks; bakteriraku pind on negatiivselt laetud ja võib toimida adsorbendina kahevalentsete katioonide, näiteks kaltsiumiioonide jaoks. Kaltsiumiioonide adsorbeerimisel bakterirakkudele ja piisava karbonaatioonide kontsentratsiooni korral reageerivad kaltsiumkatioonid ja karbonaatanioonid ning kaltsiumkarbonaat sadestub bakteri pinnale29,30. Protsessi saab kokku võtta järgmiselt31,32:
Biogenereerunud kaltsiumkarbonaadi kristalle võib jagada kolme tüüpi: kaltsiit, vateriit ja aragoniit. Nende hulgas on kaltsiit ja vateriit kõige levinumad bakteriaalselt indutseeritud kaltsiumkarbonaadi allomorfid33,34. Kaltsiit on termodünaamiliselt kõige stabiilsem kaltsiumkarbonaadi allomorf35. Kuigi vateriiti on kirjeldatud metastabiilsena, muutub see lõpuks kaltsiidiks36,37. Vateriit on neist kristallidest kõige tihedam. See on kuusnurkne kristall, millel on oma suurema suuruse tõttu parem pooride täitmise võime kui teistel kaltsiumkarbonaadi kristallidel38. Nii uurea poolt lagundatud kui ka uurea poolt lagundamata MICP võib viia vateriidi sadestumiseni13,39,40,41.
Kuigi MICP on näidanud paljulubavat potentsiaali probleemsete muldade ja tuuleerosioonile vastuvõtlike muldade stabiliseerimisel42,43,44,45,46,47,48, on üks karbamiidi hüdrolüüsi kõrvalsaadustest ammoniaak, mis võib olenevalt kokkupuute tasemest põhjustada kergeid kuni raskeid terviseprobleeme49. See kõrvalmõju muudab selle konkreetse tehnoloogia kasutamise vastuoluliseks, eriti kui on vaja töödelda suuri alasid, näiteks tolmu summutamiseks. Lisaks on ammoniaagi lõhn talumatu, kui protsessi viiakse läbi suure koguse ja suurte kogustega, mis võib mõjutada selle praktilist rakendatavust. Kuigi hiljutised uuringud on näidanud, et ammooniumiioone saab vähendada, muutes need teisteks toodeteks, näiteks struviidiks, ei eemalda need meetodid ammooniumiioone täielikult50. Seetõttu on endiselt vaja uurida alternatiivseid lahendusi, mis ei tekita ammooniumiioone. MICP puhul mitte-uurea lagunemisradade kasutamine võib pakkuda potentsiaalset lahendust, mida tuuleerosiooni leevendamise kontekstis on vähe uuritud. Fattahi jt uurisid karbamiidivaba MICP lagunemist kaltsiumatsetaadi ja Bacillus megateriumi abil41, samas kui Mohebbi jt... kasutati kaltsiumatsetaati ja Bacillus amyloliquefaciens9. Siiski ei võrreldud nende uuringut teiste kaltsiumiallikate ja heterotroofsete bakteritega, mis võiksid lõppkokkuvõttes parandada tuuleerosiooni vastupidavust. Samuti puudub kirjandus, mis võrdleks karbamiidivabu lagunemisradasid karbamiidi lagunemisradadega tuuleerosiooni leevendamisel.
Lisaks on enamik tuuleerosiooni ja tolmu tõrje uuringuid läbi viidud tasase pinnaga pinnaseproovidel.1,51,52,53 Siiski on tasased pinnad looduses vähem levinud kui künkad ja lohud. Seetõttu on liivaluited kõrbepiirkondades kõige levinum maastikuelement.
Eelnevalt mainitud puuduste ületamiseks oli käesoleva uuringu eesmärk tutvustada uut komplekti ammoniaaki mittetootvaid bakteriaalseid aineid. Sel eesmärgil vaatlesime MICP-d mittelagundavaid radasid, mis lagundavad uureat. Uuriti kahe kaltsiumiallika (kaltsiumformiaat ja kaltsiumatsetaat) efektiivsust. Autorite teada ei ole varasemates uuringutes uuritud karbonaadi sadestamist kahe kaltsiumiallika ja bakterite kombinatsiooni (st kaltsiumformiaat-Bacillus subtilis ja kaltsiumformiaat-Bacillus amyloliquefaciens) abil. Nende bakterite valik põhines ensüümidel, mida nad toodavad ja mis katalüüsivad kaltsiumformiaadi ja kaltsiumatsetaadi oksüdeerimist mikroobse karbonaadi sadestamise moodustamiseks. Kavandasime põhjaliku eksperimentaalse uuringu, et leida optimaalsed tegurid, nagu pH, bakterite tüübid ja kaltsiumiallikad ning nende kontsentratsioonid, bakterite ja kaltsiumiallika lahuse suhe ning kõvenemisaeg. Lõpuks uuriti selle bakteriaalsete ainete komplekti efektiivsust tuuleerosiooni pärssimisel kaltsiumkarbonaadi sadestamise kaudu, viies läbi liivaluidetel rea tuuletunneli katseid, et määrata liiva tuuleerosiooni ulatust, purunemiskiiruse läve ja tuulepommituse vastupidavust, ning tehti ka penetromeetri mõõtmisi ja mikrostruktuurilisi uuringuid (nt röntgendifraktsiooni (XRD) analüüs ja skaneeriva elektronmikroskoopia (SEM)).
Kaltsiumkarbonaadi tootmiseks on vaja kaltsiumiioone ja karbonaatioone. Kaltsiumiioone saab erinevatest kaltsiumiallikatest, näiteks kaltsiumkloriidist, kaltsiumhüdroksiidist ja lõssipulbrist54,55. Karbonaate saab toota erinevate mikroobsete meetoditega, näiteks karbamiidi hüdrolüüsi ja orgaanilise aine aeroobse või anaeroobse oksüdeerimise teel56. Selles uuringus saadi karbonaatioone formiaadi ja atsetaadi oksüdatsioonireaktsioonist. Lisaks kasutasime puhta kaltsiumkarbonaadi saamiseks formiaadi ja atsetaadi kaltsiumisooli, seega saadi kõrvalsaadustena ainult CO2 ja H2O. Selles protsessis toimib ainult üks aine kaltsiumiallikana ja karbonaadiallikana ning ammoniaaki ei teki. Need omadused muudavad kaltsiumiallika ja karbonaadi tootmismeetodi väga paljulubavaks.
Kaltsiumformiaadi ja kaltsiumatsetaadi vastavad reaktsioonid kaltsiumkarbonaadi moodustamiseks on näidatud valemites (7)-(14). Valemid (7)-(11) näitavad, et kaltsiumformiaat lahustub vees, moodustades sipelghapet või formiaati. Seega on lahus vabade kaltsiumi- ja hüdroksiidioonide allikas (valemid 8 ja 9). Sipelghappe oksüdeerimise tulemusel muundatakse sipelghappe süsinikuaatomid süsinikdioksiidiks (valem 10). Lõpuks moodustub kaltsiumkarbonaat (valemid 11 ja 12).
Samamoodi moodustub kaltsiumkarbonaat kaltsiumatsetaadist (võrrandid 13–15), välja arvatud see, et sipelghappe asemel moodustub äädikhape või atsetaat.
Ilma ensüümide juuresolekuta ei saa atsetaati ja formiaati toatemperatuuril oksüdeerida. FDH (formiaadi dehüdrogenaas) ja CoA (koensüüm A) katalüüsivad vastavalt formiaadi ja atsetaadi oksüdeerimist süsinikdioksiidi moodustamiseks (võrrandid 16, 17) 57, 58, 59. Erinevad bakterid on võimelised neid ensüüme tootma ning selles uuringus kasutati heterotroofseid baktereid, nimelt Bacillus subtilis (PTCC #1204 (Pärsia tüüpkultuuride kollektsioon), tuntud ka kui NCIMB #13061 (rahvusvaheline bakterite, pärmi, faagi, plasmiidide, taimeseemnete ja taimerakkude koekultuuride kollektsioon)) ja Bacillus amyloliquefaciens (PTCC #1732, NCIMB #12077). Neid baktereid kultiveeriti söötmes, mis sisaldas lihapeptooni (5 g/l) ja lihaekstrakti (3 g/l) ning mida nimetatakse toitainepuljongiks (NBR) (105443 Merck).
Seega valmistati kaltsiumkarbonaadi sadestumise esilekutsumiseks neli preparaati, kasutades kahte kaltsiumiallikat ja kahte bakterit: kaltsiumformiaati ja Bacillus subtilis't (FS), kaltsiumformiaati ja Bacillus amyloliquefaciens'it (FA), kaltsiumatsetaati ja Bacillus subtilis't (AS) ning kaltsiumatsetaati ja Bacillus amyloliquefaciens'it (AA).
Katseplaani esimeses osas viidi läbi katsed, et määrata kindlaks optimaalne kombinatsioon, mis saavutaks maksimaalse kaltsiumkarbonaadi tootmise. Kuna mullaproovid sisaldasid kaltsiumkarbonaati, kavandati eelhindamiskatsete komplekt, et täpselt mõõta erinevate kombinatsioonide toodetud CaCO3 kogust, ning hinnati kultuurikeskkonna ja kaltsiumiallika lahuste segusid. Iga eespool määratletud kaltsiumiallika ja bakterilahuse kombinatsiooni (FS, FA, AS ja AA) jaoks tuletati optimeerimistegurid (kaltsiumiallika kontsentratsioon, kõvenemisaeg, bakterilahuse kontsentratsioon, mõõdetuna lahuse optilise tiheduse (OD) abil, kaltsiumiallika ja bakterilahuse suhe ning pH) ja neid kasutati järgmistes osades kirjeldatud liivaluidete töötlemise tuuletunneli katsetes.
Iga kombinatsiooni puhul viidi läbi 150 katset, et uurida CaCO3 sadestamise mõju ja hinnata erinevaid tegureid, nimelt kaltsiumiallika kontsentratsiooni, kõvenemisaega, bakterite OD väärtust, kaltsiumiallika ja bakterilahuse suhet ning pH-d orgaanilise aine aeroobse oksüdeerimise ajal (tabel 1). Optimeeritud protsessi pH-vahemik valiti Bacillus subtilis'e ja Bacillus amyloliquefaciens'e kasvukõverate põhjal, et saavutada kiirem kasv. Seda on üksikasjalikumalt selgitatud tulemuste osas.
Optimeerimisfaasi proovide ettevalmistamiseks kasutati järgmisi samme. MICP lahus valmistati esmalt söötme esialgse pH reguleerimise teel ja seejärel autoklaaviti seda temperatuuril 121 °C 15 minutit. Seejärel inokuleeriti tüvi laminaarses õhuvoolus ja hoiti loksutavas inkubaatoris temperatuuril 30 °C ja kiirusel 180 p/min. Kui bakterite OD saavutas soovitud taseme, segati see kaltsiumiallika lahusega soovitud vahekorras (joonis 1a). MICP lahusel lasti reageerida ja tahkuda loksutavas inkubaatoris kiirusel 220 p/min ja temperatuuril 30 °C aja jooksul, mis saavutas sihtväärtuse. Sadestunud CaCO3 eraldati pärast tsentrifuugimist kiirusel 6000 g 5 minuti jooksul ja seejärel kuivatati temperatuuril 40 °C, et valmistada proove kaltsimeetritestiks (joonis 1b). Seejärel mõõdeti CaCO3 sadestumist Bernardi kaltsimeetriga, kus CaCO3 pulber reageerib 1,0 N HCl-ga (ASTM-D4373-02), tekitades CO2, ja selle gaasi maht on CaCO3 sisalduse mõõt (joonis 1c). CO2 mahu teisendamiseks CaCO3 sisalduseks genereeriti kalibreerimiskõver, pestes puhast CaCO3 pulbrit 1 N HCl-ga ja joonistades selle graafiku eraldunud CO2 suhtes. Sadestunud CaCO3 pulbri morfoloogiat ja puhtust uuriti SEM-kuvamise ja XRD-analüüsi abil. Bakterite ümber kaltsiumkarbonaadi moodustumise, moodustunud kaltsiumkarbonaadi faasi ja bakterite aktiivsuse uurimiseks kasutati 1000-kordse suurendusega optilist mikroskoopi.
Dejeghi bassein on tuntud tugevalt erodeerunud piirkond Iraani edelaosas Farsi provintsis ning teadlased kogusid piirkonnast tuule poolt erodeeritud mullaproove. Uuringu jaoks võeti proovid mullapinnalt. Mullaproovide indikaatortestid näitasid, et muld oli halvasti sorteeritud liivane ja mudane muld ning klassifitseeriti ühtse mullaklassifikatsioonisüsteemi (USC) kohaselt SP-SM-iks (joonis 2a). XRD-analüüs näitas, et Dejeghi muld koosnes peamiselt kaltsiidist ja kvartsist (joonis 2b). Lisaks näitas EDX-analüüs, et väiksemates kogustes esines ka teisi elemente, nagu Al, K ja Fe.
Labori luidete ettevalmistamiseks tuuleerosiooni testimiseks purustati pinnas 170 mm kõrguselt läbi 10 mm läbimõõduga lehtri kindlale pinnale, mille tulemuseks oli tüüpiline 60 mm kõrgune ja 210 mm läbimõõduga luide. Looduses moodustuvad madalaima tihedusega liivaluited eoolsete protsesside tagajärjel. Samamoodi oli ülaltoodud protseduuri abil valmistatud proovil madalaim suhteline tihedus, γ = 14,14 kN/m³, moodustades horisontaalsele pinnale ladestunud liivakoonuse, mille puhkenurk on ligikaudu 29,7°.
Eelmises osas saadud optimaalne MICP lahus pihustati luidete nõlvale pealekandmiskogustega 1, 2 ja 3 lm-2 ning seejärel hoiti proove inkubaatoris temperatuuril 30 °C (joonis 3) 9 päeva (st optimaalne kõvenemisaeg) ja viidi seejärel tuuletunneli testimiseks.
Iga töötluse jaoks valmistati neli proovi, üks kaltsiumkarbonaadi sisalduse ja pinna tugevuse mõõtmiseks penetromeetri abil ning ülejäänud kolme proovi kasutati erosioonikatseteks kolmel erineval kiirusel. Tuuletunneli katsetes määrati erosiooni hulk erinevatel tuulekiirustel ja seejärel määrati iga töödeldud proovi lävikiirus, kasutades erosiooni hulga ja tuulekiiruse graafikut. Lisaks tuuleerosiooni katsetele allutati töödeldud proovid liivapommitamisele (st hüppekatsed). Selleks valmistati kaks täiendavat proovi pealekandmiskogustega 2 ja 3 L m−2. Liivapommitamise katse kestis 15 minutit vooluga 120 gm−1, mis jääb varasemates uuringutes valitud väärtuste vahemikku60,61,62. Abrasiivse otsiku ja luidete aluse vaheline horisontaalne kaugus oli 800 mm, mis asus 100 mm tunneli põhjast kõrgemal. See asend määrati nii, et peaaegu kõik hüppavad liivaosakesed langesid luidetele.
Tuuletunneli katse viidi läbi avatud tuuletunnelis pikkusega 8 m, laiusega 0,4 m ja kõrgusega 1 m (joonis 4a). Tuuletunnel on valmistatud tsingitud terasplekist ja suudab tekitada tuule kiirust kuni 25 m/s. Lisaks kasutatakse sagedusmuundurit ventilaatori sageduse reguleerimiseks ja sageduse järkjärguliseks suurendamiseks, et saavutada sihttuule kiirus. Joonis 4b näitab tuule poolt erodeeritud liivaluidete skemaatilist diagrammi ja tuuletunnelis mõõdetud tuulekiiruse profiili.
Lõpuks, et võrrelda käesolevas uuringus pakutud mitte-urelüütilise MICP formulatsiooni tulemusi urelüütilise MICP kontrolltesti tulemustega, valmistati ette ka luideproovid ja töödeldi neid bioloogilise lahusega, mis sisaldas uureat, kaltsiumkloriidi ja Sporosarcina pasteurii'd (kuna Sporosarcina pasteurii'l on märkimisväärne võime toota ureaasi63). Bakterilahuse optiline tihedus oli 1,5 ning uurea ja kaltsiumkloriidi kontsentratsioonid olid 1 M (valitud varasemates uuringutes soovitatud väärtuste36,64,65 põhjal). Kultuurikeskkond koosnes toitepuljongist (8 g/l) ja uureast (20 g/l). Bakterilahust pihustati luidepinnale ja jäeti 24 tunniks bakterite kinnitumiseks seisma. Pärast 24-tunnist kinnitumist pihustati tsementeerivat lahust (kaltsiumkloriid ja uurea). Urealüütilist MICP kontrolltesti nimetatakse edaspidi UMC-ks. Urealüütiliselt ja mitte-urelüütiliselt töödeldud mullaproovide kaltsiumkarbonaadi sisaldus saadi pesemise teel Choi jt poolt pakutud protseduuri kohaselt.66
Joonis 5 näitab Bacillus amyloliquefaciens'i ja Bacillus subtilis'e kasvukõveraid kultuurikeskkonnas (toitelahuses) algse pH vahemikuga 5–10. Nagu joonisel näidatud, kasvasid Bacillus amyloliquefaciens ja Bacillus subtilis kiiremini vastavalt pH väärtustel 6–8 ja 7–9. Seetõttu kasutati optimeerimisetapis seda pH vahemikku.
(a) Bacillus amyloliquefaciens'i ja (b) Bacillus subtilis'e kasvukõverad toitainekeskkonna erinevate algsete pH väärtuste juures.
Joonis 6 näitab Bernardi lubimeetris toodetud süsinikdioksiidi hulka, mis esindab sadestunud kaltsiumkarbonaati (CaCO3). Kuna igas kombinatsioonis oli üks tegur fikseeritud ja teisi tegureid varieeriti, vastab iga punkt nendel graafikutel süsinikdioksiidi maksimaalsele mahule selles katsete komplektis. Nagu joonisel näidatud, suurenes kaltsiumiallika kontsentratsiooni suurenedes kaltsiumkarbonaadi tootmine. Seega mõjutab kaltsiumiallika kontsentratsioon otseselt kaltsiumkarbonaadi tootmist. Kuna kaltsiumiallikas ja süsinikuallikas on samad (st kaltsiumformiaat ja kaltsiumatsetaat), siis mida rohkem kaltsiumiioone vabaneb, seda rohkem kaltsiumkarbonaati moodustub (joonis 6a). AS- ja AA-preparaatides jätkas kaltsiumkarbonaadi tootmise suurenemine kõvenemisaja pikenemisega, kuni sademe hulk oli 9 päeva pärast peaaegu muutumatu. FA-preparaadis vähenes kaltsiumkarbonaadi moodustumise kiirus, kui kõvenemisaeg ületas 6 päeva. Võrreldes teiste preparaatidega näitas FS-preparaat 3 päeva pärast suhteliselt madalat kaltsiumkarbonaadi moodustumise kiirust (joonis 6b). Formulatsioonides FA ja FS saadi kolme päeva pärast 70% ja 87% kaltsiumkarbonaadi kogutoodangust, samas kui formulatsioonides AA ja AS oli see osakaal vastavalt vaid umbes 46% ja 45%. See näitab, et sipelghappel põhineval formulatsioonil on algstaadiumis suurem CaCO3 moodustumise kiirus võrreldes atsetaatpõhise formulatsiooniga. Moodumiskiirus aeglustub aga kõvenemisaja pikenedes. Jooniselt 6c võib järeldada, et isegi bakterite kontsentratsioonidel üle OD1 ei ole kaltsiumkarbonaadi moodustumisele olulist panust.
Bernardi kaltsimeetriga mõõdetud CO2 mahu (ja vastava CaCO3 sisalduse) muutus sõltuvalt (a) kaltsiumiallika kontsentratsioonist, (b) hangumisajast, (c) OD-st, (d) algsest pH-st, (e) kaltsiumiallika ja bakterilahuse suhtest (iga formulatsiooni puhul); ja (f) iga kaltsiumiallika ja bakterite kombinatsiooni puhul toodetud kaltsiumkarbonaadi maksimaalsest kogusest.
Seoses söötme algse pH mõjuga näitab joonis 6d, et FA ja FS puhul saavutas CaCO3 tootmine maksimaalse väärtuse pH 7 juures. See tähelepanek on kooskõlas varasemate uuringutega, mille kohaselt FDH ensüümid on kõige stabiilsemad pH vahemikus 7–6,7. AA ja AS puhul aga suurenes CaCO3 sadestumine, kui pH ületas 7. Varasemad uuringud näitasid ka, et CoA ensüümi aktiivsuse optimaalne pH vahemik on 8 kuni 9,2–6,8. Arvestades, et CoA ensüümi aktiivsuse ja B. amyloliquefaciens'i kasvu optimaalsed pH vahemikud on vastavalt (8–9,2) ja (6–8) (joonis 5a), peaks AA formulatsiooni optimaalne pH olema 8 ning need kaks pH vahemikku kattuvad. Seda fakti kinnitasid katsed, nagu on näidatud joonisel 6d. Kuna B. subtilis'e kasvu optimaalne pH on 7–9 (joonis 5b) ja CoA ensüümi aktiivsuse optimaalne pH on 8–9,2, eeldatakse, et maksimaalne CaCO3 sadestamise saagis on pH vahemikus 8–9, mida kinnitab joonis 6d (st optimaalne sadestamise pH on 9). Joonisel 6e näidatud tulemused näitavad, et kaltsiumiallika lahuse ja bakterilahuse optimaalne suhe on nii atsetaat- kui ka formiaatlahuste puhul 1. Võrdluseks hinnati erinevate preparaatide (st AA, AS, FA ja FS) toimivust maksimaalse CaCO3 tootmise põhjal erinevates tingimustes (st kaltsiumiallika kontsentratsioon, kõvenemisaeg, OD, kaltsiumiallika ja bakterilahuse suhe ning algne pH). Uuritud preparaatide seas oli FS-il kõrgeim CaCO3 tootmine, mis oli ligikaudu kolm korda suurem kui preparaatil AA (joonis 6f). Mõlema kaltsiumiallikaga viidi läbi neli bakterivaba kontrollkatset ja 30 päeva pärast CaCO3 sadestumist ei täheldatud.
Kõigi preparaatide optilise mikroskoopia pildid näitasid, et vateriit oli peamine faas, milles moodustus kaltsiumkarbonaat (joonis 7). Vateriidi kristallid olid sfäärilise kujuga69,70,71. Leiti, et kaltsiumkarbonaat sadestus bakterirakkudele, kuna bakterirakkude pind oli negatiivselt laetud ja võis toimida kahevalentsete katioonide adsorbendina. Kasutades selles uuringus näitena preparaati FS, hakkas 24 tunni pärast mõnedel bakterirakkudel moodustuma kaltsiumkarbonaat (joonis 7a) ja 48 tunni pärast suurenes kaltsiumkarbonaadiga kaetud bakterirakkude arv märkimisväärselt. Lisaks, nagu on näidatud joonisel 7b, oli võimalik tuvastada ka vateriidi osakesi. Lõpuks, 72 tunni pärast näis suur hulk baktereid olevat vateriidi kristallidega seotud ja vateriidi osakeste arv suurenes märkimisväärselt (joonis 7c).
CaCO3 sadestumise optilise mikroskoopia vaatlused FS-kompositsioonides aja jooksul: (a) 24, (b) 48 ja (c) 72 tundi.
Sadestunud faasi morfoloogia edasiseks uurimiseks viidi läbi pulbrite röntgendifraktsiooni (XRD) ja SEM-analüüsid. XRD-spektrid (joonis 8a) ja SEM-mikrofotod (joonis 8b, c) kinnitasid vateriidikristallide olemasolu, kuna neil oli salatikujuline kuju ja täheldati vastavust vateriidi piikide ja sademe piikide vahel.
(a) Moodustunud CaCO3 ja vateriidi röntgendifraktsioonispektrite võrdlus. Vateriidi SEM-mikrofotod vastavalt (b) 1 kHz ja (c) 5,27 kHz suurendusega.
Tuuletunneli katsete tulemused on näidatud joonisel 9a, b. Jooniselt 9a on näha, et töötlemata liiva erosiooni lävikiirus (TDV) on umbes 4,32 m/s. Kasutuskoguse 1 l/m² juures (joonis 9a) on fraktsioonide FA, FS, AA ja UMC mullakao kiiruse joonte kalded ligikaudu samad, mis töötlemata luidetel. See näitab, et töötlemine selle kasutuskogusega on ebaefektiivne ja niipea, kui tuule kiirus ületab TDV-d, kaob õhuke mullakoorik ning luidete erosiooni kiirus on sama, mis töötlemata luidetel. Fraktsiooni AS erosiooni kalle on samuti madalam kui teistel madalama abstsissidega (st TDV-ga) fraktsioonidel (joonis 9a). Joonisel 9b olevad nooled näitavad, et maksimaalse tuulekiiruse 25 m/s juures ei tekkinud töödeldud luidetel erosiooni kasutuskoguste 2 ja 3 l/m² juures. Teisisõnu, FS, FA, AS ja UMC puhul olid luited CaCO³ sadestumisest põhjustatud tuuleerosiooni suhtes vastupidavamad 2 ja 3 l/m² kasutuskoguste juures kui maksimaalse tuulekiiruse juures (st 25 m/s). Seega on nendes katsetes saadud TDV väärtus 25 m/s joonisel 9b näidatud kasutuskoguste alumine piir, välja arvatud AA puhul, kus TDV on peaaegu võrdne maksimaalse tuuletunneli kiirusega.
Tuuleerosiooni test (a) Kaalukaotus tuulekiiruse suhtes (kasutuskogus 1 l/m2), (b) Rebimiskiiruse läviväärtus vastavalt kasutuskogusele ja koostisele (CA kaltsiumatsetaadi puhul, CF kaltsiumformiaadi puhul).
Joonis 10 näitab erinevate koostiste ja kasutuskogustega töödeldud liivaluidete pinnaerosiooni pärast liivapommitustesti ning kvantitatiivsed tulemused on näidatud joonisel 11. Töötlemata juhtumit pole näidatud, kuna see ei näidanud vastupidavust ja erodeerus liivapommitustesti ajal täielikult (kogumassi kadu). Jooniselt 11 on selgelt näha, et biokompositsiooniga AA töödeldud proov kaotas 2 l/m2 kasutuskoguse juures 83,5% oma kaalust, samas kui kõik teised proovid näitasid liivapommitamise käigus alla 30% erosiooni. Kui kasutuskogust suurendati 3 l/m2-ni, kaotasid kõik töödeldud proovid vähem kui 25% oma kaalust. Mõlema kasutuskoguse juures näitas ühend FS parimat vastupidavust liivapommitamisele. FS-i ja AA-ga töödeldud proovide maksimaalset ja minimaalset pommitamiskindlust saab seostada nende maksimaalse ja minimaalse CaCO3 sadestumisega (joonis 6f).
Erineva koostisega liivaluidete pommitamise tulemused voolukiirusel 2 ja 3 l/m2 (nooled näitavad tuule suunda, ristid joonise tasapinnaga risti olevat tuule suunda).
Nagu joonisel 12 näidatud, suurenes kõigi valemite kaltsiumkarbonaadi sisaldus koos kasutuskoguse suurenemisega 1 l/m²-lt 3 l/m²-le. Lisaks oli kõigi kasutuskoguste juures kõrgeima kaltsiumkarbonaadi sisaldusega valemil FS, millele järgnesid FA ja UMC. See viitab sellele, et neil valemitel võib olla suurem pinnakindlus.
Joonis 13a näitab töötlemata, kontroll- ja töödeldud mullaproovide pinnatakistuse muutust, mõõdetuna permeameetrikatse abil. Jooniselt on näha, et UMC, AS, FA ja FS preparaatide pinnatakistus suurenes märkimisväärselt koos kasutuskoguse suurenemisega. AA preparaatide puhul oli pinnatugevuse suurenemine aga suhteliselt väike. Nagu joonisel näidatud, on karbamiidiga lagundamata MICP FA ja FS preparaatidel parem pinna läbilaskvus võrreldes karbamiidiga lagundatud MICP-ga. Joonis 13b näitab TDV muutust mulla pinnatakistuse suhtes. Jooniselt on selgelt näha, et luidete puhul, mille pinnatakistus on suurem kui 100 kPa, ületab eemaldumiskiiruse lävi 25 m/s. Kuna kohapealset pinnatakistust saab permemeetriga hõlpsalt mõõta, aitab see teadmine hinnata TDV-d ilma tuuletunneli katseteta, toimides seega kvaliteedikontrolli indikaatorina välitöödel.
SEM-i tulemused on näidatud joonisel 14. Joonistel 14a-b on näidatud töötlemata mullaproovi suurenenud osakesed, mis näitab selgelt, et see on sidus ja sellel puudub loomulik sidumine või tsementatsioon. Joonisel 14c on näidatud karbamiidiga lagundatud MICP-ga töödeldud kontrollproovi SEM-mikrofoto. See pilt näitab CaCO3 sademete olemasolu kaltsiidi polümorfidena. Nagu on näidatud joonistel 14d-o, seob sadestunud CaCO3 osakesed kokku; SEM-mikrofotodel on võimalik tuvastada ka sfäärilisi vateriidi kristalle. Selle ja varasemate uuringute tulemused näitavad, et vateriidi polümorfidena moodustunud CaCO3 sidemed võivad pakkuda ka mõistlikku mehaanilist tugevust; meie tulemused näitavad, et pinna takistus suureneb 350 kPa-ni ja lävikiirus suureneb 4,32-lt enam kui 25 m/s-ni. See tulemus on kooskõlas varasemate uuringute tulemustega, mille kohaselt MICP-ga sadestatud CaCO3 maatriks on vateriit, millel on mõistlik mehaaniline tugevus ja tuuleerosioonikindlus13,40 ning mis suudab säilitada mõistliku tuuleerosioonikindluse isegi pärast 180-päevast kokkupuudet välitingimustega13.
(a, b) töötlemata pinnase SEM-mikrofotod, (c) MICP uurea lagunemise kontroll, (df) AA-ga töödeldud proovid, (gi) AS-iga töödeldud proovid, (jl) FA-ga töödeldud proovid ja (mo) FS-iga töödeldud proovid erinevatel suurendustel pealekandmiskiirusega 3 L/m2.
Joonisel 14d-f on näidatud, et pärast AA-ühenditega töötlemist sadestus pinnale ja liivaterade vahele kaltsiumkarbonaat, samal ajal täheldati ka mõningaid katmata liivateri. AS-komponentide puhul, kuigi moodustunud CaCO3 hulk oluliselt ei suurenenud (joonis 6f), suurenes CaCO3 poolt põhjustatud liivateradevaheliste kontaktide arv oluliselt võrreldes AA-ühenditega (joonis 14g-i).
Joonistelt 14j-l ja 14m-o on selgelt näha, et kaltsiumformiaadi kasutamine kaltsiumiallikana suurendab CaCO3 sadenemist veelgi võrreldes AS-ühendiga, mis on kooskõlas kaltsiumimeetri mõõtmistega joonisel 6f. See täiendav CaCO3 näib ladestuvat peamiselt liivaosakestele ja ei paranda tingimata kontaktkvaliteeti. See kinnitab eelnevalt täheldatud käitumist: hoolimata CaCO3 sadestumise hulga erinevustest (joonis 6f) ei erine kolm koostist (AS, FA ja FS) oluliselt tuulekindla toimivuse (joonis 11) ja pinnatakistuse (joonis 13a) poolest.
CaCO3-ga kaetud bakterirakkude ja sadenenud kristallidel oleva bakteriaalse jälje paremaks visualiseerimiseks tehti suure suurendusega SEM-mikrofotod ja tulemused on näidatud joonisel 15. Nagu näidatud, sadestub kaltsiumkarbonaat bakterirakkudele ja annab seal sadestamiseks vajalikud tuumad. Joonisel on kujutatud ka CaCO3 poolt indutseeritud aktiivseid ja inaktiivseid sidemeid. Võib järeldada, et inaktiivsete sidemete suurenemine ei pruugi tingimata kaasa tuua mehaanilise käitumise edasist paranemist. Seetõttu ei too CaCO3 sadestumise suurendamine tingimata kaasa suuremat mehaanilist tugevust ja sadestumise mustril on oluline roll. Seda punkti on uuritud ka Terzise ja Laloui72 ning Soghi ja Al-Kabani45,73 töödes. Sadestumise mustri ja mehaanilise tugevuse vahelise seose edasiseks uurimiseks on soovitatav teha MICP uuringuid µCT-kuvamise abil, mis jääb käesoleva uuringu raamidest välja (st ammoniaagivaba MICP jaoks erinevate kaltsiumiallika ja bakterite kombinatsioonide sissetoomine).
CaCO3 indutseeris (a) AS-kompositsiooniga ja (b) FS-kompositsiooniga töödeldud proovides aktiivseid ja inaktiivseid sidemeid ning jättis settele bakterirakkude jäljendi.
Nagu joonistel 14j-o ja 15b näidatud, on olemas CaCO3-kile (EDX-analüüsi kohaselt on iga elemendi protsentuaalne koostis kiles süsinik 11%, hapnik 46,62% ja kaltsium 42,39%, mis on väga lähedane CaCO3 protsendile joonisel 16). See kile katab vateriidi kristalle ja mullaosakesi, aidates säilitada mulla-sette süsteemi terviklikkust. Selle kile olemasolu täheldati ainult formiaadipõhise formulatsiooniga töödeldud proovides.
Tabel 2 võrdleb varasemates uuringutes ja käesolevas uuringus karbamiidi lagundavate ja karbamiidi mittelagundavate MICP radadega töödeldud muldade pinna tugevust, läviväärtuslikku eraldumiskiirust ja bioindutseeritud CaCO3 sisaldust. MICP-ga töödeldud luideproovide tuuleerosioonikindluse uuringud on piiratud. Meng jt uurisid MICP-ga töödeldud karbamiidi lagundavate luideproovide tuuleerosioonikindlust lehepuhuri abil,13 samas kui käesolevas uuringus testiti karbamiidi mittelagundavaid luideproove (ja ka karbamiidi lagundavaid kontrollproove) tuuletunnelis ja töödeldi nelja erineva bakterite ja ainete kombinatsiooniga.
Nagu näha, on mõned varasemad uuringud käsitlenud suuri kasutuskoguseid, mis ületavad 4 l/m²13,41,74. Tasub märkida, et suured kasutuskogused ei pruugi olla majanduslikust seisukohast põllul kergesti rakendatavad veevarustuse, transpordi ja suurte veekoguste kasutamisega seotud kulude tõttu. Väiksemad kasutuskogused, näiteks 1,62–2 l/m², saavutasid samuti üsna hea pinnatugevuse kuni 190 kPa ja TDV üle 25 m/s. Käesolevas uuringus saavutasid formiaadipõhise MICP-ga ilma karbamiidi lagundamata töödeldud luited kõrge pinnatugevuse, mis oli võrreldav karbamiidi lagundamisrajaga samas kasutuskoguste vahemikus (st formiaadipõhise MICP-ga ilma karbamiidi lagundamata töödeldud proovid suutsid saavutada sama pinnatugevuse väärtuste vahemiku, nagu on teatanud Meng jt, 13, joonis 13a) suuremate kasutuskoguste korral. Samuti on näha, et 2 L/m2 kasutuskoguse juures oli tuuleerosiooni leevendamiseks vajaliku kaltsiumkarbonaadi saagis tuulekiirusel 25 m/s formiaadipõhise MICP puhul ilma karbamiidi lagunemiseta 2,25%, mis on väga lähedal vajalikule CaCO3 kogusele (st 2,41%) võrreldes sama kasutuskoguse ja sama tuulekiiruse (25 m/s) juures kontroll-MICP-ga töödeldud luidetega, millel oli karbamiidi lagunemine.
Seega võib sellest tabelist järeldada, et nii uurea lagunemise rada kui ka uureavaba lagunemise rada pakuvad pinnatakistuse ja TDV osas üsna vastuvõetavat tulemust. Peamine erinevus seisneb selles, et uureavaba lagunemise rada ei sisalda ammoniaaki ja seetõttu on sellel väiksem keskkonnamõju. Lisaks näib käesolevas uuringus pakutud formiaadipõhine MICP-meetod ilma uurea lagunemiseta toimivat paremini kui atsetaadipõhine MICP-meetod ilma uurea lagunemiseta. Kuigi Mohebbi jt. uurisid atsetaadipõhist MICP-meetodit ilma uurea lagunemiseta, hõlmas nende uuring tasastel pindadel asuvaid proove9. Tulenevalt luidete proovide ümber tekkivate keeriste ja sellest tuleneva nihke põhjustatud suuremast erosiooniastmest, mille tulemuseks on madalam TDV, eeldatakse, et luidete proovide tuuleerosioon on sama kiiruse juures ilmsem kui tasastel pindadel.