Artikkel on osa uurimisteemast „Kaunviljade patogeenide ja kahjurite resistentsuse parandamine“, vaata kõiki 5 artiklit
Seenhaiguse nekroosi Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary tekitaja kasutab erinevate peremeestaimede nakatamiseks mitmetasandilist strateegiat. Käesolev uuring pakub välja diamiin L-ornitiini, mittevalgulise aminohappe, mis stimuleerib teiste asendamatute aminohapete sünteesi, kasutamise alternatiivse tõrjestrateegiana, et parandada Phaseolus vulgaris L. molekulaarseid, füsioloogilisi ja biokeemilisi reaktsioone Pseudomonas sclerotiorum'i põhjustatud valgehallitusele. In vitro katsed näitasid, et L-ornitiin pärssis oluliselt S. pyrenoidosa seeneniidistiku kasvu annusest sõltuval viisil. Lisaks võis see oluliselt vähendada valgehallituse raskusastet kasvuhoonetingimustes. Lisaks stimuleeris L-ornitiin töödeldud taimede kasvu, mis näitab, et testitud L-ornitiini kontsentratsioonid ei olnud töödeldud taimedele fütotoksilised. Lisaks suurendas L-ornitiin mitteensümaatiliste antioksüdantide (lahustuvate fenoolide ja flavonoidide koguhulk) ja ensümaatiliste antioksüdantide (katalaasi (CAT), peroksidaasi (POX) ja polüfenooloksüdaasi (PPO)) ekspressiooni ning suurendas kolme antioksüdandiga seotud geeni (PvCAT1, PvSOD ja PvGR) ekspressiooni. Lisaks näitas in silico analüüs oletatava oksaloatsetaatatsetüülhüdrolaasi (SsOAH) valgu olemasolu S. sclerotiorum genoomis, mis oli funktsionaalse analüüsi, konserveerunud domeenide ja topoloogia poolest väga sarnane Aspergillus fijiensis'e (AfOAH) ja Penicillium sp. (PlOAH) oksaloatsetaatatsetüülhüdrolaasi (SsOAH) valkudega. Huvitaval kombel vähendas L-ornitiini lisamine kartuli-dekstroosipuljongi (PDB) söötmele oluliselt SsOAH geeni ekspressiooni S. sclerotiorum mütseelis. Samamoodi vähendas L-ornitiini eksogeenne manustamine oluliselt SsOAH geeni ekspressiooni töödeldud taimedelt kogutud seeneniidistiku seeneniidistikus. Lõpuks vähendas L-ornitiini manustamine oluliselt oblikhappe sekretsiooni nii PDB söötmes kui ka nakatunud lehtedes. Kokkuvõtteks võib öelda, et L-ornitiinil on võtmeroll redoksseisundi säilitamisel ja nakatunud taimede kaitsereaktsiooni tugevdamisel. Selle uuringu tulemused võivad aidata välja töötada uuenduslikke ja keskkonnasõbralikke meetodeid valgehallituse tõrjeks ja selle mõju leevendamiseks ubade ja teiste põllukultuuride tootmisele.
Valge hallitus, mida põhjustab nekrotroofne seen Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, on laastav ja saagikust vähendav haigus, mis kujutab endast tõsist ohtu aedoa (Phaseolus vulgaris L.) tootmisele kogu maailmas (Bolton jt, 2006). Sclerotinia sclerotiorum on üks raskemini tõrjutavaid mullas levivaid seenhaigusi, millel on lai peremeesorganismide valik, mis hõlmab üle 600 taimeliigi, ja võime peremeesorganismi kudesid mittespetsiifilisel viisil kiiresti leotada (Liang ja Rollins, 2018). Ebasoodsates tingimustes läbib see oma elutsükli kriitilise faasi, jäädes pikaks ajaks uinunud seisundisse mustade, kõvade, seemnetaoliste struktuuridena, mida nimetatakse mullas sklerootsiumideks, või valgete, kohevate moodustistena nakatunud taimede seeneniidistikus või varre südamikus (Schwartz jt, 2005). S. sclerotiorum on võimeline moodustama sklerootsiume, mis võimaldab tal nakatunud põldudel pikka aega ellu jääda ja haiguse ajal püsida (Schwartz jt, 2005). Sklerootsiumid on toitaineterikkad, võivad mullas pikka aega püsida ja olla peamiseks inokulumiks järgnevate nakkuste korral (Schwartz jt, 2005). Soodsates tingimustes idanevad sklerootsiumid ja toodavad õhus levivaid eoseid, mis võivad nakatada kõiki taime maapealseid osi, sealhulgas, kuid mitte ainult, õisi, varsi või kaunu (Schwartz jt, 2005).
Sclerotinia sclerotiorum kasutab peremeestaimede nakatamiseks mitmetasandilist strateegiat, mis hõlmab mitmeid koordineeritud sündmusi alates sklerootia idanemisest kuni sümptomite tekkeni. Algselt toodab S. sclerotiorum seenelaadsetest struktuuridest, mida nimetatakse apoteesiateks, hõljuvaid eoseid (nimetatakse askospoorideks), mis levivad õhus ja arenevad nakatunud taimejäätmetel liikumatuteks sklerootsiumideks (Bolton jt, 2006). Seejärel eritab seen oblikhapet, mis on virulentsusfaktor, et kontrollida taimerakkude seina pH-d, soodustada ensümaatilist lagunemist ja kudede invasiooni (Hegedus ja Rimmer, 2005) ning pärssida peremeestaime oksüdatiivset purset. See hapestumisprotsess nõrgestab taimerakkude seina, pakkudes soodsat keskkonda seenrakkude seina lagundavate ensüümide (CWDE-de) normaalseks ja tõhusaks toimimiseks, võimaldades patogeenil ületada füüsilise barjääri ja tungida peremeeskudedesse (Marciano jt, 1983). Kui S. sclerotiorum on tunginud, eritab see mitmeid CWDE-sid, näiteks polügalakturonaasi ja tsellulaasi, mis hõlbustavad selle levikut nakatunud kudedes ja põhjustavad koenekroosi. Kahjustuste ja hüüfmattide progresseerumine viib valgehallituse iseloomulike sümptomiteni (Hegedus ja Rimmer, 2005). Samal ajal tunnevad peremeestaimed mustrituvastuse retseptorite (PRR) kaudu ära patogeenidega seotud molekulaarsed mustrid (PAMP), käivitades rea signaaliülekandeid, mis lõpuks aktiveerivad kaitsereaktsioone.
Vaatamata aastakümneid kestnud haiguste tõrje jõupingutustele on ubadel, nagu ka teistel kommertskultuuridel, endiselt puudus piisavast resistentsest iduplasmast, mis on tingitud patogeeni resistentsusest, ellujäämisest ja kohanemisvõimest. Seetõttu on haiguste tõrje äärmiselt keeruline ja nõuab integreeritud ja mitmetahulist strateegiat, mis hõlmab nii kultuuripraktikaid, bioloogilist tõrjet kui ka keemilisi fungitsiide (O'Sullivan jt, 2021). Valge hallituse keemiline tõrje on kõige tõhusam, sest õigesti ja õigel ajal rakendatud fungitsiidid suudavad tõhusalt kontrollida haiguse levikut, vähendada nakkuse raskust ja minimeerida saagikadusid. Fungitsiidide ülekasutamine ja liigne sõltuvus võib aga viia S. sclerotiorum'i resistentsete tüvede tekkeni ning avaldada negatiivset mõju mitte-sihtorganismidele, mulla tervisele ja vee kvaliteedile (Le Cointe jt, 2016; Ceresini jt, 2024). Seetõttu on keskkonnasõbralike alternatiivide leidmine muutunud esmatähtsaks.
Polüamiinid (PA-d), näiteks putrestsiin, spermidiin, spermiin ja kadaveriin, võivad olla paljulubavad alternatiivid mullas levivate taimepatogeenide vastu, vähendades seeläbi täielikult või osaliselt ohtlike keemiliste fungitsiidide kasutamist (Nehela jt, 2024; Yi jt, 2024). Kõrgemates taimedes osalevad PA-d paljudes füsioloogilistes protsessides, sealhulgas, kuid mitte ainult, rakkude jagunemises, diferentseerumises ja abiootilistele ja biootilistele stressiteguritele reageerimises (Killiny ja Nehela, 2020). Nad võivad toimida antioksüdantidena, aidata püüda reaktiivseid hapnikuühendeid (ROS), säilitada redokstasakaalu (Nehela ja Killiny, 2023), indutseerida kaitsega seotud geene (Romero jt, 2018), reguleerida mitmesuguseid ainevahetusradasid (Nehela ja Killiny, 2023), moduleerida endogeenseid fütohormoone (Nehela ja Killiny, 2019), tekitada süsteemset omandatud resistentsust (SAR) ja reguleerida taime ja patogeeni vastastikmõjusid (Nehela ja Killiny, 2020; Asija jt, 2022; Czerwoniec, 2022). Tasub märkida, et polüpeptiidide spetsiifilised mehhanismid ja rollid taimekaitses varieeruvad sõltuvalt taimeliigist, patogeenidest ja keskkonnatingimustest. Kõige levinum polüpeptiid taimedes biosünteesitakse essentsiaalsest polüamiinist L-ornitiinist (Killiny ja Nehela, 2020).
L-ornitiinil on taimede kasvus ja arengus mitu rolli. Näiteks on varasemad uuringud näidanud, et riisis (Oryza sativa) võib ornitiin olla seotud lämmastiku ringlussevõtuga (Liu jt, 2018), riisi saagikuse, kvaliteedi ja aroomiga (Lu jt, 2020) ning veestressiga (Yang jt, 2000). Lisaks suurendas L-ornitiini eksogeenne manustamine oluliselt suhkrupeedi (Beta vulgaris) põuataluvust (Hussein jt, 2019) ja leevendas soolastressi sibula (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu ja Çavuşoǧlu, 2021) ja india pähkli (Anacardium occidentale) taimedel (da Rocha jt, 2012). L-ornitiini potentsiaalne roll abiootilise stressi kaitses võib tuleneda selle osalemisest proliini akumuleerumises töödeldud taimedes. Näiteks on varem teatatud, et proliini metabolismiga seotud geenid, nagu ornitiini delta aminotransferaasi (delta-OAT) ja proliini dehüdrogenaasi (ProDH1 ja ProDH2) geenid, on seotud Nicotiana benthamiana ja Arabidopsis thaliana kaitsmisega mitte-peremeesorganismi Pseudomonas syringae tüvede eest (Senthil-Kumar ja Mysore, 2012). Teisest küljest on patogeenide kasvuks vajalik seente ornitiini dekarboksülaas (ODC) (Singh jt, 2020). Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ODC sihtimine peremeesorganismi indutseeritud geeni vaigistamise (HIGS) abil suurendas oluliselt tomatitaimede resistentsust Fusarium närbumise suhtes (Singh jt, 2020). Eksogeense ornitiini kasutamise potentsiaalset rolli biootiliste stressitegurite, näiteks fütopatogeenide vastu ei ole aga hästi uuritud. Veelgi olulisem on see, et ornitiini mõju haiguskindlusele ja sellega seotud biokeemilistele ja füsioloogilistele nähtustele on suures osas uurimata.
Kaunviljade S. sclerotiorum'i nakkuse keerukuse mõistmine on oluline tõhusate tõrjestrateegiate väljatöötamiseks. Käesolevas uuringus püüdsime tuvastada diamiin L-ornitiini potentsiaalset rolli kaunviljade kaitsemehhanismide ja resistentsuse tugevdamisel Sclerotinia sclerotiorum'i nakkuse suhtes. Meie hüpotees on, et lisaks nakatunud taimede kaitsereaktsioonide tugevdamisele mängib L-ornitiin olulist rolli ka redoksseisundi säilitamisel. Pakume välja, et L-ornitiini potentsiaalsed mõjud on seotud ensümaatiliste ja mitteensümaatiliste antioksüdantsete kaitsemehhanismide reguleerimisega ning seente patogeensuse/virulentsusfaktorite ja nendega seotud valkude häirimisega. See L-ornitiini kahetine funktsionaalsus muudab selle paljulubavaks kandidaadiks jätkusuutliku strateegia jaoks, et leevendada valgehallituse mõju ja suurendada tavaliste kaunviljade resistentsust selle tugeva seenpatogeeni suhtes. Käesoleva uuringu tulemused võivad aidata välja töötada uuenduslikke ja keskkonnasõbralikke meetodeid valgehallituse tõrjeks ja selle mõju leevendamiseks kaunviljade tootmisele.
Selles uuringus kasutati katsematerjalina vastuvõtlikku hariliku oa kaubanduslikku sorti Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3). Terved seemned saadi lahkelt Egiptuse Põllumajandusuuringute Keskuse (ARC) Põllukultuuride Uurimise Instituudi (FCRI) kaunviljade uurimise osakonnast. Viis seemet külvati kasvuhoonetingimustes (25 ± 2 °C, suhteline õhuniiskus 75 ± 1%, 8 tundi valgust/16 tundi pimedust) S. sclerotiorum'iga nakatatud mullaga täidetud plastpottidesse (siseläbimõõt 35 cm, sügavus 50 cm). 7–10 päeva pärast külvi (DPS) harvendati seemikuid, et igas potis oleks ainult kaks ühtlase kasvuga ja kolme täielikult laienenud lehega seemikut. Kõiki potitaimi kasteti iga kahe nädala tagant ja väetati igakuiselt antud sordi jaoks soovitatava annusega.
500 mg/l kontsentratsiooniga L-ornitiindiamiini (tuntud ka kui (+)-(S)-2,5-diaminopentaanhape; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Saksamaa) valmistamiseks lahustati 50 mg esmalt 100 ml steriilses destilleeritud vees. Seejärel lahjendati põhilahust ja kasutati järgnevates katsetes. Lühidalt, in vitro testiti kuut L-ornitiini kontsentratsioonide seeriat (12,5, 25, 50, 75, 100 ja 125 mg/l). Lisaks kasutati negatiivse kontrollina (Mock) steriilset destilleeritud vett ja positiivse kontrollina kaubanduslikku fungitsiidi „Rizolex-T” 50% märguvat pulbrit (toklofossmetüül 20% + tiraam 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia kubermang, Egiptus). Kaubanduslikku fungitsiidi „Rizolex-T” testiti in vitro viies kontsentratsioonis (2, 4, 6, 8 ja 10 mg/l).
Valgehallituse tüüpiliste sümptomitega hariliku oa varte ja kaunade proovid (nakatumusmäär: 10–30%) koguti kaubanduslikest taludest. Kuigi enamik nakatunud taimsetest materjalidest identifitseeriti liigi/sordi järgi (vastuvõtlik kaubanduslik sort Giza 3), olid teised, eriti kohalikelt turgudelt saadud, tundmatu liigi esindajad. Kogutud nakatunud materjalid desinfitseeriti esmalt pinnapealselt 0,5% naatriumhüpokloriti lahusega 3 minutit, seejärel loputati mitu korda steriilse destilleeritud veega ja kuivatati steriilse filterpaberiga liigse vee eemaldamiseks. Seejärel lõigati nakatunud organid keskmisest koest (tervete ja nakatunud kudede vahelt) väikesteks tükkideks, kultiveeriti kartuli-dekstroosagaril (PDA) ja inkubeeriti temperatuuril 25 ± 2 °C 12-tunnise valguse/12-tunnise pimeduse tsükliga 5 päeva, et stimuleerida sklerootsiumide moodustumist. Seeneniidistiku puhastamiseks sega- või saastunud kultuuridest kasutati ka mütseeli otsa meetodit. Puhastatud seeneisolaat identifitseeriti esmalt selle kultuuriliste morfoloogiliste tunnuste põhjal ja seejärel kinnitati mikroskoopiliste tunnuste põhjal, et tegemist on S. sclerotiorum'iga. Lõpuks testiti kõiki puhastatud isolaate patogeensuse suhtes vastuvõtlikul hariliku oa sordil Giza 3, et see vastaks Kochi postulaatidele.
Lisaks kinnitati kõige invasiivsema S. sclerotiorum isolaadi (isolaat nr 3) olemasolu sisemise transkribeeritud vahetüki (ITS) sekveneerimise abil, nagu on kirjeldanud White jt, 1990; Baturo-Ciesniewska jt, 2017. Lühidalt, isolaate kultiveeriti kartuli-dekstroosipuljongis (PDB) ja inkubeeriti temperatuuril 25 ± 2 °C 5–7 päeva. Seejärel koguti seeneniidistik, filtriti läbi marli, pesti kaks korda steriilse veega ja kuivatati steriilse filterpaberiga. Genoomne DNA eraldati Quick-DNA™ seente/bakterite miniprep komplekti abil (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah jt, 2022, 2024). Seejärel amplifitseeriti ITS-i rDNA piirkond spetsiifilise praimeripaari ITS1/ITS4 abil (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; eeldatav suurus: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska jt, 2017). Puhastatud PCR-produktid esitati sekveneerimiseks (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). ITS-i rDNA järjestused sekveneeriti kahesuunaliselt, kasutades Sangeri sekveneerimismeetodit. Kokkupandud päringujärjestusi võrreldi seejärel GenBanki ja Riikliku Biotehnoloogia Informatsioonikeskuse (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) uusimate andmetega, kasutades BLASTn tarkvara. Päringujärjestust võrreldi 20 teise S. sclerotiorum tüve/isolaadiga, mis saadi NCBI GenBanki uusimatest andmetest (lisatabel S1), kasutades ClustalW-i Molecular Evolutionary Genetics Analysis Package'is (MEGA-11; versioon 11) (Kumar jt, 2024). Evolutsiooniline analüüs viidi läbi maksimaalse tõepärasuse meetodi ja üldise ajas pöörduva nukleotiidide asendusmudeli (Nei ja Kumar, 2000) abil. Näidatud on kõrgeima log-tõenäosusega puu. Heuristilise otsingu algpuu valitakse, valides kõrgema log-tõenäosusega puu naaberliitumise (NJ) puu (Kumar jt, 2024) ja maksimaalse parsimoonia (MP) puu vahel. NJ puu konstrueeriti paarikaupa kauguse maatriksi abil, mis arvutati üldise ajas pöörduva mudeli (Nei ja Kumar, 2000) abil.
L-ornitiini ja bakteritsiidi „Rizolex-T“ antibakteriaalset aktiivsust määrati in vitro agar-difusioonmeetodil. Meetod: Võtke sobiv kogus L-ornitiini põhilahust (500 mg/l) ja segage see hoolikalt 10 ml PDA toitekeskkonnaga, et valmistada lahused lõppkontsentratsioonidega vastavalt 12,5, 25, 50, 75, 100 ja 125 mg/l. Kontrollina kasutati viit fungitsiidi „Rizolex-T“ kontsentratsiooni (2, 4, 6, 8 ja 10 mg/l) ja steriilset destilleeritud vett. Pärast keskkonna tahkumist kanti Petri tassi keskele värskelt valmistatud 4 mm läbimõõduga Sclerotinia sclerotiorum kultuuri seeneniidistiku kork ja kultiveeriti temperatuuril 25±2°C, kuni seeneniidistik kattis kogu kontroll-Petri tassi, mille järel registreeriti seene kasv. Arvutage S. sclerotiorum'i radiaalse kasvu inhibeerimise protsent, kasutades võrrandit 1:
Katset korrati kaks korda, iga kontroll-/katserühma kohta kuue bioloogilise kordusega ja iga bioloogilise korduse kohta viie potiga (kaks taime poti kohta). Iga bioloogilist kordust analüüsiti kaks korda (kaks tehnilist kordust), et tagada katsetulemuste täpsus, usaldusväärsus ja reprodutseeritavus. Lisaks kasutati probit-regressioonanalüüsi poolmaksimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni (IC50) ja IC99 arvutamiseks (Prentice, 1976).
L-ornitiini potentsiaali hindamiseks kasvuhoone tingimustes viidi läbi kaks järjestikust potikatset. Lühidalt, potid täideti steriliseeritud savi-liivmullaga (3:1) ja inokuleeriti värskelt valmistatud S. sclerotiorum kultuuriga. Esmalt kultiveeriti S. sclerotiorum'i kõige invasiivsemat isolaati (isolaat nr 3), lõigates ühe sklerootsiumi pooleks, asetades selle näoga allapoole PDA-le ja inkubeerides 25 °C juures pidevas pimeduses (24 tundi) 4 päeva, et stimuleerida mütseeli kasvu. Seejärel võeti esiservast neli 5 mm läbimõõduga agarkorki ja inokuleeriti 100 g steriilse nisu- ja riisikliide seguga (1:1, v/v) ning kõiki kolbe inkubeeriti 25 ± 2 °C juures 12-tunnise valguse ja 12-tunnise pimeduse tsükli all 5 päeva, et stimuleerida sklerootsiumide moodustumist. Kõigi kolbide sisu segati enne mulla lisamist hoolikalt, et tagada homogeensus. Seejärel lisati igasse potti 100 g koloniseerivat kliide segu, et tagada patogeenide püsiv kontsentratsioon. Inokuleeritud potte kasteti seente kasvu aktiveerimiseks ja paigutati 7 päevaks kasvuhoonetingimustesse.
Seejärel külvati igasse potti viis Giza 3 sordi seemet. L-ornitiini ja fungitsiidiga Rizolex-T töödeldud pottide puhul leotati steriliseeritud seemneid esmalt kaks tundi kahe ühendi vesilahuses, mille lõplik IC99 kontsentratsioon oli vastavalt umbes 250 mg/l ja 50 mg/l, ning seejärel kuivatati enne külvi üks tund õhu käes. Teisest küljest leotati seemneid negatiivse kontrollina steriilses destilleeritud vees. 10 päeva pärast, enne esimest kastmist, harvendati seemikuid, jättes igasse potti ainult kaks puhast seemikut. Lisaks lõigati S. sclerotiorum'iga nakatumise tagamiseks steriliseeritud skalpelliga kahest erinevast kohast samas arengujärgus (10 päeva) oataime varred ja igasse haava pandi umbes 0,5 g koloniseerivat kliide segu, millele järgnes kõrge õhuniiskus, et stimuleerida nakkust ja haiguse arengut kõigis inokuleeritud taimedes. Kontrolltaimed haavati sarnaselt ja haavale pandi võrdne kogus (0,5 g) steriilset, koloniseerimata kliide segu ning hoiti kõrge õhuniiskuse all, et simuleerida haiguse arenguks sobivat keskkonda ja tagada ravirühmade järjepidevus.
Töötlemismeetod: Oa seemikuid kasteti 500 ml L-ornitiini vesilahusega (250 mg/l) või fungitsiidiga Rizolex-T (50 mg/l), niisutades mulda, seejärel korrati töötlemist kolm korda 10-päevase intervalliga. Platseeboga töödeldud kontrolltaimi kasteti 500 ml steriilse destilleeritud veega. Kõik töötlemised viidi läbi kasvuhoone tingimustes (25 ± 2 °C, 75 ± 1% suhteline õhuniiskus ja fotoperiood 8 tundi valgust / 16 tundi pimedust). Kõiki potte kasteti iga kahe nädala tagant ja töödeldi iga kuu tasakaalustatud NPK väetisega (20-20-20, 3,6% väävli ja TE mikroelementidega; Zain Seeds, Egiptus) kontsentratsiooniga 3–4 g/l lehtedele pritsimise teel vastavalt konkreetse sordi soovitustele ja tootja juhistele. Kui ei ole teisiti märgitud, koguti igalt bioloogiliselt replikaadilt 72 tundi pärast töötlemist (hpt) täielikult paisunud küpsed lehed (2. ja 3. leht ülevalt), homogeniseeriti, ühendati ja säilitati temperatuuril -80 °C edasiseks analüüsiks, sealhulgas, kuid mitte ainult, oksüdatiivse stressi indikaatorite in situ histokeemiliseks lokaliseerimiseks, lipiidide peroksüdatsiooniks, ensümaatilisteks ja mitteensümaatilisteks antioksüdantideks ning geeniekspressiooniks.
Valge hallituse nakkuse intensiivsust hinnati igal nädalal 21 päeva pärast nakatamist (dpi), kasutades skaalat 1–9 (lisatabel S2), mis põhines Petzoldti ja Dicksoni skaalal (1996), mida modifitseerisid Teran jt (2006). Lühidalt, oataimede varsi ja oksi uuriti alates nakatamise kohast, et jälgida kahjustuste progresseerumist piki sõlmevahesid ja sõlmesid. Seejärel mõõdeti kahjustuse kaugus nakatamise kohast kuni varre või oksa kõige kaugema punktini ja määrati kahjustuse asukoha põhjal skoor 1–9, kus (1) näitas nähtava nakkuse puudumist nakatamise koha lähedal ja (2–9) näitas kahjustuse suuruse järkjärgulist suurenemist ja progresseerumist piki sõlmesid/sõlmi (lisatabel S2). Seejärel teisendati valge hallituse nakkuse intensiivsus protsentideks, kasutades valemit 2:
Lisaks arvutati haiguse progresseerumise kõvera alune pindala (AUDPC) valemi (Shaner ja Finney, 1977) abil, mida hiljuti kohandati hariliku oa valgemädaniku jaoks (Chauhan jt, 2020) võrrandi 3 abil:
Kus Yi = haiguse raskusaste ajahetkel ti, Yi+1 = haiguse raskusaste järgmisel ajahetkel ti+1, ti = esimese mõõtmise aeg (päevades), ti+1 = järgmise mõõtmise aeg (päevades), n = ajapunktide või vaatluspunktide koguarv. Oataime kasvuparameetreid, sealhulgas taime kõrgust (cm), okste arvu taime kohta ja lehtede arvu taime kohta, registreeriti igal nädalal 21 päeva jooksul kõigis bioloogilistes kordustes.
Igas bioloogilises korduses koguti leheproovid (teine ​​ja kolmas täielikult arenenud leht pealtpoolt) 45. päeval pärast töötlemist (15 päeva pärast viimast töötlemist). Iga bioloogiline kordus koosnes viiest potist (kaks taime poti kohta). Umbes 500 mg purustatud kudet kasutati fotosünteetiliste pigmentide (klorofüll a, klorofüll b ja karotenoidid) ekstraheerimiseks 80% atsetooniga temperatuuril 4 °C pimedas. 24 tunni pärast tsentrifuugiti proovid ja supernatant koguti klorofüll a, klorofüll b ja karotenoidide sisalduse määramiseks kolorimeetriliselt, kasutades UV-160A spektrofotomeetrit (Shimadzu Corporation, Jaapan) vastavalt Lichtenthaleri 1987. aasta meetodile, mõõtes neeldumist kolmel erineval lainepikkusel (A470, A646 ja A663 nm). Lõpuks arvutati fotosünteetiliste pigmentide sisaldus, kasutades Lichtenthaleri (1987) kirjeldatud valemeid 4–6.
72 tundi pärast töötlemist (hpt) koguti igalt bioloogiliselt replikaadilt lehed (teine ​​ja kolmas täielikult arenenud leht pealtpoolt) vesinikperoksiidi (H2O2) ja superoksiidi aniooni (O2•−) in situ histokeemiliseks lokaliseerimiseks. Iga bioloogiline replikaat koosnes viiest potist (kaks taime poti kohta). Meetodi täpsuse, usaldusväärsuse ja reprodutseeritavuse tagamiseks analüüsiti iga bioloogilist replikaati kahes korduses (kaks tehnilist replikaati). H2O2 ja O2•− määramiseks kasutati vastavalt 0,1% 3,3′-diaminobensidiini (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Saksamaa) või nitrosinist tetrasooliumi (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Saksamaa), järgides Romero-Puertas jt (2004) ja Adam jt (1989) kirjeldatud meetodeid väikeste muudatustega. H2O2 histokeemiliseks lokaliseerimiseks in situ infiltreeriti voldikuid vaakumis 0,1% DAB-ga 10 mM Tris-puhvris (pH 7,8) ja inkubeeriti seejärel toatemperatuuril valguse käes 60 minutit. Voldikud pleegitati 0,15% (v/v) TCA-s 4:1 (v/v) etanooli ja kloroformi segus (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Egiptus) ja seejärel valgustati kuni tumenemiseni. Samamoodi infiltreeriti klapid vaakumis 10 mM kaaliumfosfaatpuhvriga (pH 7,8), mis sisaldas 0,1 w/v% HBT-d, et in situ histokeemiliselt lokaliseerida. Voldikuid inkubeeriti valguse käes toatemperatuuril 20 minutit, seejärel pleegitati nagu eespool kirjeldatud ja seejärel valgustati, kuni ilmusid tumesinised/violetsed laigud. Saadud pruuni (H2O2 indikaatorina) või sinakasvioletse (O2•− indikaatorina) värvuse intensiivsust hinnati pilditöötluspaketi ImageJ Fiji versiooni abil (http://fiji.sc; külastatud 7. märtsil 2024).
Malondialdehüüdi (MDA; lipiidide peroksüdatsiooni markerina) sisaldus määrati Du ja Bramlage'i (1992) meetodi kohaselt väikeste muudatustega. Iga bioloogilise replikaadi lehed (teine ​​ja kolmas täielikult arenenud leht pealtpoolt) koguti 72 tundi pärast töötlemist (hpt). Iga bioloogiline replikaat sisaldas viit potti (kaks taime poti kohta). Iga bioloogilist replikaati analüüsiti kahes korduses (kaks tehnilist kordust), et tagada meetodi täpsus, usaldusväärsus ja reprodutseeritavus. Lühidalt, MDA ekstraheerimiseks 20% trikloroäädikhappega (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA), mis sisaldas 0,01% butüülitud hüdroksütolueeni (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), kasutati 0,5 g jahvatatud lehekude. Seejärel määrati supernatandi MDA sisaldus kolorimeetriliselt, mõõtes neeldumist lainepikkustel 532 ja 600 nm, kasutades UV-160A spektrofotomeetrit (Shimadzu Corporation, Jaapan), ning seejärel väljendati see nmol g−1 FW-na.
Mitteensümaatiliste ja ensümaatiliste antioksüdantide hindamiseks koguti igalt bioloogiliselt replikaadilt 72 tundi pärast töötlemist (hpt) lehed (teine ​​ja kolmas täielikult arenenud leht pealtpoolt). Iga bioloogiline replikaat koosnes viiest potist (kaks taime poti kohta). Iga bioloogilist proovi analüüsiti kahes korduses (kaks tehnilist proovi). Kaks lehte jahvatati vedela lämmastikuga ja kasutati otse ensümaatiliste ja mitteensümaatiliste antioksüdantide, aminohapete kogusisalduse, proliini sisalduse, geeniekspressiooni ja oksalaadi kvantifitseerimise määramiseks.
Lahustuvate fenoolide koguhulk määrati Folin-Ciocalteu reagendi (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) abil, muutes veidi Kahkoneni jt (1999) kirjeldatud meetodit. Lühidalt, ligikaudu 0,1 g homogeniseeritud lehekude ekstraheeriti 20 ml 80% metanooliga pimedas 24 tundi ja pärast tsentrifuugimist koguti supernatant. 0,1 ml prooviekstrakti segati 0,5 ml Folin-Ciocalteu reagendiga (10%), loksutati 30 sekundit ja jäeti 5 minutiks pimedasse. Seejärel lisati igasse katseklaasi 0,5 ml 20% naatriumkarbonaadi lahust (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Kairo, Egiptus), segati hoolikalt ja inkubeeriti toatemperatuuril pimedas 1 tund. Pärast inkubeerimist mõõdeti reaktsioonisegu neeldumist lainepikkusel 765 nm, kasutades UV-160A spektrofotomeetrit (Shimadzu Corporation, Jaapan). Prooviekstraktides sisalduvate lahustuvate fenoolide kogukontsentratsioon määrati gallushappe kalibreerimiskõvera abil (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) ja väljendati gallushappe ekvivalendi milligrammides värske kaalu grammi kohta (mg GAE g-1 värske kaalu kohta).
Lahustuvate flavonoidide kogusisaldus määrati Djeridane jt (2006) meetodi kohaselt väikeste muudatustega. Lühidalt, 0,3 ml ülaltoodud metanooliekstrakti segati 0,3 ml 5% alumiiniumkloriidi lahusega (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), segati hoolikalt ja inkubeeriti seejärel toatemperatuuril 5 minutit, millele järgnes 0,3 ml 10% kaaliumatsetaadi lahuse (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egiptus) lisamine, segati hoolikalt ja inkubeeriti toatemperatuuril 30 minutit pimedas. Pärast inkubeerimist mõõdeti reaktsioonisegu neeldumist lainepikkusel 430 nm, kasutades UV-160A spektrofotomeetrit (Shimadzu Corporation, Jaapan). Prooviekstraktides sisalduvate lahustuvate flavonoidide kogusisaldus määrati rutiini kalibreerimiskõvera abil (TCI America, Portland, OR, USA) ja seejärel väljendati rutiini ekvivalendi milligrammides värske kaalu grammi kohta (mg RE g-1 värske kaalu kohta).
Oalehtede vabade aminohapete kogusisaldus määrati modifitseeritud ninhüdriini reagendiga (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA), mis põhines Yokoyama ja Hiramatsu (2003) pakutud ning Suni jt (2006) poolt modifitseeritud meetodil. Lühidalt, 0,1 g jahvatatud kude ekstraheeriti pH 5,4 puhvriga ja 200 μl supernatanti reageeriti 200 μl ninhüdriini (2%) ja 200 μl püridiiniga (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), inkubeeriti keevas veevannis 30 minutit, seejärel jahutati ja mõõdeti lainepikkusel 580 nm, kasutades UV-160A spektrofotomeetrit (Shimadzu Corporation, Jaapan). Proliini sisaldus määrati Batesi meetodil (Bates jt, 1973). Proliin ekstraheeriti 3% sulfosalitsüülhappega (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) ja pärast tsentrifuugimist segati 0,5 ml supernatanti 1 ml jää-äädikhappega (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) ja ninhüdriini reagendiga, inkubeeriti temperatuuril 90 °C 45 minutit, jahutati ja mõõdeti lainepikkusel 520 nm, kasutades sama spektrofotomeetrit nagu eespool. Leheekstraktides sisalduvate vabade aminohapete ja proliini koguhulk määrati vastavalt glütsiini ja proliini kalibreerimiskõverate abil (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ning väljendati mg/g värske kaalu kohta.
Antioksüdantsete ensüümide ensümaatilise aktiivsuse määramiseks ekstraheeriti ligikaudu 500 mg homogeniseeritud kude 3 ml 50 mM Tris-puhvriga (pH 7,8), mis sisaldas 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ja 7,5% polüvinüülpürrolidooni (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), tsentrifuugiti 10 000 × g juures 20 minutit külmkapis (4 °C) ja supernatant (toorensüümi ekstrakt) koguti (El-Nagar jt, 2023; Osman jt, 2023). Seejärel lasti katalaasil (CAT) reageerida 2 ml 0,1 M naatriumfosfaatpuhvriga (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ja 100 μl 269 mM H2O2 lahusega, et määrata selle ensümaatilist aktiivsust Aebi (1984) meetodil väikeste muudatustega (El-Nagar jt, 2023; Osman jt, 2023). Guajakoolist sõltuva peroksidaasi (POX) ensümaatilist aktiivsust määrati Harrach jt (2009) meetodil. (2008) väikeste muudatustega (El-Nagar jt, 2023; Osman jt, 2023) ja polüfenooloksüdaasi (PPO) ensümaatiline aktiivsus määrati pärast reaktsiooni 2,2 ml 100 mM naatriumfosfaatpuhvriga (pH 6,0), 100 μl guaiakooliga (TCI Chemicals, Portland, OR, USA) ja 100 μl 12 mM H2O2-ga. Meetod oli veidi muudetud võrreldes (El-Nagar jt, 2023; Osman jt, 2023). Analüüs viidi läbi pärast reaktsiooni 3 ml katehhoolilahusega (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0,01 M), mis oli värskelt valmistatud 0,1 M fosfaatpuhvris (pH 6,0). CAT aktiivsust mõõdeti H2O2 lagunemise jälgimisega lainepikkusel 240 nm (A240), POX aktiivsust mõõdeti neeldumise suurenemise jälgimisega lainepikkusel 436 nm (A436) ja PPO aktiivsust mõõdeti neeldumise kõikumiste registreerimisega lainepikkusel 495 nm (A495) iga 30 sekundi järel 3 minuti jooksul, kasutades UV-160A spektrofotomeetrit (Shimadzu, Jaapan).
Reaalaja RT-PCR-i abil tuvastati kolme antioksüdandina seotud geeni, sealhulgas peroksisomaalse katalaasi (PvCAT1; GenBanki registreerimisnumber KF033307.1), superoksiiddismutaasi (PvSOD; GenBanki registreerimisnumber XM_068639556.1) ja glutatioonreduktaasi (PvGR; GenBanki registreerimisnumber KY195009.1) transkriptitasemed oalehtedes (teine ​​ja kolmas täielikult arenenud leht pealtpoolt) 72 tundi pärast viimast töötlemist. Lühidalt, RNA eraldati, kasutades Simply P Total RNA Extraction Kit'i (katalooginumber BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Hiina) vastavalt tootja juhistele. Seejärel sünteesiti cDNA, kasutades TOP script™ cDNA Synthesis Kit'i vastavalt tootja juhistele. Ülaltoodud kolme geeni praimerjärjestused on loetletud lisatabelis S3. Kodukoristusgeenina kasutati PvActin-3 (GenBanki registreerimisnumber: XM_068616709.1) ja suhteline geeniekspressioon arvutati 2-ΔΔCT meetodi abil (Livak ja Schmittgen, 2001). Aktiini stabiilsust demonstreeriti biootilise stressi (kokkusobimatu interaktsioon harilike kaunviljade ja antraknoosseene Colletotrichum lindemuthianum vahel) ja abiootilise stressi (põud, soolsus, madal temperatuur) tingimustes (Borges et al., 2012).
Esmalt viisime läbi S. sclerotiorum'i oksaloatsetaatatsetüülhüdrolaasi (OAH) valkude genoomiülese in silico analüüsi, kasutades valk-valk BLAST tööriista (BLASTp 2.15.0+) (Altschul jt, 1997, 2005). Lühidalt, S. sclerotiorum'is oleva homoloogse valgu (taksiid: 5180) kaardistamiseks kasutasime päringujärjestustena Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taksiid: 1191702; GenBanki registreerimisnumber XP_040799428.1; 342 aminohapet) ja Penicillium lagena (PlOAH; taksiid: 94218; GenBanki registreerimisnumber XP_056833920.1; 316 aminohapet) OAH-d. BLASTp viidi läbi riikliku biotehnoloogia teabekeskuse (NCBI) veebisaidi GenBanki uusimate kättesaadavate S. sclerotiorum genoomiandmete alusel aadressil http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Lisaks tuletati MEGA11 maksimaalse tõepärasuse meetodi (Tamura jt, 2021) ja JTT maatriksipõhise mudeli (Jones jt, 1992) abil S. sclerotiorum'i ennustatud OAH geen (SsOAH) ning AfOAH ja P. lagena PlOAH evolutsiooniline analüüs ja fülogeneetiline puu. Fülogeneetiline puu kombineeriti kõigi S. sclerotiorum'i ennustatud OAH geenide (SsOAH) valgujärjestuste mitmekordse joondamise analüüsiga ja päringujärjestusega, kasutades piirangupõhise joondamise tööriista (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos ja Agarwala, 2007). Lisaks joondati S. sclerotiorum'i SsOAH kõige paremini sobivad aminohappejärjestused päringujärjestustega (AfOAH ja PlOAH) (Larkin et al., 2007), kasutades ClustalW-i (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), ja joonduses olevad konserveerunud piirkonnad visualiseeriti ESPript tööriista abil (versioon 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Lisaks klassifitseeriti S. sclerotiorum SsOAH ennustatud funktsionaalsed esindusdomeenid ja konserveerunud saidid interaktiivselt erinevatesse perekondadesse, kasutades InterPro tööriista (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum jt, 2021). Lõpuks viidi läbi ennustatud S. sclerotiorum SsOAH kolmemõõtmeline (3D) struktuuri modelleerimine, kasutades Protein Homology/Analogy Recognition Engine'it (Phyre2 serveri versioon 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley jt, 2015) ja valideeriti SWISS-MODEL serveriga (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini jt, 2014). Ennustatud kolmemõõtmelised struktuurid (PDB-vormingus) visualiseeriti interaktiivselt UCSF-Chimera paketi abil (versioon 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen jt, 2004).
Oksaloatsetaatatsetüülhüdrolaasi (SsOAH; GenBanki registreerimisnumber: XM_001590428.1) transkriptsioonitaseme määramiseks Sclerotinia sclerotiorum'i mütseelis kasutati kvantitatiivset reaalajas fluorestsents-PCR-i. Lühidalt, S. sclerotiorum inokuleeriti PDB-d sisaldavasse kolbi ja asetati loksutavasse inkubaatorisse (mudel: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) temperatuuril 25 ± 2 °C 24 tunniks kiirusel 150 p/min ja pidevas pimeduses (24 tundi), et stimuleerida mütseeli kasvu. Seejärel töödeldi rakke L-ornitiini ja fungitsiidiga Rizolex-T lõppkontsentratsioonides IC50 (vastavalt ligikaudu 40 ja 3,2 mg/l) ning kultiveeriti veel 24 tundi samades tingimustes. Pärast inkubeerimist tsentrifuugiti kultuure kiirusel 2500 p/min 5 minutit ja supernatant (seenemütseel) koguti geeniekspressiooni analüüsiks. Samamoodi koguti seeneniidistikku 0, 24, 48, 72, 96 ja 120 tundi pärast nakatamist nakatunud taimedelt, millel oli nakatunud kudede pinnale moodustunud valgehallitus ja vatitu seeneniidistik. Seeneniidistikust ekstraheeriti RNA ja seejärel sünteesiti cDNA, nagu eespool kirjeldatud. SsOAH praimerjärjestused on loetletud lisatabelis S3. Majapidamisgeenina kasutati SsActin'i (GenBanki registreerimisnumber: XM_001589919.1) ja suhteline geeniekspressioon arvutati 2-ΔΔCT meetodi abil (Livak ja Schmittgen, 2001).
Oksaalhappe sisaldust kartuli-dekstroosipuljongis (PDB) ja seenpatogeeni Sclerotinia sclerotiorum sisaldavates taimeproovides määrati Xu ja Zhangi (2000) meetodi kohaselt väikeste muudatustega. Lühidalt, S. sclerotiorum isolaadid inokuleeriti PDB-d sisaldavatesse kolbidesse ja seejärel kultiveeriti loksutavas inkubaatoris (mudel I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) kiirusel 150 p/min temperatuuril 25 ± 2 °C 3–5 päeva pidevas pimeduses (24 tundi), et stimuleerida mütseeli kasvu. Pärast inkubeerimist filtreeriti seenekultuur esmalt läbi Whatman #1 filterpaberi ja seejärel tsentrifuugiti kiirusel 2500 p/min 5 minutit, et eemaldada järelejäänud mütseel. Supernatant koguti ja säilitati temperatuuril 4 °C oksalaadi edasiseks kvantitatiivseks määramiseks. Taimeproovide ettevalmistamiseks ekstraheeriti ligikaudu 0,1 g taimekoe fragmente kolm korda destilleeritud veega (iga kord 2 ml). Seejärel tsentrifuugiti proove kiirusel 2500 p/min 5 minutit, supernatant filtriti kuivfiltril läbi Whatman nr 1 filterpaberi ja koguti edasiseks analüüsiks.
Oksaalhappe kvantitatiivseks analüüsiks valmistati reaktsioonisegu klaaskorgiga katseklaasis järgmises järjekorras: 0,2 ml proovi (või PDB kultuuri filtraati või oksaalhappe standardlahust), 0,11 ml bromofenoolsinist (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0,198 ml 1 M väävelhapet (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egiptus) ja 0,176 ml 100 mM kaaliumdikromaati (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA) ning seejärel lahjendati lahus destilleeritud veega 4,8 ml-ni, segati hoolikalt ja asetati kohe 60 °C veevanni. 10 minuti pärast peatati reaktsioon 0,5 ml naatriumhüdroksiidi lahuse (NaOH; 0,75 M) lisamisega. Reaktsioonisegu neeldumist (A600) mõõdeti lainepikkusel 600 nm, kasutades UV-160 spektrofotomeetrit (Shimadzu Corporation, Jaapan). Kultuurifiltraatide ja taimeproovide kvantifitseerimiseks kasutati kontrollidena vastavalt PDB-d ja destilleeritud vett. Oksaalhappe kontsentratsioonid kultuurifiltraatides, väljendatuna oksaalhappe mikrogrammides milliliitri PDB söötme kohta (μg.mL−1), ja leheekstraktides, väljendatuna oksaalhappe mikrogrammides värske kaalu grammi kohta (μg.g−1 FW), määrati oksaalhappe kalibreerimiskõvera abil (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
Kogu uuringu vältel kavandati kõik katsed täielikult randomiseeritud disaini (CRD) alusel, kus iga töötluskorra kohta oli kuus bioloogilist kordust ja viis potti bioloogilise korduse kohta (kaks taime poti kohta), kui pole teisiti märgitud. Bioloogilisi kordusi analüüsiti kahes korduses (kaks tehnilist kordust). Tehnilisi kordusi kasutati sama katse reprodutseeritavuse kontrollimiseks, kuid neid ei kasutatud statistilises analüüsis, et vältida valekordusi. Andmeid analüüsiti statistiliselt dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil, millele järgnes Tukey-Krameri ausalt olulise erinevuse (HSD) test (p ≤ 0,05). In vitro katsete puhul arvutati IC50 ja IC99 väärtused probit-mudeli abil ning arvutati 95% usaldusvahemikud.
Egiptuse El Ghabiya kubermangu erinevatelt sojaoapõldudelt koguti kokku neli isolaati. PDA söötmel tekitasid kõik isolaadid kreemikasvalget seeneniidistikku, mis muutus kiiresti vatitaoliseks valgeks (joonis 1A) ja seejärel sklerootsiumi staadiumis beežiks või pruuniks. Sklerootsiumid on tavaliselt tihedad, mustad, sfäärilised või ebakorrapärase kujuga, 5,2–7,7 mm pikad ja 3,4–5,3 mm läbimõõduga (joonis 1B). Kuigi neljal isolaadil tekkis pärast 10–12-päevast inkubeerimist temperatuuril 25 ± 2 °C kultuurikeskkonna servas sklerootsiumide marginaalne muster (joonis 1A), oli sklerootsiumide arv plaadi kohta nende vahel oluliselt erinev (P < 0,001), kusjuures isolaadil 3 oli kõige rohkem sklerootsiume (32,33 ± 1,53 sklerootsiumi plaadi kohta; joonis 1C). Samamoodi tootis isolaat nr 3 PDB-s rohkem oblikhapet kui teised isolaadid (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; joonis 1D). Isolaadil nr 3 olid fütopatogeensele seenele Sclerotinia sclerotiorum iseloomulikud morfoloogilised ja mikroskoopilised omadused. Näiteks PDA-l kasvasid isolaadi nr 3 kolooniad kiiresti, olid kreemikasvalged (joonis 1A), tagurpidi beežid või heledad lõhekollakaspruunid ning neil kulus 9 cm läbimõõduga plaadi pinna täielikuks katmiseks 6–7 päeva temperatuuril 25 ± 2 °C. Eeltoodud morfoloogiliste ja mikroskoopiliste omaduste põhjal identifitseeriti isolaat nr 3 kui Sclerotinia sclerotiorum.
Joonis 1. Harilike kaunviljade S. sclerotiorum isolaatide omadused ja patogeneesus. (A) Nelja S. sclerotiorum isolaadi seeneniidistiku kasv PDA söötmel, (B) nelja S. sclerotiorum isolaadi sklerootsiumid, (C) sklerootsiumide arv (plaadi kohta), (D) oblikhappe sekretsioon PDB söötmel (μg.mL−1) ja (E) nelja S. sclerotiorum isolaadi haiguse raskusaste (%) vastuvõtlikul kaubanduslikul kaunvilja sordil Giza 3 kasvuhoonetingimustes. Väärtused esindavad viie bioloogilise korduse keskmist ± standardhälvet (n = 5). Erinevad tähed näitavad statistiliselt olulisi erinevusi töötluste vahel (p < 0,05). (F–H) Tüüpilised valgehallituse sümptomid ilmnesid vastavalt maapealsetel vartel ja õisikutel 10 päeva pärast isolaadiga nr 3 nakatamist (dpi). (I) S. sclerotiorum isolaadi #3 sisemise transkribeeritud vahetüki (ITS) piirkonna evolutsiooniline analüüs viidi läbi maksimaalse tõenäosuse meetodil ja seda võrreldi 20 võrdlusisolaadi/tüvega, mis saadi Riikliku Biotehnoloogia Informatsiooni Keskuse (NCBI) andmebaasist (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Klasterdusjoonte kohal olevad numbrid näitavad piirkonna ulatust (%) ja klastritusjoonte all olevad numbrid näitavad haru pikkust.
Lisaks kasutati patogeensuse kinnitamiseks nelja saadud S. sclerotiorum isolaati vastuvõtliku kaubandusliku oa sordi Giza 3 inokuleerimiseks kasvuhoonetingimustes, mis on kooskõlas Kochi postulaatidega (joonis 1E). Kuigi kõik saadud seeneisolaadid olid patogeensed ja võisid nakatada rohelist uba (sort Giza 3), põhjustades tüüpilisi valgehallituse sümptomeid kõigil maapealsetel osadel (joonis 1F), eriti vartel (joonis 1G) ja kaunadel (joonis 1H) 10 päeva pärast inokuleerimist (dpi), oli isolaat 3 kahes sõltumatus katses kõige agressiivsem isolaat. Isolaadil 3 oli oataimedel kõrgeim haiguse raskusaste (%) (vastavalt 24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 ja 76,7 ± 3,1 7, 14 ja 21 päeva pärast nakatamist; joonis 1F).
Kõige invasiivsema S. sclerotiorum isolaadi nr 3 identifitseerimist kinnitati täiendavalt sisemise transkribeeritud vahetüki (ITS) sekveneerimise abil (joonis 1I). Isolaadi nr 3 ja 20 võrdlusisolaadi/tüve fülogeneetiline analüüs näitas nende vahel suurt sarnasust (>99%). Tasub märkida, et S. sclerotiorum isolaadil nr 3 (533 bp) on suur sarnasus Ameerika S. sclerotiorum isolaadiga LPM36, mis eraldati kuivadest herneseemnetest (GenBanki registreerimisnumber MK896659.1; 540 bp) ja Hiina S. sclerotiorum isolaadiga YKY211 (GenBanki registreerimisnumber OR206374.1; 548 bp), mis põhjustab violetse (Matthiola incana) varremädanikku, mis kõik on dendrogrammi ülaosas eraldi rühmitatud (joonis 1I). Uus järjestus on deponeeritud NCBI andmebaasi ja nimetatud „Sclerotinia sclerotiorum – isolaat YN-25” (GenBanki registreerimisnumber PV202792). On näha, et isolaat 3 on kõige invasiivsem isolaat; seetõttu valiti see isolaat uurimiseks kõigis järgnevates katsetes.
Diamiin L-ornitiini (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Saksamaa) antibakteriaalset aktiivsust S. sclerotiorum isolaadi 3 vastu uuriti in vitro. On tähelepanuväärne, et L-ornitiin avaldas antibakteriaalset toimet ja pärssis järk-järgult S. sclerotiorum hüüfide radiaalset kasvu annusest sõltuval viisil (joonis 2A, B). Kõrgeimal testitud kontsentratsioonil (125 mg/l) näitas L-ornitiin kõrgeimat mütseeli kasvu pärssimise määra (99,62 ± 0,27%; joonis 2B), mis oli samaväärne kaubandusliku fungitsiidi Rizolex-T omaga (pidurdamismäär 99,45 ± 0,39%; joonis 2C) kõrgeimal testitud kontsentratsioonil (10 mg/l), mis näitab sarnast efektiivsust.
Joonis 2. L-ornitiini antibakteriaalne toime Sclerotinia sclerotiorum'i vastu in vitro. (A) L-ornitiini erinevate kontsentratsioonide antibakteriaalse toime võrdlus S. sclerotiorum'i vastu kaubandusliku fungitsiidi Rizolex-T-ga (10 mg/l). (B, C) S. sclerotiorum'i mütseeli kasvu inhibeerimismäär (%) pärast töötlemist vastavalt erinevate L-ornitiini kontsentratsioonidega (12,5, 25, 50, 75, 100 ja 125 mg/l) või Rizolex-T-ga (2, 4, 6, 8 ja 10 mg/l). Väärtused esindavad viie bioloogilise korduse keskmist ± standardhälvet (n = 5). Erinevad tähed tähistavad statistilisi erinevusi töötluste vahel (p < 0,05). (D, E) L-ornitiini ja kaubandusliku fungitsiidi Rizolex-T probit-mudeli regressioonanalüüs. Probit-mudeli regressioonijoon on näidatud pideva sinise joonena ja usaldusvahemik (95%) katkendliku punase joonena.
Lisaks teostati probit-regressioonanalüüs ja vastavad graafikud on näidatud tabelis 1 ja joonistel 2D, E. Lühidalt öeldes näitasid L-ornitiini vastuvõetav tõusuväärtus (y = 2,92x − 4,67) ja sellega seotud olulised statistilised näitajad (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 ja p < 0,0001; joonis 2D) suurenenud seenevastast aktiivsust S. sclerotiorum'i vastu võrreldes kaubandusliku fungitsiidiga Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 ja p < 0,0001) (tabel 1).
Tabel 1. L-ornitiini ja kaubandusliku fungitsiidi “Rizolex-T” poolmaksimaalse inhibeeriva kontsentratsiooni (IC50) ja IC99 (mg/l) väärtused S. sclerotiorum'i vastu.
Üldiselt vähendas L-ornitiin (250 mg/l) töödeldud hariliku oa taimedel oluliselt valgehallituse arengut ja raskusastet võrreldes töötlemata S. sclerotiorum'iga nakatatud taimedega (kontrollgrupp; joonis 3A). Lühidalt, kuigi töötlemata nakatunud kontrolltaimede haiguse raskusaste järk-järgult suurenes (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 ja 92,33 ± 3,06%), vähendas L-ornitiin haiguse raskusastet (%) kogu katse jooksul oluliselt (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 ja 26,36 ± 3,07) vastavalt 7., 14. ja 21. päeval pärast töötlemist (joonis 3A). Samamoodi, kui S. sclerotiorum'iga nakatatud ubataimi töödeldi 250 mg/l L-ornitiiniga, vähenes haiguse progresseerumise kõvera alune pindala (AUDPC) töötlemata kontrollrühmas 1274,33 ± 33,13-lt 281,03 ± 7,95-ni, mis oli veidi madalam kui positiivse kontrollina kasutatud 50 mg/l Rizolex-T fungitsiidil (183,61 ± 7,71; joonis 3B). Sama trendi täheldati ka teises katses.
Joon. 3. L-ornitiini eksogeense manustamise mõju Sclerotinia sclerotiorum'i põhjustatud hariliku oa valgemädaniku arengule kasvuhoonetingimustes. (A) Hariliku oa valgehallituse haiguse progresseerumiskõver pärast töötlemist 250 mg/L L-ornitiiniga. (B) Hariliku oa valgehallituse haiguse progresseerumiskõvera alune pindala (AUDPC) pärast töötlemist L-ornitiiniga. Väärtused esindavad viie bioloogilise korduse keskmist ± standardhälvet (n = 5). Erinevad tähed tähistavad statistiliselt olulisi erinevusi töötluste vahel (p < 0,05).
250 mg/L L-ornitiini eksogeenne manustamine suurendas järk-järgult taime kõrgust (joonis 4A), okste arvu taime kohta (joonis 4B) ja lehtede arvu taime kohta (joonis 4C) 42 päeva pärast. Kuigi kaubanduslik fungitsiid Rizolex-T (50 mg/L) avaldas kõigile uuritud toitumisparameetritele suurimat mõju, oli 250 mg/L L-ornitiini eksogeensel manustamisel töötlemata kontrollrühmaga võrreldes suuruselt teine ​​mõju (joonis 4A–C). Seevastu L-ornitiiniga töötlemisel ei olnud olulist mõju fotosünteesi pigmentide klorofüll a (joonis 4D) ja klorofüll b (joonis 4E) sisaldusele, kuid karotenoidide kogusisaldus suurenes veidi (0,56 ± 0,03 mg/g taime kohta) võrreldes negatiivse kontrolliga (0,44 ± 0,02 mg/g taime kohta) ja positiivse kontrolliga (0,46 ± 0,02 mg/g taime kohta; joonis 4F). Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et L-ornitiin ei ole töödeldud kaunviljade suhtes fütotoksiline ja võib isegi stimuleerida nende kasvu.
Joonis 4. Eksogeense L-ornitiini manustamise mõju Sclerotinia sclerotiorum'iga nakatatud oalehtede kasvuomadustele ja fotosünteesi pigmentidele kasvuhoonetingimustes. (A) Taime kõrgus (cm), (B) Okste arv taime kohta, (C) Lehtede arv taime kohta, (D) Klorofüll a sisaldus (mg g-1 massi järgi), (E) Klorofüll b sisaldus (mg g-1 massi järgi), (F) Karotenoidide kogusisaldus (mg g-1 massi järgi). Väärtused on viie bioloogilise korduse keskmine ± standardhälve (n = 5). Erinevad tähed näitavad statistiliselt olulisi erinevusi töötluste vahel (p < 0,05).
Reaktiivsete hapnikuühendite (ROS; väljendatud vesinikperoksiidina [H2O2]) ja vabade radikaalide (väljendatud superoksiidi anioonidena [O2•−]) in situ histokeemiline lokaliseerimine näitas, et L-ornitiini (250 mg/l) eksogeenne manustamine vähendas oluliselt H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; joonis 5A) ja O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; joonis 5B) akumuleerumist võrreldes nii töötlemata nakatunud taimede (vastavalt 173,31 ± 12,06 ja 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW) kui ka 50 mg/l kaubandusliku fungitsiidi Rizolex-T-ga töödeldud taimede (vastavalt 170,12 ± 9,50 ja 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt) akumuleerumisega 72 tunni pärast. HPT ajal akumuleerusid kõrged H2O2 ja O2•− tasemed (joonis 5A, B). Sarnaselt näitas TCA-põhine malondialdehüüdi (MDA) analüüs, et S. sclerotiorum'iga nakatatud oataimede lehtedes akumuleerus kõrgemad MDA tasemed (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) (joonis 5C). L-ornitiini eksogeenne manustamine vähendas aga oluliselt lipiidide peroksüdatsiooni, mida tõendab MDA sisalduse vähenemine töödeldud taimedes (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
Joon. 5. Eksogeense L-ornitiini manustamise mõju oksüdatiivse stressi peamistele markeritele ja mitteensümaatilistele antioksüdantsetele kaitsemehhanismidele S. sclerotiorum'iga nakatatud oalehtedes 72 tundi pärast nakatamist kasvuhoonetingimustes. (A) Vesinikperoksiid (H2O2; nmol g−1 FW) 72 hpt juures, (B) superoksiidi anioon (O2•−; nmol g−1 FW) 72 hpt juures, (C) malondialdehüüd (MDA; nmol g−1 FW) 72 hpt juures, (D) lahustuvate fenoolide koguhulk (mg GAE g−1 FW) 72 hpt juures, (E) lahustuvate flavonoidide koguhulk (mg RE g−1 FW) 72 hpt juures, (F) vabade aminohapete koguhulk (mg g−1 FW) 72 hpt juures ja (G) proliini sisaldus (mg g−1 FW) 72 hpt juures. Väärtused tähistavad 5 bioloogilise korduse (n = 5) keskmist ± standardhälvet (keskmine ± SD). Erinevad tähed näitavad statistiliselt olulisi erinevusi ravimeetodite vahel (p < 0,05).