Täname teid Nature.com-i külastamise eest. Teie kasutataval brauseriversioonil on CSS-i jaoks piiratud tugi. Parima kogemuse saamiseks soovitame teil kasutada värskendatud brauserit (või lülitada Internet Exploreris ühilduvusrežiim välja). Seni kuvame saiti jätkuva toe tagamiseks ilma stiilide ja JavaScriptita.
Suure koormussisaldusega insuliini nanoosakesed (NP-d) on leidnud erinevaid rakendusi erinevates ravimvormides. Selle töö eesmärk on hinnata külmkuivatamise ja pihustuskuivatamise protsesside mõju insuliiniga laetud kitosaani nanoosakeste struktuurile, krüoprotektorina mannitooliga või ilma. Samuti hindasime nende nanoosakeste kvaliteeti, lahustades neid uuesti. Enne dehüdreerimist optimeeriti kitosaani/naatriumtripolüfosfaadi/insuliini ristseotud nanoosakeste suurus 318 nm-ni, PDI oli 0,18, kapseldamise efektiivsus oli 99,4% ja koormus oli 25,01%. Pärast lahustamist säilitasid kõik nanoosakesed, välja arvatud need, mis saadi külmkuivatamise meetodil ilma mannitooli kasutamata, oma sfäärilise osakeste struktuuri. Võrreldes mannitooli sisaldavate nanoosakestega, mis olid dehüdreeritud kummagi pihustamisega, näitasid mannitoolivabad pihustuskuivatatud nanoosakesed samuti väikseimat keskmist osakeste suurust (376 nm) ja suurimat koormussisaldust (25,02%), kuivatamisel sarnase kapseldamise määraga (98,7%) ja PDI-ga (0,20). või külmkuivatamise tehnikaid. Ilma mannitoolita pihustuskuivatamise teel kuivatatud nanoosakesed andsid samuti insuliini kiireima vabanemise ja raku omastamise kõrgeima efektiivsuse. See töö näitab, et pihustuskuivatamine võib insuliini nanoosakesi dehüdreerida ilma krüoprotektantide vajaduseta võrreldes tavapäraste külmkuivatamise meetoditega, luues suurema kandevõime, väiksema lisandivajaduse ja tegevuskulud, mis annab olulise eelise.
Alates avastamisest 1922. aastal1,2,3 on insuliin ja selle ravimpreparaadid päästnud 1. tüüpi diabeediga (T1DM) ja 2. tüüpi diabeediga (T1DM) patsientide elusid. Kuid kuna insuliin on suure molekulmassiga valk, agregeerub see kergesti, lagundab proteolüütilised ensüümid ja elimineerub esmase maksapassaaži kaudu. 1. tüüpi diabeediga diagnoositud inimesed vajavad insuliinisüste kogu ülejäänud eluks. Paljud patsiendid, kellel esialgu diagnoositi 2. tüüpi diabeet, vajavad ka pikaajalisi insuliinisüste. Igapäevased insuliinisüstid on nende inimeste jaoks tõsine igapäevane valu ja ebamugavustunde allikas, millel on negatiivne mõju vaimsele tervisele. Seetõttu uuritakse põhjalikult teisi insuliini manustamise vorme, mis põhjustavad vähem ebamugavust, näiteks suukaudset insuliini manustamist,5 kuna neil on potentsiaal taastada ligikaudu 5 miljardi diabeediga inimese elukvaliteet kogu maailmas.
Nanoosakeste tehnoloogia on andnud märkimisväärse edasimineku suukaudse insuliini manustamise katsetes4,6,7. See on tehnoloogia, mis kapseldab insuliini tõhusalt ja kaitseb seda lagunemise eest, et seda saaks sihipäraselt manustada konkreetsetesse kehapiirkondadesse. Nanoosakeste preparaatide kasutamisel on aga mitmeid piiranguid, peamiselt osakeste suspensioonide stabiilsusprobleemide tõttu. Säilitamise ajal võib esineda teatud agregatsiooni, mis vähendab insuliiniga laetud nanoosakeste biosaadavust8. Lisaks tuleb insuliini nanoosakeste (NP-de) stabiilsuse tagamiseks arvestada ka nanoosakeste ja insuliini polümeermaatriksi keemilise stabiilsusega. Praegu on külmkuivatamise tehnoloogia stabiilsete NP-de loomise kuldstandard, vältides samal ajal soovimatuid muutusi säilitamise ajal9.
Külmkuivatamine nõuab aga krüoprotektantide lisamist, et vältida NP-de sfäärilise struktuuri mõjutamist jääkristallide mehaanilise pinge poolt. See vähendab oluliselt insuliini nanoosakeste laadimist pärast lüofiliseerimist, kuna krüoprotektant moodustab suurema osa kaalusuhtest. Seetõttu leitakse, et toodetud insuliini NP-d ei sobi sageli kuiva pulbri, näiteks suukaudsete tablettide ja suukaudsete kilede tootmiseks, kuna insuliini terapeutilise akna saavutamiseks on vaja suures koguses kuivi nanoosakesi.
Pihustuskuivatamine on farmaatsiatööstuses hästi tuntud ja odav tööstusliku ulatusega protsess vedelfaasidest kuivade pulbrite tootmiseks10,11. Osakeste moodustumise protsessi kontroll võimaldab mitmete bioaktiivsete ühendite nõuetekohast kapseldamist12,13. Lisaks on see muutunud tõhusaks tehnikaks suukaudseks manustamiseks mõeldud kapseldatud valkude valmistamiseks. Pihustuskuivatamise ajal aurustub vesi väga kiiresti, mis aitab hoida osakeste südamiku temperatuuri madalal11,14, võimaldades selle kasutamist kuumustundlike komponentide kapseldamiseks. Enne pihustuskuivatamist tuleks kattematerjal kapseldatud koostisosi sisaldava lahusega põhjalikult homogeniseerida11,14. Erinevalt külmkuivatamisest parandab pihustuskuivatamisel kapseldamisele eelnev homogeniseerimine kapseldamise efektiivsust dehüdratsiooni ajal. Kuna pihustuskuivatamise kapseldamisprotsess ei vaja krüoprotektoreid, saab pihustuskuivatamist kasutada suure täiteaine sisaldusega kuivatatud NP-de tootmiseks.
See uuring kirjeldab insuliiniga laetud nanoosakeste tootmist kitosaani ja naatriumtripolüfosfaadi ristseostamise teel ioongeeli meetodil. Ioongeelistamine on valmistusmeetod, mis võimaldab nanoosakeste tootmist kahe või enama ioonse liigi vahelise elektrostaatilise interaktsiooni kaudu teatud tingimustel. Optimeeritud kitosaani/naatriumtripolüfosfaadi/insuliini ristseotud nanoosakeste dehüdreerimiseks kasutati nii külmkuivatamise kui ka pihustuskuivatamise tehnikaid. Pärast dehüdreerimist analüüsiti nende morfoloogiat SEM-i abil. Nende rekombinatsioonivõimet hinnati, mõõtes nende suurusjaotust, pinnalaengut, PDI-d, kapseldamise efektiivsust ja laadimissisaldust. Erinevate dehüdratsioonimeetoditega toodetud resolubiliseeritud nanoosakeste kvaliteeti hinnati ka nende insuliinikaitse, vabanemiskäitumise ja rakulise omastamise efektiivsuse võrdlemise teel.
Segatud lahuse pH ja kitosaani ja insuliini suhe on kaks peamist tegurit, mis mõjutavad lõplike NP-de osakeste suurust ja kapseldamise efektiivsust (EE), kuna need mõjutavad otseselt ionotroopset geelistumisprotsessi. Segatud lahuse pH oli korrelatsioonis osakeste suuruse ja kapseldamise efektiivsusega (joonis 1a). Nagu joonisel 1a näidatud, siis pH tõustes 4,0-lt 6,0-le vähenes keskmine osakeste suurus (nm) ja EE suurenes märkimisväärselt, samas kui pH tõustes 6,5-ni hakkas keskmine osakeste suurus suurenema ja EE jäi samaks. Kitosaani ja insuliini suhte suurenedes suureneb ka keskmine osakeste suurus. Lisaks ei täheldatud EE muutust, kui nanoosakesed valmistati kitosaani/insuliini massisuhtega üle 2,5:1 (massi järgi) (joonis 1b). Seetõttu kasutati selles uuringus optimaalseid valmistustingimusi (pH 6,0, kitosaani/insuliini massisuhe 2,5:1) insuliiniga laetud lahuste valmistamiseks. nanoosakesed edasiseks uurimiseks. Nendes ettevalmistustingimustes optimeeriti insuliini nanoosakeste keskmine osakeste suurus 318 nm-ni (joonis 1c), PDI oli 0,18, manustamise efektiivsus oli 99,4%, dzeeta potentsiaal oli 9,8 mV ja insuliini sisaldus oli 25,01% (m/m). Läbilaskva elektronmikroskoopia (TEM) tulemuste põhjal olid optimeeritud nanoosakesed ligikaudu sfäärilised ja diskreetsed, suhteliselt ühtlase suurusega (joonis 1d).
Insuliini nanoosakeste parameetrite optimeerimine: (a) pH mõju insuliini nanoosakeste keskmisele läbimõõdule ja kapseldamise efektiivsusele (EE) (valmistatud kitosaani ja insuliini massisuhtega 5:1); (b) kitosaan ja insuliini massisuhte mõju insuliini nanoosakeste keskmisele läbimõõdule ja kapseldamise efektiivsusele (EE) (valmistatud pH väärtusel 6); (c) optimeeritud insuliini nanoosakeste osakeste suurusjaotus; (d) optimeeritud insuliini nanoosakeste TEM-mikrofoto.
On hästi teada, et kitosaan on nõrk polüelektrolüüt, mille pKa on 6,5. Happelises keskkonnas on see positiivselt laetud, kuna selle peamine aminorühm on protoneeritud vesinikioonidega15. Seetõttu kasutatakse seda sageli kandjana negatiivselt laetud makromolekulide kapseldamiseks. Selles uuringus kasutati kitosaani insuliini kapseldamiseks, mille isoelektriline punkt on 5,3. Kuna kitosaani kasutatakse kattematerjalina, suureneb selle osakaalu suurenemisega vastavalt nanoosakeste väliskihi paksus, mille tulemuseks on suurem keskmine osakeste suurus. Lisaks suudab suurem kitosaani tase kapseldada rohkem insuliini. Meie puhul oli EE kõrgeim, kui kitosaani ja insuliini suhe ulatus 2,5:1-ni, ning EE-s ei täheldatud olulist muutust, kui suhe pidevalt suurenes.
Lisaks kitosaani ja insuliini suhtele mängis NP-de valmistamisel olulist rolli ka pH. Gan jt. 17 uurisid pH mõju kitosaani nanoosakeste osakeste suurusele. Nad leidsid osakeste suuruse pideva vähenemise kuni pH saavutas 6,0 ja pH > 6,0 juures täheldati osakeste suuruse olulist suurenemist, mis on kooskõlas meie tähelepanekutega. See nähtus tuleneb asjaolust, et pH tõustes omandab insuliini molekul negatiivse pinnalaengu, soodustades seega elektrostaatilisi interaktsioone kitosaani/naatriumtripolüfosfaadi (TPP) kompleksiga, mille tulemuseks on väike osakeste suurus ja kõrge EE. Kui aga pH reguleeriti väärtusele 6,5, deprotoneerusid kitosaani aminorühmad, mille tulemuseks oli kitosaani voltimine. Seega põhjustab kõrge pH aminoioonide väiksemat kokkupuudet TPP ja insuliiniga, mille tulemuseks on väiksem ristseostumine, suurem lõplik keskmine osakeste suurus ja madalam EE.
Külmkuivatatud ja pihustuskuivatatud NP-de morfoloogiliste omaduste analüüs aitab valida paremaid dehüdratsiooni- ja pulbri moodustamise tehnikaid. Eelistatud meetod peaks tagama ravimi stabiilsuse, ühtlase osakeste kuju, suure ravimisisalduse ja hea lahustuvuse alglahuses. Kahe tehnika paremaks võrdlemiseks kasutati selles uuringus dehüdratsiooni ajal insuliini NP-sid 1% mannitooliga või ilma. Mannitooli kasutatakse täiteainena või krüoprotektandina erinevates külmkuivatamise ja pihustuskuivatamise kuivpulbri formulatsioonides. Nagu on näidatud joonisel 2a, täheldati skaneeriva elektronmikroskoopia (SEM) abil väga poorset pulbristruktuuri suurte, ebakorrapäraste ja karedate pindadega. Pärast dehüdratsiooni tuvastati pulbris vähe eraldi osakesi (joonis 2e). Need tulemused näitasid, et enamik NP-sid lagunes külmkuivatamise ajal ilma krüoprotektandita. 1% mannitooli sisaldavate külmkuivatatud ja pihustuskuivatatud insuliini nanoosakeste puhul täheldati siledate pindadega sfäärilisi nanoosakesi (joonis 2b, d, f, h). Ilma mannitoolita pihustuskuivatatud insuliini nanoosakesed jäid sfäärilisteks, kuid pinnalt kortsus. (Joonis 2c). Sfäärilisi ja kortsus pindu käsitletakse lähemalt allpool vabanemiskäitumise ja rakkude omastamise testides. Kuivatatud NP-de nähtava välimuse põhjal andsid nii mannitoolita pihustuskuivatatud NP-d kui ka mannitooliga külmkuivatatud ja pihustuskuivatatud NP-d peeneid NP-pulbreid (joonis 2f, g, h). Mida suurem on osakeste pindade vaheline pindala, seda suurem on lahustuvus ja seega ka vabanemiskiirus.
Erinevate dehüdreeritud insuliini NP-de morfoloogia: (a) lüofiliseeritud insuliini NP-de SEM-pilt ilma mannitoolita; (b) lüofiliseeritud insuliini NP-de SEM-pilt mannitooliga; (c) pihustuskuivatatud insuliini NP-d ilma mannitoolita; (d) pihustuskuivatatud insuliini NP-de SEM-pilt mannitooliga; (e) lüofiliseeritud insuliini NP-de pulbri pilt ilma mannitoolita; (f) lüofiliseeritud insuliini NP-de pilt mannitooliga; (g) pihustuskuivatatud insuliini NP-de pulbri pilt ilma mannitoolita; (h) pihustuskuivatatud insuliini NP-de pulbri pilt mannitooliga.
Külmkuivatamise ajal toimib mannitool krüoprotektandina, hoides NP-sid amorfses vormis ja hoides ära jääkristallide tekitatud kahjustusi19. Seevastu pihustuskuivatamise ajal külmutamisetappi ei toimu. Seetõttu pole mannitool selles meetodis vajalik. Tegelikult andsid mannitoolita pihustuskuivatatud NP-d peenemaid NP-sid, nagu eelnevalt kirjeldatud. Mannitool võib pihustuskuivatamise protsessis siiski täiteainena toimida, andes NP-dele sfäärilisema struktuuri20 (joonis 2d), mis aitab saavutada selliste kapseldatud NP-de ühtlast vabanemiskäitumist. Lisaks on selge, et nii külmkuivatatud kui ka pihustuskuivatatud mannitooli sisaldavates insuliini NP-des (joonis 2b, d) võib tuvastada mõningaid suuri osakesi, mis võib olla tingitud mannitooli kogunemisest osakeste südamikku koos kapseldatud insuliiniga. Kitosaani kiht. Tasub märkida, et selles uuringus hoiti mannitooli ja kitosaani suhet 5:1 juures, et tagada sfäärilise struktuuri säilimine pärast dehüdratsiooni, nii et suur kogus täiteainet saab samuti suurendada kuivatatud NP-de osakeste suurust.
Fourier' teisendusega infrapuna nõrgestatud täieliku peegelduse (FTIR-ATR) spektroskoopia iseloomustas vaba insuliini, kitosaani, kitosaani, TPP ja insuliini füüsikalist segu. Kõiki dehüdreeritud NP-sid iseloomustati FTIR-ATR spektroskoopia abil. Kapseldatud NP-des, mis olid külmkuivatatud mannitooliga, ja pihustuskuivatatud NP-des, mis olid nii mannitooliga kui ka ilma, täheldati intensiivsusi 1641, 1543 ja 1412 cm-1 (joonis 3). Nagu varem teatatud, olid need tugevuse suurenemised seotud kitosaani, TPP ja insuliini vahelise ristseostumisega. Kitosaani ja insuliini interaktsiooni uurimine näitas, et insuliiniga laetud kitosaani nanoosakeste FTIR spektrites kattus kitosaani riba insuliini omaga, suurendades karbonüüli intensiivsuse (1641 cm-1) ja amiini intensiivsuse (1543 cm-1) riba. TPP tripolüfosfaatrühmad on seotud kitosaani ammooniumrühmadega, moodustades riba lainepikkusel 1412 cm-1.
Vaba insuliini, kitosaani, kitosaani/TPP/insuliini füüsikaliste segude ja erinevate meetoditega dehüdreeritud NP-de FTIR-ATR spektrid.
Lisaks on need tulemused kooskõlas SEM-il näidatutega, mis näitasid, et kapseldatud NP-d jäid terveks nii mannitooliga pihustamisel kui ka külmkuivatamisel, kuid mannitooli puudumisel saadi kapseldatud osakesi ainult pihustuskuivatamisel. Seevastu mannitoolita külmkuivatatud NP-de FTIR-ATR spektraaltulemused olid väga sarnased kitosaani, TPP ja insuliini füüsikalise segu omadega. See tulemus näitab, et kitosaani, TPP ja insuliini vahelisi ristsidemeid mannitoolita külmkuivatatud NP-des enam ei esine. NP-de struktuur hävis külmkuivatamise ajal ilma krüoprotektandita, mida on näha SEM-tulemustes (joonis 2a). Dehüdreeritud insuliini NP-de morfoloogia ja FTIR-tulemuste põhjal kasutati rekonstitutsioonikatsetes ainult lüofiliseeritud, pihustuskuivatatud ja mannitoolivabu NP-sid ning mannitoolivabu NP-sid, kuna mannitoolivabad NP-d lagunesid dehüdratsiooni ajal. Arutage.
Dehüdratsiooni kasutatakse pikaajaliseks säilitamiseks ja ümbertöötlemiseks teisteks ravimvormideks. Kuivatatud NP-de võime pärast säilitamist taastuda on kriitilise tähtsusega nende kasutamiseks erinevates ravimvormides, näiteks tablettides ja kiledes. Märkasime, et pihustuskuivatatud insuliini NP-de keskmine osakeste suurus mannitoolita suurenes pärast taastamist vaid veidi. Seevastu mannitooliga pihustuskuivatatud ja külmkuivatatud insuliini nanoosakeste osakeste suurus suurenes märkimisväärselt (tabel 1). PDI ja EE ei muutunud pärast kõigi NP-de rekombinatsiooni selles uuringus oluliselt (tabel 1). See tulemus näitab, et enamik osakesi jäi pärast uuesti lahustumist terveks. Mannitooli lisamine vähendas aga lüofiliseeritud ja pihustuskuivatatud mannitooli nanoosakeste insuliinisisaldust oluliselt (tabel 1). Seevastu mannitoolita pihustuskuivatatud NP-de insuliinisisaldus jäi samaks kui varem (tabel 1).
On hästi teada, et nanoosakeste sisaldus on ravimite manustamisel kriitilise tähtsusega. Madala sisaldusega NP-de puhul on terapeutilise läve saavutamiseks vaja väga suuri materjalikoguseid. Selliste kõrgete NP-kontsentratsioonide kõrge viskoossus põhjustab aga ebamugavusi ja raskusi vastavalt suukaudsel manustamisel ja süstitavate ravimvormide puhul 22. Lisaks saab insuliini NP-sid kasutada ka tablettide ja viskoossete biokilede valmistamiseks 23, 24, mis nõuab suures koguses NP-de kasutamist madala sisalduse juures, mille tulemuseks on suured tabletid ja paksud biokiled, mis ei sobi suukaudseks manustamiseks. Seetõttu on suure insuliinisisaldusega dehüdreeritud NP-d väga soovitavad. Meie tulemused näitavad, et mannitoolivabade pihustuskuivatatud NP-de kõrge insuliinisisaldus võib pakkuda nende alternatiivsete manustamismeetodite jaoks palju atraktiivseid eeliseid.
Kõiki dehüdreeritud NP-sid hoiti külmkapis kolm kuud. SEM-i tulemused näitasid, et kõigi dehüdreeritud NP-de morfoloogia ei muutunud kolmekuulise säilitamise jooksul oluliselt (joonis 4). Pärast vees lahustamist näitasid kõik NP-d EE-s veidi langust ja vabastasid kolmekuulise säilitusperioodi jooksul ligikaudu väikese koguse (~5%) insuliini (tabel 2). Kõigi nanoosakeste keskmine osakeste suurus aga suurenes. Ilma mannitoolita pihustuskuivatatud NP-de osakeste suurus suurenes 525 nm-ni, samas kui mannitooliga pihustuskuivatatud ja külmkuivatatud NP-de osakeste suurus suurenes vastavalt 872 ja 921 nm-ni (tabel 2).
Kolm kuud säilitatud erinevate dehüdreeritud insuliini NP-de morfoloogia: (a) mannitooliga lüofiliseeritud insuliini NP-de SEM-pilt; (b) mannitoolita pihustuskuivatatud insuliini nanoosakeste SEM-pilt; (c) mannitoolita pihustuskuivatatud insuliini NP-de SEM-pildid.
Lisaks täheldati mannitooliga pihustuskuivatatud ja külmkuivatatud rekonstitueeritud insuliini nanoosakestes sadet (joonis S2). Selle põhjuseks võivad olla suured osakesed, mis ei ole vees korralikult suspendeerunud. Kõik ülaltoodud tulemused näitavad, et pihustuskuivatamise tehnika suudab kaitsta insuliini nanoosakesi dehüdratsiooni eest ja et insuliini nanoosakeste suuri koguseid saab saada ilma täiteainete või krüoprotektantideta.
Insuliini retentsiooni testiti pH = 2,5 keskkonnas pepsiini, trüpsiini ja α-kümotrüpsiiniga, et näidata NP-de kaitsvat võimet ensümaatilise seedimise eest pärast dehüdratsiooni. Dehüdreeritud NP-de insuliini retentsiooni võrreldi värskelt valmistatud NP-de omaga ja negatiivse kontrollina kasutati vaba insuliini. Selles uuringus näitas vaba insuliin kiiret insuliini eliminatsiooni 4 tunni jooksul kõigis kolmes ensümaatilises töötluses (joonis 5a–c). Seevastu mannitooliga külmkuivatatud NP-de ja mannitooliga või ilma pihustuskuivatatud NP-de insuliini eliminatsiooni testimine näitas nende NP-de oluliselt suuremat kaitset ensümaatilise seedimise eest, mis oli sarnane värskelt valmistatud insuliini NP-de omaga (joonis 1). 5a–c). Pepsiini, trüpsiini ja α-kümotrüpsiini nanoosakeste abil oli 4 tunni jooksul kaitstud vastavalt üle 50%, 60% ja 75% insuliinist (joonis 5a–c). See insuliini kaitsev võime võib suurendada insuliini suurema imendumise võimalust vereringesse.25 Need tulemused viitavad sellele, et pihustuskuivatamine mannitoolita või ilma ja külmkuivatamine mannitooliga võib säilitada NP-de insuliinikaitsevõime pärast dehüdratsiooni.
Dehüdreeritud insuliini NP-de kaitse ja vabanemise käitumine: (a) insuliini kaitsmine pepsiinilahuses; (b) insuliini kaitsmine trüpsiinilahuses; (c) insuliini kaitsmine α-kümotrüpsiini lahusega; (d) dehüdreeritud NP-de vabanemise käitumine pH = 2,5 lahuses; (e) dehüdreeritud NP-de vabanemise käitumine pH = 6,6 lahuses; (f) dehüdreeritud NP-de vabanemise käitumine pH = 7,0 lahuses.
Värskelt valmistatud ja lahustatud kuivinsuliini NP-sid inkubeeriti erinevates puhvrites (pH = 2,5, 6,6, 7,0) temperatuuril 37 °C, simuleerides mao, kaksteistsõrmiksoole ja peensoole ülemise osa pH-keskkonda, et uurida insuliini mõju insuliiniresistentsusele. Vabanemiskäitumine erinevates keskkondades. Seedetrakti fragment. pH = 2,5 juures näitasid insuliiniga laetud NP-d ja resolubiliseeritud kuivinsuliini NP-d esialgset plahvatuslikku vabanemist esimese tunni jooksul, millele järgnes aeglane vabanemine järgmise 5 tunni jooksul (joonis 5d). See kiire vabanemine alguses on tõenäoliselt tingitud valgumolekulide kiirest pinna desorptsioonist, mis ei ole osakese sisestruktuuris täielikult immobiliseeritud. pH = 6,5 juures näitasid insuliiniga laetud NP-d ja rekonstitueeritud kuivinsuliini NP-d sujuvat ja aeglast vabanemist 6 tunni jooksul, kuna testlahuse pH oli sarnane NP-dega valmistatud lahuse pH-ga (joonis 5e). pH = 7 juures olid NP-d ebastabiilsed ja lagunesid peaaegu täielikult esimese kahe tunni jooksul (joonis 5f). See on tingitud sellest, et kitosaani deprotoneerimine toimub kõrgema pH juures, mille tulemuseks on vähem kompaktne polümeervõrgustik ja laetud insuliini vabanemine.
Lisaks näitasid mannitoolita pihustuskuivatatud insuliini NP-d kiiremat vabanemisprofiili kui teised dehüdreeritud NP-d (joonis 5d–f). Nagu eelnevalt kirjeldatud, näitasid mannitoolita kuivatatud taastatud insuliini NP-d väikseimat osakeste suurust. Väikesed osakesed pakuvad suuremat pindala, seega asub suurem osa asjakohasest ravimist osakeste pinnal või selle lähedal, mille tulemuseks on kiire ravimi vabanemine26.
NP-de tsütotoksilisust uuriti MTT testiga. Nagu joonisel S4 näidatud, ei leitud, et kõigil dehüdreeritud NP-del oleks kontsentratsioonidel 50–500 μg/ml olulist mõju rakkude eluvõimele, mis viitab sellele, et kõiki dehüdreeritud NP-sid saab terapeutilise akna saavutamiseks ohutult kasutada.
Maks on peamine organ, mille kaudu insuliin oma füsioloogilisi funktsioone täidab. HepG2 rakud on inimese hepatoomirakkude liin, mida tavaliselt kasutatakse hepatotsüütide in vitro omastamismudelina. Siin kasutati HepG2 rakke külmkuivatamise ja pihustuskuivatamise meetodite abil dehüdreeritud NP-de rakulise omastamise hindamiseks. Rakkude omastamist hinnati konfokaalse laserskaneerimise abil, kasutades voolutsütomeetriat ja nägemist, pärast mitmetunnist inkubeerimist vaba FITC insuliiniga kontsentratsioonil 25 μg/ml, värskelt valmistatud FITC insuliiniga laetud NP-dega ja dehüdreeritud FITC insuliiniga laetud NP-dega võrdse insuliinikontsentratsiooniga. Viidi läbi kvantitatiivsed mikroskoopilised (CLSM) vaatlused. Mannitoolita lüofiliseeritud NP-d hävisid dehüdratsiooni ajal ja neid selles testis ei hinnatud. Värskelt valmistatud insuliiniga laetud NP-de, mannitooliga lüofiliseeritud NP-de ja mannitooliga ja ilma pihustuskuivatatud NP-de (joonis 6a) rakusisese fluorestsentsi intensiivsus oli vastavalt 4,3, 2,6, 2,4 ja 4,1 korda suurem kui vabadel NP-del. FITC-insuliini rühmas (joonis 6b). Need Tulemused näitavad, et kapseldatud insuliin omastab raku paremini kui vaba insuliin, peamiselt uuringus toodetud insuliiniga laetud nanoosakeste väiksema suuruse tõttu.
HepG2 rakkude omastamine pärast 4-tunnist inkubeerimist värskelt valmistatud ja dehüdreeritud NP-dega: (a) FITC-insuliini omastamise jaotus HepG2 rakkude poolt. (b) Fluorestsentsi intensiivsuste geomeetriline keskmine, mida analüüsiti voolutsütomeetria abil (n = 3), *P < 0,05 võrreldes vaba insuliiniga.
Samamoodi näitasid CLSM-pildid, et värskelt valmistatud FITC-insuliiniga laetud NP-de ja FITC-insuliiniga laetud pihustuskuivatatud NP-de (ilma mannitoolita) FITC fluorestsentsi intensiivsused olid palju tugevamad kui teistel proovidel (joonis 6a). Lisaks suurendas mannitooli lisamisega lahuse kõrgem viskoossus resistentsust rakkude omastamise suhtes, mille tulemuseks oli insuliini proliferatsiooni vähenemine. Need tulemused viitavad sellele, et mannitoolivabad pihustuskuivatatud NP-d näitasid suurimat rakkude omastamise efektiivsust, kuna nende osakeste suurus oli pärast uuesti lahustamist väiksem kui külmkuivatatud NP-del.
Kitosaan (keskmine molekulmass 100 kDa, 75–85% deatsetüülitud) osteti firmalt Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanada). Naatriumtripolüfosfaat (TPP) osteti firmalt VWR (Radnor, Pennsylvania, USA). Selles uuringus kasutatud rekombinantne iniminsuliin pärines firmalt Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Fluorestseiinisotiotsüanaadiga (FITC) märgistatud iniminsuliin ja 4',6-diamidino-2-fenüülindooldihüdrokloriid (DAPI) osteti firmalt Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanada). HepG2 rakuliin saadi firmalt ATCC (Manassas, Virginia, USA). Kõik muud reagendid olid analüütilise või kromatograafilise puhtusega.
Valmistage 1 mg/ml CS-lahus, lahustades selle kahekordselt destilleeritud vees (DD-vesi), mis sisaldab 0,1% äädikhapet. Valmistage 1 mg/ml TPP ja insuliini lahused, lahustades need vastavalt DD-vees ja 0,1% äädikhappes. Eelemulsioon valmistati polytron PCU-2-110 kiire homogenisaatoriga (Brinkmann Ind. Westbury, NY, USA). Valmistamisprotsess on järgmine: esiteks lisatakse 4 ml insuliinilahusele 2 ml TPP lahust ja segu segatakse 30 minutit, kuni see on täielikult läbi segatud. Seejärel lisati segatud lahus tilkhaaval süstla kaudu CS-lahusele kiirel segamisel (10 000 p/min). Segusid hoiti 30 minutit jäävannis kiirel segamisel (15 000 p/min) ja nende pH viidi teatud väärtuseni, et saada ristseotud insuliini NP-sid. Insuliini NP-de edasiseks homogeniseerimiseks ja osakeste suuruse vähendamiseks sonikeeriti neid veel 30 minutit... jäävann sonditüüpi sonikaatori abil (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Saksamaa).
Insuliini NPS-e testiti Z-keskmise läbimõõdu, polüdisperssuse indeksi (PDI) ja dzeeta potentsiaali suhtes, kasutades dünaamilise valguse hajumise (DLS) mõõtmisi Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Austria) abil, lahjendades neid DD-vees temperatuuril 25 °C. Morfoloogiat ja suurusjaotust iseloomustati Hitachi H7600 transmissioon-elektronmikroskoobiga (TEM) (Hitachi, Tokyo, Jaapan) ja pilte analüüsiti seejärel Hitachi pildindustarkvara abil (Hitachi, Tokyo, Jaapan). Insuliini NP-de kapseldamise efektiivsuse (EE) ja laadimisvõime (LC) hindamiseks pipeteeriti NP-d ultrafiltratsioonitorudesse molekulmassi piirväärtusega 100 kDa ja tsentrifuugiti kiirusel 500 x g 30 minutit. Filtraadis sisalduvat kapseldamata insuliini kvantifitseeriti Agilent 1100 seeria HPLC süsteemiga (Agilent, Santa Clara, California, USA), mis koosnes kvaternaarsest pumbast, automaatsest proovivõtjast, kolonniküttekehast ja DAD-detektorist. Insuliini analüüsiti C18 kolonniga. (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, USA) ja detekteeriti lainepikkusel 214 nm. Liikuv faas oli atsetonitriil ja vesi, mis sisaldasid 0,1% TFA-d, gradiendi suhted 10/90 kuni 100/0 ja töötlusaeg 10 minutit. Liikuv faas pumbati voolukiirusega 1,0 ml/min. Kolonni temperatuur seati 20 °C-le. Arvutage EE ja LC protsendid, kasutades võrrandeid (1) ja (2).
Insuliini NP optimeerimiseks testiti erinevaid CS/insuliini suhteid vahemikus 2,0 kuni 4,0. Valmistamise ajal lisati erinevaid CS lahuse koguseid, samal ajal kui insuliini/TPP segu hoiti konstantsena. Insuliini NP-d valmistati pH vahemikus 4,0 kuni 6,5, kontrollides hoolikalt segu pH-d pärast kõigi lahuste (insuliin, TPP ja CS) lisamist. Insuliini nanoosakeste EE-d ja osakeste suurust hinnati erinevate pH väärtuste ja CS/insuliini massi suhete juures, et optimeerida insuliini NP-de moodustumist.
Optimeeritud insuliini NP-d asetati alumiiniummahutile ja kaeti salvrätikuga, mis pingutati teibiga. Seejärel asetati keeratud mahutid kandikkuivatiga varustatud Labconco FreeZone külmkuivatisse (Labconco, Kansas City, MO, USA). Kuivade insuliini NP-de saamiseks seati temperatuur ja vaakumrõhk esimese 2 tunni jooksul -10 °C ja 0,350 torri juurde ning ülejäänud 22 tunni jooksul 24 tunnist 0 °C ja 0,120 torri juurde.
Kapseldatud insuliini tootmiseks kasutati Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Flawil, Šveits). Valitud kuivatusparameetrid olid: temperatuur 100 °C, toitevool 3 l/min ja gaasivool 4 l/min.
Insuliini nanoosakesi enne ja pärast dehüdratsiooni iseloomustati FTIR-ATR spektroskoopia abil. Dehüdreeritud nanoosakesi, samuti vaba insuliini ja kitosaani analüüsiti Spectrum 100 FTIR spektrofotomeetriga (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA), mis oli varustatud universaalse ATR proovivõtuseadmega (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA). Signaalide keskmised saadi 16 skaneeringust resolutsiooniga 4 cm2 sagedusvahemikus 4000–600 cm2.
Kuivinsuliini nanoosakeste morfoloogiat hinnati külmkuivatatud ja pihustuskuivatatud insuliini nanoosakeste SEM-kujutiste abil, mis jäädvustati Helios NanoLab 650 fokuseeritud ioonkiire skaneeriva elektronmikroskoobiga (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, USA). Peamine kasutatud parameeter oli pinge 5 keV ja voolutugevus 30 mA.
Kõik dehüdreeritud insuliini NP-d lahustati uuesti dd vees. Osakeste suurust, PDI-d, EE-d ja LC-d testiti uuesti sama meetodi abil, mida varem mainiti, et hinnata nende kvaliteeti pärast dehüdreerimist. Anhüdroinsuliini NP-de stabiilsust mõõdeti ka NP-de omaduste testimise teel pärast pikaajalist säilitamist. Selles uuringus hoiti kõiki dehüdreeritud NP-sid külmkapis kolm kuud. Pärast kolmekuulist säilitamist testiti NP-sid morfoloogilise osakeste suuruse, PDI, EE ja LC suhtes.
Insuliini efektiivsuse hindamiseks NP-de kaitsmisel pärast dehüdratsiooni lahustati 5 ml lahustatud NP-sid 45 ml simuleeritud maomahlas (pH 1,2, mis sisaldab 1% pepsiini), soolemahlas (pH 6,8, mis sisaldab 1% trüpsiini) või kümotrüpsiini lahuses (100 µg/ml, fosfaatpuhvris, pH 7,8). Neid inkubeeriti temperatuuril 37 °C segamiskiirusel 100 p/min. Erinevatel ajahetkedel koguti 500 μl lahust ja insuliini kontsentratsioon määrati HPLC abil.
Värskelt valmistatud ja dehüdreeritud insuliini NP-de in vitro vabanemiskäitumist testiti dialüüsikoti meetodil (molekulaarmassi piirväärtus 100 kDa, Spectra Por Inc.). Värskelt valmistatud ja taastatud kuivi NP-sid dialüüsiti vedelikes pH väärtustel 2,5, 6,6 ja 7,0 (0,1 M fosfaatpuhverdatud soolalahus, PBS), et simuleerida vastavalt mao, kaksteistsõrmiksoole ja peensoole ülaosa pH-keskkonda. Kõiki proove inkubeeriti temperatuuril 37 °C pideva loksutamisega kiirusel 200 p/min. Aspireeriti vedelik 5 ml dialüüsikotist järgmistel aegadel: 0,5, 1, 2, 3, 4 ja 6 tundi ning koheselt täiendati mahtu värske dialüsaadiga. Vedeliku insuliini saastumist analüüsiti HPLC abil ja insuliini vabanemise kiirus nanoosakestest arvutati vabanenud vaba insuliini ja nanoosakestesse kapseldatud insuliini koguhulga suhtest (võrrand 3).
Inimese hepatotsellulaarse kartsinoomi rakuliin HepG2 rakke kasvatati 60 mm läbimõõduga tassides, kasutades Dulbecco modifitseeritud Eagle'i keskkonda (DMEM), mis sisaldas 10% veiseloote seerumit, 100 RÜ/ml penitsilliini ja 100 μg/ml streptomütsiini29. Kultuure hoiti temperatuuril 37 °C, 95% suhtelise õhuniiskuse ja 5% CO2 juures. Omastamiskatsete jaoks külvati HepG2 rakud tihedusega 1 × 105 rakku/ml 8-süvendilisele Nunc Lab-Tek kamberslaidisüsteemile (Thermo Fisher, NY, USA). Tsütotoksilisuse testide jaoks külvati need 96-süvendilistesse plaatidesse (Corning, NY, USA) tihedusega 5 × 104 rakku/ml.
MTT testi kasutati värskelt valmistatud ja dehüdreeritud insuliini NP-de tsütotoksilisuse hindamiseks30. HepG2 rakud külvati 96-süvendilistele plaatidele tihedusega 5 × 104 rakku/ml ja kultiveeriti enne testimist 7 päeva. Insuliini NP-d lahjendati kultuurikeskkonnas erinevate kontsentratsioonideni (50 kuni 500 μg/ml) ja seejärel manustati rakkudele. Pärast 24-tunnist inkubeerimist pesti rakke 3 korda PBS-iga ja inkubeeriti veel 4 tundi söötmes, mis sisaldas 0,5 mg/ml MTT-d. Tsütotoksilisust hinnati, mõõtes kollase tetrasoolium-MTT ensümaatilist redutseerimist lillaks formazaaniks lainepikkusel 570 nm, kasutades Tecan infinite M200 pro spektrofotomeetri plaadilugejat (Tecan, Männedorf, Šveits).
NP-de rakulise omastamise efektiivsust testiti konfokaalse laserskaneeriva mikroskoopia ja voolutsütomeetria analüüsi abil. Iga Nunc Lab-Tek kamberslaidisüsteemi süvendit töödeldi vaba FITC-insuliiniga, FITC-insuliiniga laetud NP-dega ja lahustati 25 μg/ml dehüdreeritud FITC-insuliini NP-dega samas kontsentratsioonis ning inkubeeriti 4 tundi. Rakke pesti 3 korda PBS-iga ja fikseeriti 4% paraformaldehüüdiga. Tuumad värviti 4',6-diamidino-2-fenüülindooliga (DAPI). Insuliini lokaliseerimist jälgiti Olympus FV1000 laserskaneeriva/kahe footoni konfokaalse mikroskoobi abil (Olympus, Shinjuku City, Tokyo, Jaapan). Voolutsütomeetria analüüsi jaoks lisati HepG2 rakkudega külvatud 96-süvendilistele plaatidele sama kontsentratsiooniga 10 μg/ml vaba FITC-insuliini, FITC-insuliiniga laetud NP-sid ja relahustunud dehüdreeritud FITC-insuliini NP-sid ning inkubeeriti 4 tundi. Pärast 4 tundi... Inkubatsiooni käigus rakud eemaldati ja pesti 3 korda FBS-iga. 5 × 104 rakku proovi kohta analüüsiti BD LSR II voolutsütomeetriga (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Ameerika Ühendriigid).
Kõik väärtused on väljendatud keskmisena ± standardhälve. Kõigi rühmade võrdlusi hinnati ühesuunalise ANOVA või t-testi abil, kasutades IBM SPSS Statistics 26 for Mac (IBM, Endicott, New York, USA), ja p < 0,05 loeti statistiliselt oluliseks.
See uuring demonstreerib pihustuskuivatamise paindlikkust ja võimet dehüdreerida ristseotud kitosaani/TPP/insuliini nanoosakesi parema taastamisega võrreldes standardsete külmkuivatamismeetoditega, kasutades täiteaineid või krüoprotektoreid, ning suurema kandevõimega. Optimeeritud insuliini nanoosakesed andsid keskmiseks osakeste suuruseks 318 nm ja kapseldamise efektiivsuseks 99,4%. SEM ja FTIR tulemused pärast dehüdreerimist näitasid, et sfääriline struktuur säilis ainult pihustuskuivatatud NP-des mannitooliga ja ilma ning mannitooliga lüofiliseeritud NP-des, kuid mannitoolita lüofiliseeritud NP-d lagunesid dehüdreerimise ajal. Taastamisvõime testis näitasid mannitoolita pihustuskuivatatud insuliini nanoosakesed väikseimat keskmist osakeste suurust ja suurimat laadimist pärast taastamist. Kõigi nende dehüdreeritud NP-de vabanemiskäitumine näitas, et need vabanesid kiiresti pH = 2,5 ja pH = 7 lahustes ning olid väga stabiilsed pH = 6,5 lahuses. Võrreldes teiste uuesti lahustatud dehüdreeritud NP-dega näitasid mannitoolita pihustuskuivatatud NP-d kiireimat vabanemist. See tulemus on kooskõlas rakulistes uuringutes täheldatuga. omastamistestis, kuna pihustuskuivatatud NP-d mannitooli puudumisel säilitasid peaaegu täielikult värskelt valmistatud NP-de rakulise omastamise efektiivsuse. Need tulemused viitavad sellele, et mannitoolivaba pihustuskuivatamise teel valmistatud kuivad insuliini nanoosakesed sobivad kõige paremini edasiseks töötlemiseks teisteks veevabadeks ravimvormideks, näiteks suukaudseteks tablettideks või bioadheesiivseteks kiledeks.
Intellektuaalomandi probleemide tõttu ei ole käesoleva uuringu käigus loodud ja/või analüüsitud andmekogumid avalikult kättesaadavad, kuid on mõistliku taotluse korral vastavatelt autoritelt kättesaadavad.
Kagan, A. 2. tüüpi diabeet: sotsiaalsed ja teaduslikud põhjused, meditsiinilised tüsistused ja mõju patsientidele ja teistele. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. ja Jiang, P. Insuliini kapseldamise väljatöötamine: kas suukaudne manustamine on nüüd võimalik? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. ja Dass, CR. Hiljutised edusammud suukaudsete insuliiniga laetud liposoomide manustamissüsteemides diabeedi raviks. Interpretation. J. Pharmacy.549, 201–217 (2018).