Täname teid Nature.com-i külastamise eest. Teie kasutataval brauseri versioonil on piiratud CSS-i tugi. Parima tulemuse saavutamiseks soovitame teil kasutada brauseri uuemat versiooni (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiimi). Seni aga kuvame saiti ilma stiili ja JavaScriptita, et tagada pidev tugi.
Propioonhapet (PPA) kasutatakse mitokondriaalse düsfunktsiooni rolli uurimiseks neuroloogilise arengu häirete, näiteks autismispektri häire korral. On teada, et PPA häirib mitokondriaalset biogeneesi, ainevahetust ja käivet. PPA mõju mitokondriaalsele dünaamikale, lõhustumisele ja fusioonile on aga problemaatiline nende mehhanismide keerulise ajalise olemuse tõttu. Käesolevas uuringus kasutame täiendavaid kvantitatiivseid pildistamistehnikaid, et uurida, kuidas PPA mõjutab mitokondriaalset ultrastruktuuri, morfoloogiat ja dünaamikat neuronitaolistes SH-SY5Y rakkudes. PPA (5 mM) põhjustas mitokondriaalse pindala (p < 0,01), Fereti läbimõõdu ja ümbermõõdu (p < 0,05) ning pindala 2 (p < 0,01) olulise vähenemise. Mitokondrite sündmuste lokaatori analüüs näitas lõhustumis- ja fusioonisündmuste olulist suurenemist (p < 0,05), säilitades seeläbi mitokondriaalse võrgustiku terviklikkuse stressitingimustes. Lisaks vähenes oluliselt cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) ja OPA1 (p < 0,05) mRNA ekspressioon. 01). See illustreerib mitokondrite morfoloogia, biogeneesi ja dünaamika ümberkujunemist funktsiooni säilitamiseks stressitingimustes. Meie andmed annavad uue ülevaate PPA mõjust mitokondrite dünaamikale ja rõhutavad kuvamistehnikate kasulikkust mitokondrite stressireaktsioonidega seotud keerukate regulatiivsete mehhanismide uurimisel.
Mitokondrid on lisaks oma tüüpilistele rollidele energia tootmises ja biosünteesis lahutamatud osalejad paljudes rakulistes funktsioonides. Mitokondrite metabolism on kaltsiumi signaaliülekande, metaboolse ja redokstasakaalu, põletikulise signaaliülekande, epigeneetiliste modifikatsioonide, rakkude proliferatsiooni, diferentseerumise ja programmeeritud rakusurma peamine regulaator1. Mitokondriaalne metabolism on eriti oluline neuronite arengu, ellujäämise ja funktsiooni jaoks ning on laialdaselt seotud neuropatoloogia mitmesuguste ilmingutega2,3,4.
Viimase kümnendi jooksul on metaboolne seisund kujunenud neurogeneesi, diferentseerumise, küpsemise ja plastilisuse keskseks regulaatoriks5,6. Hiljuti on mitokondrite morfoloogia ja dünaamika muutunud mitoosi eriti olulisteks komponentideks – dünaamiliseks protsessiks, mis säilitab rakkudes tervete mitokondrite hulga. Mitokondrite dünaamikat reguleerivad keerulised omavahel seotud rajad, alates mitokondrite biogeneesist ja bioenergeetikast kuni mitokondrite lõhustumise, fusiooni, transpordi ja kliirensini7,8. Nende integratiivsete mehhanismide häirimine kahjustab tervete mitokondriaalsete võrgustike säilimist ja avaldab sügavaid funktsionaalseid tagajärgi neuroloogilisele arengule9,10. Mitokondriaalse dünaamika düsregulatsiooni on täheldatud paljude psühhiaatriliste, neurodegeneratiivsete ja neuroloogilise arengu häirete, sealhulgas autismispektri häirete (ASH) korral11,12.
ASD on heterogeenne neuroarenguhäire, millel on keeruline geneetiline ja epigeneetiline arhitektuur. ASD pärilikkus on vaieldamatu, kuid selle aluseks olev molekulaarne etioloogia on endiselt halvasti mõistetav. Prekliinilistest mudelitest, kliinilistest uuringutest ja multioomilistest molekulaarsetest andmekogumitest kogunevad andmed annavad üha rohkem tõendeid mitokondriaalse düsfunktsiooni kohta ASD korral13,14. Varem viisime läbi genoomi hõlmava DNA metülatsiooni sõeluuringu ASD-ga patsientide kohordis ja tuvastasime mitokondriaalsete ainevahetusradade ääres rühmitatud diferentsiaalselt metüleeritud geene15. Seejärel teatasime mitokondriaalse biogeneesi ja dünaamika keskregulaatorite diferentsiaalsest metülatsioonist, mis oli seotud mtDNA koopiate arvu suurenemise ja muutunud uriini ainevahetusprofiiliga ASD korral16. Meie andmed annavad üha rohkem tõendeid selle kohta, et mitokondriaalne dünaamika ja homöostaas mängivad ASD patofüsioloogias keskset rolli. Seetõttu on mitokondriaalse dünaamika, morfoloogia ja funktsiooni vahelise seose mehhanistliku mõistmise parandamine käimasolevate uuringute peamine eesmärk neuroloogiliste haiguste, mida iseloomustab sekundaarne mitokondriaalne düsfunktsioon, uurimisel.
Molekulaarseid meetodeid kasutatakse sageli spetsiifiliste geenide rolli uurimiseks mitokondriaalsetes stressireaktsioonides. Seda lähenemisviisi võib aga piirata mitootilise kontrollmehhanismide mitmetahuline ja ajaline olemus. Lisaks on mitokondriaalsete geenide diferentsiaalne ekspressioon funktsionaalsete muutuste kaudne näitaja, eriti kuna tavaliselt analüüsitakse ainult piiratud arvu geene. Seetõttu on pakutud välja otsesemaid meetodeid mitokondriaalse funktsiooni ja bioenergeetika uurimiseks17. Mitokondrite morfoloogia on tihedalt seotud mitokondriaalse dünaamikaga. Mitokondrite kuju, ühenduvus ja struktuur on kriitilise tähtsusega energia tootmiseks ning mitokondrite ja rakkude ellujäämiseks5,18. Lisaks keskenduvad mitoosi erinevad komponendid mitokondriaalse morfoloogia muutustele, mis võivad olla kasulikud mitokondriaalse düsfunktsiooni tulemusnäitajad ja pakkuda alust järgnevatele mehhanistlikele uuringutele.
Mitokondrite morfoloogiat saab otseselt jälgida transmissioon-elektronmikroskoopia (TEM) abil, mis võimaldab raku ultrastruktuuri detailset uurimist. TEM visualiseerib otseselt mitokondrite kristade morfoloogiat, kuju ja struktuuri üksikute mitokondrite lahutusvõimel, selle asemel, et tugineda ainult geenide transkriptsioonile, valkude ekspressioonile või mitokondrite funktsionaalsetele parameetritele rakupopulatsioonides17,19,20. Lisaks hõlbustab TEM mitokondrite ja teiste organellide, näiteks endoplasmaatilise retiikulumi ja autofagosoomide vaheliste interaktsioonide uurimist, millel on mitokondrite funktsioonis ja homöostaasis võtmeroll21,22. Seega teeb see TEM-ist hea lähtepunkti mitokondriaalse düsfunktsiooni uurimiseks enne konkreetsetele radadele või geenidele keskendumist. Kuna mitokondrite funktsioon muutub neuropatoloogias üha olulisemaks, on selge vajadus uurida mitokondrite morfoloogiat ja dünaamikat otseselt ja kvantitatiivselt in vitro neuronaalsetes mudelites.
Selles artiklis uurime mitokondriaalset dünaamikat autismispektrihäire neuronaalses mitokondriaalse düsfunktsiooni mudelis. Varem oleme teatanud propionüül-CoA karboksülaasi beeta (PCCB) diferentsiaalsest metüleerimisest ASD15-s, mis on mitokondriaalse propionüül-CoA karboksülaasi ensüümi PCC allüksus. PCC düsregulatsioon teadaolevalt põhjustab propionüülderivaatide, sealhulgas propioonhappe (PPA) toksilist akumuleerumist23,24,25. On näidatud, et PPA häirib neuronaalset ainevahetust ja muudab käitumist in vivo ning on väljakujunenud loommudel ASD-ga seotud neuroloogilise arengu mehhanismide uurimiseks26,27,28. Lisaks on teatatud, et PPA häirib mitokondriaalse membraani potentsiaali, biogeneesi ja hingamist in vitro ning seda on laialdaselt kasutatud neuronite mitokondriaalse düsfunktsiooni modelleerimiseks29,30. PPA-indutseeritud mitokondriaalse düsfunktsiooni mõju mitokondriaalsele morfoloogiale ja dünaamikale on aga endiselt halvasti mõistetav.
See uuring kasutab täiendavaid pildistamistehnikaid, et kvantifitseerida PPA mõju mitokondrite morfoloogiale, dünaamikale ja funktsioonile SH-SY5Y rakkudes. Esmalt töötasime välja TEM-meetodi mitokondrite morfoloogia ja ultrastruktuuri muutuste visualiseerimiseks17,31,32. Arvestades mitokondrite dünaamilist olemust33, kasutasime ka mitokondrite sündmuste lokaliseerija (MEL) analüüsi, et kvantifitseerida muutusi lõhustumis- ja fusioonisündmuste tasakaalus, mitokondrite arvus ja mahus PPA stressi all. Lõpuks uurisime, kas mitokondrite morfoloogia ja dünaamika on seotud biogeneesi, lõhustumise ja fusiooniga seotud geenide ekspressiooni muutustega. Kokkuvõttes illustreerivad meie andmed mitokondrite dünaamikat reguleerivate mehhanismide keerukuse selgitamise väljakutset. Tõstame esile TEM-i kasulikkust mitokondrite morfoloogia uurimisel kui mõõdetava koonduva lõpp-punktina mitoosi puhul SH-SY5Y rakkudes. Lisaks rõhutame, et TEM-andmed pakuvad kõige rikkalikumat teavet kombineerituna pildistamistehnikatega, mis jäädvustavad ka dünaamilisi sündmusi vastusena metaboolsele stressile. Neuronaalsete rakkude mitoosi toetavate molekulaarsete regulatiivsete mehhanismide edasine iseloomustamine võib anda olulist teavet närvisüsteemi ja neurodegeneratiivsete haiguste mitokondriaalse komponendi kohta.
Mitokondriaalse stressi esilekutsumiseks töödeldi SH-SY5Y rakke PPA-ga, kasutades 3 mM ja 5 mM naatriumpropionaati (NaP). Enne TEM-i töödeldi proove krüogeenselt, kasutades kõrgsurve külmutamist ja külmutamist (joonis 1a). Töötasime välja automatiseeritud mitokondriaalse pildianalüüsi süsteemi, et mõõta mitokondriaalsete populatsioonide kaheksat morfoloogilist parameetrit kolmes bioloogilises replikaadis. Leidsime, et PPA-töötlus muutis oluliselt nelja parameetrit: pindala 2, pindala, perimeeter ja Fereti läbimõõt (joonis 1b–e). Pindala 2 vähenes oluliselt nii 3 mM kui ka 5 mM PPA-töötlusega (vastavalt p = 0,0183 ja p = 0,002) (joonis 1b), samas kui pindala (p = 0,003), perimeeter (p = 0,0106) ja Fereti läbimõõt vähenesid kõik oluliselt. 5 mM töötlusrühmas täheldati kontrollrühmaga võrreldes olulist vähenemist (p = 0,0172) (joonis 1c–e). Märkimisväärne pindala ja ümbermõõdu vähenemine näitas, et 5 mM PPA-ga töödeldud rakkudel olid väiksemad ja ümaramad mitokondrid ning need mitokondrid olid vähem piklikud kui kontrollrakkudel. See on kooskõlas ka Fereti läbimõõdu olulise vähenemisega, mis on sõltumatu parameeter, mis näitab osakeste servade vahelise suurima kauguse vähenemist. Täheldati muutusi ristike ultrastruktuuris: PPA stressi mõjul muutusid ristikesed vähem väljendunuks (joonis 1a, paneel B). Kuid mitte kõik pildid ei kajastanud ristike ultrastruktuuri selgelt, seega nende muutuste kvantitatiivset analüüsi ei teostatud. Need TEM-andmed võivad kajastada kolme võimalikku stsenaariumi: (1) PPA suurendab lõhustumist või pärsib sulandumist, põhjustades olemasolevate mitokondrite kahanemist; (2) suurenenud biogenees loob uusi, väiksemaid mitokondreid või (3) indutseerib mõlemat mehhanismi samaaegselt. Kuigi neid tingimusi ei saa TEM-iga eristada, näitavad olulised morfoloogilised muutused muutusi mitokondriaalses homöostaasis ja dünaamikas PPA stressi all. Seejärel uurisime täiendavaid parameetreid, et neid dünaamikaid ja nende aluseks olevaid võimalikke mehhanisme täpsemalt iseloomustada.
Propioonhape (PPA) muudab mitokondrite morfoloogiat. (a) Representatiivsed transmissioon-elektronmikroskoopia (TEM) pildid, mis näitavad, et mitokondrite suurus väheneb ja mitokondrid muutuvad väiksemaks ja ümaramaks PPA-töötluse suurenedes; vastavalt 0 mM (töötlemata), 3 mM ja 5 mM. Punased nooled näitavad mitokondreid. (b–e) 24 tundi PPA-ga töödeldud SH-SY5Y rakud valmistati ette TEM-iks ja tulemusi analüüsiti Fiji/ImageJ abil. Neli kaheksast parameetrist näitasid olulisi erinevusi kontrollrakkude (töötlemata, 0 mM PPA) ja töödeldud rakkude (3 mM ja 5 mM PPA) vahel. (b) Piirkond 2, (c) Pindala, (d) Perimeeter, (e) Fereti läbimõõt. Oluliste erinevuste määramiseks kasutati ühesuunalist dispersioonanalüüsi (kontroll vs. töötlus) ja Dunnetti mitmekordse võrdluse testi (p < 0,05). Andmepunktid esindavad iga üksiku raku keskmist mitokondriaalset väärtust ja vearibad esindavad keskmist ± SEM. Näidatud andmed esindavad n = 3, vähemalt 24 rakku korduse kohta; kokku analüüsiti 266 pilti; * tähistab p < 0,05, ** tähistab p < 0,01.
Mitokondriaalse dünaamika PPA-le reageerimise täpsemaks iseloomustamiseks värvisime mitokondreid tetrametüül-rodamiin etüülestriga (TMRE) ning kasutasime aeglustatud mikroskoopiat ja MEL-analüüsi, et lokaliseerida ja kvantifitseerida mitokondreid 24 tunni pärast 3 ja 5 mM PPA juures. Lõhustumis- ja fusioonisündmuste töötlemine. (Joonis 2a). Pärast MEL-analüüsi analüüsiti mitokondreid edasi, et kvantifitseerida mitokondriaalsete struktuuride arvu ja nende keskmist mahtu. Täheldasime väikest, kuid olulist lõhustumissündmuste arvu suurenemist 3 mM juures [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] võrreldes lõhustumise [5,6 ± 0,3 (p < 0,05)] ja fusiooni [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] ning fusiooni [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] (0,05)] <0,05)] sündmuste arvu suurenemisega 5 mM juures võrreldes kontrollrühmaga (joonis 3b). Mitokondrite arv suurenes oluliselt nii 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] kui ka 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] juures (joonis 3c), samas kui iga mitokondriaalse struktuuri keskmine maht jäi samaks (joonis 3c). 3d). Kokkuvõttes viitab see sellele, et mitokondriaalse dünaamika ümberkujunemine toimib kompenseeriva reaktsioonina, mis säilitab edukalt mitokondriaalse võrgustiku terviklikkuse. Lõhustumissündmuste arvu suurenemine 3 mM PPA juures viitab sellele, et mitokondrite arvu suurenemine on osaliselt tingitud mitokondriaalsest lõhustumisest, kuid arvestades, et keskmine mitokondriaalne maht jääb sisuliselt samaks, ei saa välistada biogeneesi kui täiendavat kompenseerivat reaktsiooni. Need andmed on aga kooskõlas TEM-i abil täheldatud väiksemate, ümarate mitokondriaalsete struktuuridega ja näitavad ka PPA poolt indutseeritud olulisi muutusi mitokondriaalses dünaamikas.
Propioonhape (PPA) kutsub esile dünaamilise mitokondriaalse ümberehituse, et säilitada võrgustiku terviklikkus. SH-SY5Y rakke kultiveeriti, töödeldi 24 tunni jooksul 3 ja 5 mM PPA-ga ning värviti TMRE ja Hoechst 33342-ga, millele järgnes MEL-analüüs. (a) Tüüpilised aeglustatud mikroskoopiapildid, mis kujutavad iga tingimuse jaoks värvilisi ja binaariseeritud maksimaalse intensiivsuse projektsioone ajahetkel 2 (t2). Igas binaarpildis näidatud valitud piirkonnad on võimendatud ja kuvatud 3D-s kolmel erineval ajaperioodil (t1-t3), et illustreerida dünaamikat aja jooksul; fusioonisündmused on esile tõstetud rohelisega; lõhustumissündmused on esile tõstetud rohelisega. Kuvatud punasega. (b) Dünaamiliste sündmuste keskmine arv tingimuse kohta. (c) Mitokondriaalsete struktuuride keskmine arv raku kohta. (d) Iga mitokondriaalse struktuuri keskmine maht (µm3) raku kohta. Näidatud andmed esindavad n = 15 rakku ravirühma kohta. Näidatud vearibad tähistavad keskmist ± SEM, skaalariba = 10 μm, * p < 0,05.
Propioonhape (PPA) põhjustab mitokondriaalse dünaamikaga seotud geenide transkriptsioonilist supressiooni. SH-SY5Y rakke töödeldi 24 tunni jooksul 3 ja 5 mM PPA-ga. Geenide suhteline kvantifitseerimine viidi läbi RT-qPCR abil ja normaliseeriti B2M suhtes. Mitokondrite biogeneesi geenid (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 ja (d) NFE2L2. Mitokondrite fusiooni- ja lõhustumisgeenid (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 ja (i) DRP1. Olulisi erinevusi (p < 0,05) testiti ühesuunalise ANOVA (kontroll vs. ravi) ja Dunnetti mitmekordse võrdluse testi abil: * tähistab p < 0,05, ** tähistab p < 0,01 ja **** tähistab p < 0,0001. Tulbad tähistavad keskmist ekspressiooni ± SEM. Näidatud andmed esindavad n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) ja n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) bioloogilisi replikaate.
TEM- ja MEL-analüüside andmed näitavad koos, et PPA muudab mitokondrite morfoloogiat ja dünaamikat. Need kuvamistehnikad ei anna aga ülevaadet nende protsesside aluseks olevatest mehhanismidest. Seetõttu uurisime PPA-ravile reageerides üheksa peamise mitokondrite dünaamika, biogeneesi ja mitoosi regulaatori mRNA ekspressiooni. Pärast 24-tunnist töötlemist 3 mM ja 5 mM PPA-ga kvantifitseerisime rakulise müeloomi onkogeeni (cMYC), tuuma hingamisfaktori (NRF1), mitokondriaalse transkriptsioonifaktori 1 (TFAM), NFE2-laadse transkriptsioonifaktori BZIP (NFE2L2), gastriinilaadse valgu 2 (STOML2), nägemisnärvi atroofia 1 (OPA1), mitofusiin 1 (MFN1), mitofusiin 2 (MFN2) ja dünamiiniga seotud valgu 1 (DRP1). Vaatlesime PPA-töötlust 3 mM (vastavalt p = 0,0053, p = 0,0415 ja p < 0,0001) ja 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001) kontsentratsioonidel. (Joonis 3a–c) mRNA ekspressiooni langus oli annusest sõltuv: cMYC, NRF1 ja TFAM ekspressioon vähenes vastavalt 5,7, 2,6 ja 1,9 korda 3 mM kontsentratsioonil ning 11,2, 3 ja 2,2 korda 5 mM kontsentratsioonil. Seevastu tsentraalne redoksbiogeneesi geen NFE2L2 ei muutunud ühegi PPA kontsentratsiooni korral, kuigi täheldati sarnast annusest sõltuvat ekspressiooni vähenemise trendi (joonis 3d).
Samuti uurisime lõhustumise ja fusiooni regulatsioonis osalevate klassikaliste geenide ekspressiooni. Arvatakse, et STOML2 osaleb fusioonis, mitofaagias ja biogeneesis ning selle ekspressioon vähenes oluliselt (p < 0,0001) 3 mM (2,4-kordne muutus) ja 5 mM (2,8-kordne muutus) PPA juures (joonis 1). Samamoodi vähenes OPA1 fusioongeeni ekspressioon 3 mM (1,6-kordne muutus) ja 5 mM (1,9-kordne muutus) PPA juures (vastavalt p = 0,006 ja p = 0,0024) (joonis 3f). Siiski ei leidnud me olulisi erinevusi fusioongeenide MFN1, MFN2 või lõhustumisgeeni DRP1 ekspressioonis 24-tunnise PPA stressi korral (joonis 3g–i). Lisaks leidsime, et nelja fusioon- ja lõhustumisvalgu (OPA1, MFN1, MFN2 ja DRP1) tasemed ei muutunud samades tingimustes (joonis 4a–d). Oluline on märkida, et need andmed peegeldavad ühte ajahetke ja ei pruugi kajastada valgu ekspressiooni või aktiivsuse taseme muutusi PPA stressi varajastes staadiumides. Siiski viitab cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 ja OPA1 ekspressiooni oluline vähenemine mitokondriaalse metabolismi, biogeneesi ja dünaamika olulisele transkriptsioonilisele düsregulatsioonile. Lisaks rõhutavad need andmed kuvamistehnikate kasulikkust mitokondriaalse funktsiooni lõppseisundi muutuste otseseks uurimiseks.
Fusiooni- ja lõhustumisfaktori valkude tasemed ei muutunud pärast propioonhappega (PPA) töötlemist. SH-SY5Y rakke töödeldi 3 ja 5 mM PPA-ga 24 tundi. Valgu tasemed kvantifitseeriti Western blot analüüsiga ja ekspressioonitasemed normaliseeriti koguvalgu suhtes. Näidatud on keskmine valgu ekspressioon ja siht- ja koguvalgu representatiivsed Western blotid. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Tulbad tähistavad keskmist ± SEM ja esitatud andmed esindavad n = 3 bioloogilist kordust. Mitmekordsed võrdlused (p < 0,05) viidi läbi, kasutades ühesuunalist dispersioonanalüüsi ja Dunnetti testi. Algne geel ja blot on näidatud joonisel S1.
Mitokondriaalne düsfunktsioon on seotud multisüsteemsete haigustega, alates ainevahetus-, südame-veresoonkonna- ja lihashaigustest kuni neuroloogiliste haigusteni1,10. Paljud neurodegeneratiivsed ja neurodegeneratiivsed haigused on seotud mitokondriaalse düsfunktsiooniga, mis rõhutab nende organellide olulisust kogu aju eluea jooksul. Nende haiguste hulka kuuluvad Parkinsoni tõbi, Alzheimeri tõbi ja autismispektri häire3,4,18. Siiski on juurdepääs ajukoele nende haiguste uurimiseks keeruline, eriti mehhanistlikul tasandil, mistõttu on rakulised mudelsüsteemid vajalikuks alternatiiviks. Selles uuringus kasutame rakulist mudelsüsteemi, mis kasutab PPA-töödeldud SH-SY5Y rakke, et kokku võtta neuronaalsete haiguste, eriti autismispektri häirete puhul täheldatud mitokondriaalne düsfunktsioon. Selle PPA mudeli kasutamine neuronite mitokondriaalse dünaamika uurimiseks võib anda ülevaate autismispektri häire etioloogiast.
Uurisime TEM-i kasutamise võimalust mitokondrite morfoloogia muutuste vaatlemiseks. Oluline on märkida, et TEM-i efektiivsuse maksimeerimiseks tuleb seda õigesti kasutada. Krüoproovide ettevalmistamine võimaldab neuronite struktuure paremini säilitada, fikseerides samaaegselt rakulisi komponente ja vähendades artefaktide teket34. Sellega kooskõlas täheldasime, et neuronitaolistel SH-SY5Y rakkudel olid terved rakuvälised organellid ja piklikud mitokondrid (joonis 1a). See rõhutab krüogeensete ettevalmistustehnikate kasulikkust mitokondrite morfoloogia uurimisel neuronaalsetes rakumudelites. Kuigi kvantitatiivsed mõõtmised on TEM-andmete objektiivse analüüsi jaoks kriitilise tähtsusega, puudub endiselt üksmeel selles, milliseid konkreetseid parameetreid tuleks mitokondrite morfoloogiliste muutuste kinnitamiseks mõõta. Tuginedes suurele hulgale uuringutele, mis on kvantitatiivselt uurinud mitokondrite morfoloogiat17,31,32, töötasime välja automatiseeritud mitokondrite pildianalüüsi torujuhtme, mis mõõdab kaheksat morfoloogilist parameetrit, nimelt: pindala, pindala2, kuvasuhe, perimeeter, ringikujulisus, aste, Feret'i läbimõõt ja ümarus.
Nende hulgas vähendas PPA oluliselt pindala 2, pindala, perimeetrit ja Fereti läbimõõtu (joonis 1b–e). See näitas, et mitokondrid muutusid väiksemaks ja ümaramaks, mis on kooskõlas varasemate uuringutega, mis näitasid mitokondrite pindala vähenemist pärast 72 tundi PPA30-indutseeritud mitokondriaalset stressi. Need morfoloogilised tunnused võivad viidata mitokondrite lõhustumisele, mis on vajalik protsess kahjustatud komponentide eraldamiseks mitokondriaalsest võrgustikust, et soodustada nende lagunemist mitofagia kaudu35,36,37. Teisest küljest võib mitokondrite keskmise suuruse vähenemine olla seotud suurenenud biogeneesiga, mille tulemuseks on väikeste nascentsete mitokondrite moodustumine. Suurenenud lõhustumine või biogenees kujutab endast kompenseerivat vastust mitoosi säilitamiseks mitokondriaalse stressi vastu. Siiski ei saa välistada mitokondrite kasvu vähenemist, fusioonihäireid või muid seisundeid.
Kuigi TEM-i abil loodud kõrge eraldusvõimega pildid võimaldavad määrata morfoloogilisi omadusi üksikute mitokondrite tasandil, annab see meetod kahemõõtmelisi hetktõmmiseid ühel ajahetkel. Metaboolsele stressile reageerivate dünaamiliste reaktsioonide uurimiseks värvisime mitokondreid TMRE-ga ja kasutasime aeglustatud mikroskoopiat koos MEL-analüüsiga, mis võimaldab mitokondriaalse võrgustiku muutuste suure läbilaskevõimega 3D-visualiseerimist ajas33,38. Täheldasime PPA stressi all mitokondriaalses dünaamikas peeneid, kuid olulisi muutusi (joonis 2). 3 mM juures suurenes lõhustumissündmuste arv märkimisväärselt, samas kui fusioonisündmused jäid samaks kui kontrollrühmas. 5 mM PPA juures täheldati nii lõhustumis- kui ka fusioonisündmuste arvu suurenemist, kuid need muutused olid ligikaudu proportsionaalsed, mis viitab sellele, et lõhustumis- ja fusioonikineetika saavutab tasakaalu kõrgemate kontsentratsioonide juures (joonis 2b). Keskmine mitokondriaalne maht jäi nii 3 kui ka 5 mM PPA juures muutumatuks, mis näitab, et mitokondriaalse võrgustiku terviklikkus säilis (joonis 2d). See peegeldab dünaamiliste mitokondriaalsete võrgustike võimet reageerida kergele metaboolsele stressile, et säilitada tõhusalt homöostaasi ilma võrgustiku killustumist põhjustamata. 3 mM PPA juures on lõhustumise suurenemine piisav uue tasakaalu saavutamiseks, kuid PPA kõrgemate kontsentratsioonide poolt esile kutsutud stressile reageerimiseks on vaja sügavamat kineetilist ümberehitust.
Mitokondrite arv suurenes mõlema PPA stressi kontsentratsiooni juures, kuid keskmine mitokondriaalne maht ei muutunud oluliselt (joonis 2c). See võib olla tingitud suurenenud biogeneesist või suurenenud jagunemisest; aga kui mitokondriaalse keskmise mahu olulist vähenemist ei toimu, on tõenäolisem, et biosüntees suureneb. Joonisel 2 olevad andmed toetavad siiski kahe kompenseeriva mehhanismi olemasolu: lõhustumissündmuste arvu suurenemine, mis on kooskõlas mitokondriaalse lõhustumise ülesreguleerimisega, ja sündmuste arvu suurenemine, mis on kooskõlas mitokondriaalse biogeneesiga. Lõppkokkuvõttes võib kerge stressi dünaamiline kompenseerimine koosneda samaaegsetest protsessidest, mis hõlmavad lõhustumist, fusiooni, biogeneesi ja mitofagiat. Kuigi varasemad autorid on näidanud, et PPA suurendab mitoosi30,39 ja mitofagiat29, pakume meie tõendeid mitokondriaalse lõhustumise ja fusioonidünaamika ümberkujunemise kohta vastusena PPA-le. Need andmed kinnitavad TEM-i abil täheldatud morfoloogilisi muutusi ja annavad täiendava ülevaate PPA-indutseeritud mitokondriaalse düsfunktsiooniga seotud mehhanismidest.
Kuna ei TEM- ega MEL-analüüs ei andnud otseseid tõendeid vaadeldud morfoloogiliste muutuste aluseks olevate geeniregulatsiooni mehhanismide kohta, uurisime mitokondriaalse metabolismi, biogeneesi ja dünaamikaga seotud geenide RNA ekspressiooni. cMYC proto-onkogeen on transkriptsioonifaktor, mis osaleb mitokondrite, glükolüüsi, aminohapete ja rasvhapete metabolismi regulatsioonis40. Lisaks on teada, et cMYC reguleerib ligi 600 mitokondriaalse geeni ekspressiooni, mis on seotud mitokondriaalse transkriptsiooni, translatsiooni ja kompleksi kokkupanekuga, sealhulgas NRF1 ja TFAM41. NRF1 ja TFAM on kaks mitoosi keskset regulaatorit, mis toimivad PGC-1α-st allavoolu, et aktiveerida mtDNA replikatsiooni. Seda rada aktiveerivad cAMP ja AMPK signaalimine ning see on tundlik energiakulu ja metaboolse stressi suhtes. Samuti uurisime NFE2L2, mitokondriaalse biogeneesi redoksregulaatorit, et teha kindlaks, kas PPA mõjusid võib vahendada oksüdatiivne stress.
Kuigi NFE2L2 ekspressioon jäi muutumatuks, leidsime pärast 24-tunnist töötlemist 3 mM ja 5 mM PPA-ga cMYC, NRF1 ja TFAM ekspressiooni järjepidevat doosist sõltuvat vähenemist (joonis 3a–c). cMYC ekspressiooni allareguleerimist on varem kirjeldatud vastusena mitokondriaalsele stressile42 ja vastupidi, cMYC ekspressiooni allareguleerimine võib põhjustada mitokondriaalset düsfunktsiooni, muutes mitokondriaalset metabolismi, võrguühendust ja membraani polarisatsiooni43. Huvitaval kombel osaleb cMYC ka mitokondriaalse lõhustumise ja fusiooni regulatsioonis42,43 ning on teadaolevalt suurendanud DRP1 fosforüülimist ja mitokondriaalset lokaliseerumist rakkude jagunemise ajal44, samuti vahendab mitokondriaalset morfoloogilist remodelleerumist neuronaalsetes tüvirakkudes45. Tõepoolest, cMYC-defitsiitsetel fibroblastidel on vähenenud mitokondriaalne suurus, mis on kooskõlas PPA43 stressi poolt esile kutsutud muutustega. Need andmed illustreerivad huvitavat, kuid seni ebaselget seost cMYC ja mitokondriaalse dünaamika vahel, pakkudes huvitavat sihtmärki PPA stressist põhjustatud remodelleerumise edasisteks uuringuteks.
NRF1 ja TFAM-i vähenemine on kooskõlas cMYC rolliga olulise transkriptsiooni aktivaatorina. Need andmed on kooskõlas ka varasemate uuringutega inimese käärsoolevähi rakkudes, mis näitavad, et PPA vähendas NRF1 mRNA ekspressiooni 22 tunni möödudes, mis oli seotud ATP vähenemise ja ROS46 suurenemisega. Need autorid teatasid ka, et TFAM-i ekspressioon suurenes 8,5 tunni möödudes, kuid naasis algtasemele 22 tunni möödudes. Seevastu Kim jt (2019) näitasid, et TFAM-i mRNA ekspressioon vähenes SH-SY5Y rakkudes oluliselt pärast 4-tunnist PPA stressi; 72 tunni möödudes oli TFAM-i valgu ekspressioon aga oluliselt suurenenud ja mtDNA koopiate arv oluliselt suurenenud. Seega ei välista mitokondriaalsete biogeneesi geenide arvu vähenemine, mida täheldasime 24 tunni möödudes, võimalust, et mitokondrite arvu suurenemine on seotud biogeneesi aktiveerimisega varasemates ajapunktides. Varasemad uuringud on näidanud, et PPA suurendab oluliselt PGC-1α mRNA ja valgu taset SH-SY5Y rakkudes 4 tunni 30 minuti pärast, samas kui propioonhape suurendab mitokondriaalset biogeneesi vasika hepatotsüütides PGC-1α kaudu 12 tunni 39 minuti pärast. Huvitaval kombel ei ole PGC-1α mitte ainult NRF1 ja TFAM otsene transkriptsiooniregulaator, vaid on näidatud, et see reguleerib ka MFN2 ja DRP1 aktiivsust, reguleerides lõhustumist ja fusiooni47. Kokkuvõttes rõhutab see PPA poolt indutseeritud mitokondriaalseid kompenseerivaid reaktsioone reguleerivate mehhanismide tihedat seotust. Lisaks peegeldavad meie andmed biogeneesi ja metabolismi transkriptsioonilise regulatsiooni olulist düsregulatsiooni PPA stressi all.
STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 ja DRP1 geenid on mitokondriaalse lõhustumise, fusiooni ja dünaamika kesksete regulaatorite hulgas37,48,49. Mitokondriaalses dünaamikas osaleb palju teisi geene, kuid varem on leitud, et STOML2, OPA1 ja MFN2 on ASD kohortides erinevalt metüleeritud16 ja mitmed sõltumatud uuringud on teatanud nende transkriptsioonifaktorite muutustest vastusena mitokondriaalsele stressile50,51.52. Nii OPA1 kui ka STOML2 ekspressioon vähenes oluliselt 3 mM ja 5 mM PPA-ga töötlemisel (joonis 3e, f). OPA1 on üks klassikalisi mitokondriaalse fusiooni regulaatoreid otsese interaktsiooni kaudu MFN1 ja 2-ga ning mängib rolli cristae ümberkujunemises ja mitokondriaalses morfoloogias53. STOML2 täpne roll mitokondriaalses dünaamikas on endiselt ebaselge, kuid tõendid viitavad sellele, et see mängib rolli mitokondriaalses fusioonis, biogeneesis ja mitofagias.
STOML2 osaleb mitokondriaalse hingamissideme säilitamises ja hingamisahela komplekside moodustumises54,55 ning on näidatud, et see muudab sügavalt vähirakkude metaboolseid omadusi56. Uuringud on näidanud, et STOML2 soodustab mitokondriaalse membraani potentsiaali ja biogeneesi interaktsiooni kaudu BAN-i ja kardiolipiiniga 55, 57, 58. Lisaks on sõltumatud uuringud näidanud, et STOML2 ja PINK1 interaktsioon reguleerib mitofaagiat59,60. Märkimisväärselt on teatatud, et STOML2 interakteerub otseselt MFN2-ga ja stabiliseerib seda ning mängib olulist rolli ka pikkade OPA1 isovormide stabiliseerimisel, pärssides OPA1 lagundamise eest vastutavat proteaasi53,61,62. PPA reaktsioonides täheldatud STOML2 ekspressiooni vähenemine võib muuta need fusioonvalgud vastuvõtlikumaks lagunemisele ubikvitiini- ja proteasoomisõltuvate radade kaudu48. Kuigi STOML2 ja OPA1 täpne roll PPA dünaamilises vastuses on ebaselge, võib nende fusioongeenide vähenenud ekspressioon (joonis 3) häirida tasakaalu lõhustumise ja fusiooni vahel ning viia mitokondrite suuruse vähenemiseni (joonis 3). 1).
Teisest küljest jäi OPA1 valgu ekspressioon 24 tunni pärast muutumatuks, samas kui MFN1, MFN2 või DRP1 mRNA ja valgu tasemed ei muutunud pärast PPA-töötlust oluliselt (joonis 3g-i, joonis 4). See võib viidata sellele, et nende mitokondrite fusiooni ja lõhustumisega seotud faktorite regulatsioonis muutusi ei ole. Siiski väärib märkimist, et kõiki neid nelja geeni reguleerivad ka transkriptsioonijärgsed modifikatsioonid (PTM-id), mis kontrollivad valgu aktiivsust. OPA1-l on kaheksa alternatiivset splaissinguvarianti, mis lõhustatakse mitokondrites proteolüütiliselt, moodustades kaks erinevat isovormi 63. Pikkade ja lühikeste isovormide tasakaal määrab lõpuks OPA1 rolli mitokondrite fusioonis ja mitokondriaalse võrgustiku säilitamises 64. DRP1 aktiivsust reguleerib kaltsium/kalmoduliin-sõltuv proteiinkinaas II (CaMKII) fosforüülimine, samas kui DRP1 lagunemist reguleerib ubikvitineerimine ja SUMOüleerimine 65. Lõpuks on nii DRP1 kui ka MFN1/2 GTPaasid, seega võib aktiivsust mõjutada GTP tootmise kiirus mitokondrites 66. Seega, kuigi nende valkude ekspressioon jääb konstantseks, ei pruugi see kajastada muutumatut valgu aktiivsust või lokaliseerimist 67,68. Olemasolevad PTM-valkude repertuaarid toimivad sageli esimese kaitseliinina, mis vastutab ägeda stressireaktsiooni vahendamise eest. Mõõduka metaboolse stressi korral meie mudelis on tõenäoline, et PTM soodustab fusioon- ja lõhustumisvalkude suurenenud aktiivsust, et taastada mitokondriaalne terviklikkus piisavalt, ilma et oleks vaja nende geenide täiendavat aktiveerimist mRNA või valgu tasandil.
Kokkuvõttes toovad ülaltoodud andmed esile mitokondrite morfoloogia keeruka ja ajast sõltuva regulatsiooni ning nende mehhanismide väljaselgitamisega seotud väljakutsed. Geeniekspressiooni uurimiseks on kõigepealt vaja tuvastada rajas spetsiifilised sihtgeenid. Meie andmed näitavad aga, et sama raja geenid ei reageeri samale stressile ühtemoodi. Tegelikult on varasemad uuringud näidanud, et sama raja erinevad geenid võivad avaldada erinevaid ajalisi reageerimisprofiile30,46. Lisaks on olemas keerulised transkriptsioonijärgsed mehhanismid, mis häirivad transkriptsiooni ja geenifunktsiooni vahelist seost. Proteoomilised uuringud võivad anda ülevaate PTM-ide ja valgufunktsiooni mõjust, kuid need tekitavad ka väljakutseid, sealhulgas madala läbilaskevõimega meetodid, kõrge signaali-müra suhe ja halb lahutusvõime.
Selles kontekstis on mitokondriaalse morfoloogia uurimisel TEM-i ja MEL-i abil suur potentsiaal lahendada põhiküsimusi mitokondriaalse dünaamika ja funktsiooni vahelise seose ning selle haigustele avalduva mõju kohta. Kõige olulisem on see, et TEM pakub otsest meetodit mitokondriaalse morfoloogia mõõtmiseks mitokondriaalse düsfunktsiooni ja dünaamika koonduva lõpp-punktina51. MEL pakub ka otsest meetodit lõhustumis- ja fusioonisündmuste visualiseerimiseks kolmemõõtmelises rakukeskkonnas, võimaldades dünaamilise mitokondriaalse remodelleerimise kvantifitseerimist isegi geeniekspressiooni muutuste puudumisel33. Siinkohal tõstame esile mitokondriaalsete kuvamistehnikate kasulikkust sekundaarsete mitokondriaalsete haiguste korral. Neid haigusi iseloomustab tavaliselt krooniline kerge metaboolne stress, mida iseloomustab mitokondriaalsete võrgustike peen remodelleerimine, mitte äge mitokondriaalne kahjustus. Kroonilise stressi all mitoosi säilitamiseks vajalikul mitokondriaalsel kompensatsioonil on aga sügavad funktsionaalsed tagajärjed. Neuroteaduse kontekstis võib nende kompensatsioonimehhanismide parem mõistmine anda olulist teavet mitokondriaalse düsfunktsiooniga seotud pleiotroopse neuropatoloogia kohta.
Lõppkokkuvõttes rõhutavad meie andmed kuvamistehnikate kasulikkust geeniekspressiooni, valgu modifikatsioonide ja valgu aktiivsuse keeruliste interaktsioonide funktsionaalsete tagajärgede mõistmisel, mis kontrollivad neuronite mitokondriaalset dünaamikat. Kasutasime PPA-d mitokondriaalse düsfunktsiooni modelleerimiseks neuronaalse rakumudeli abil, et saada ülevaade ASD mitokondriaalsest komponendist. PPA-ga töödeldud SH-SY5Y rakkudel ilmnesid muutused mitokondriaalses morfoloogias: mitokondrid muutusid väikeseks ja ümaraks ning kristad olid TEM-iga vaadeldes halvasti eristatavad. MEL-analüüs näitab, et need muutused toimuvad samaaegselt lõhustumis- ja fusioonisündmuste sagenemisega, et säilitada mitokondriaalne võrgustik vastusena kergele metaboolsele stressile. Lisaks häirib PPA oluliselt mitokondriaalse metabolismi ja homöostaasi transkriptsioonilist regulatsiooni. Tuvastasime cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 ja OPA1 peamiste mitokondriaalsete regulaatoritena, mida PPA stress häirib ja mis võivad mängida rolli PPA-indutseeritud muutuste vahendamisel mitokondriaalses morfoloogias ja funktsioonis. Edasised uuringud on vajalikud PPA-indutseeritud ajaliste muutuste paremaks iseloomustamiseks geeniekspressioonis ja valgu aktiivsuses, lokaliseerimises ja translatsioonijärgsetes modifikatsioonides. Meie andmed toovad esile mitokondriaalse stressivastuse vahendavate regulatiivsete mehhanismide keerukuse ja vastastikuse sõltuvuse ning näitavad TEM-i ja teiste pildistamistehnikate kasulikkust sihipärasemate mehhanistlike uuringute jaoks.
SH-SY5Y rakuliin (ECACC, 94030304-1VL) osteti firmalt Sigma-Aldrich. SH-SY5Y rakke kasvatati Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötme/F-12 toitainete segus (DMEM/F-12) ja L-glutamiinis (SC09411, ScienCell) 25 cm2 kolbides, millele oli lisatud 20% veise loote seerumit (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) ja 1% penitsilliin-streptomütsiini (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) temperatuuril 37 °C, 5% CO2 atmosfääris. Rakke subkultiveeriti 80% konfluentsini, kasutades 0,05% trüpsiin-EDTA-d (15400054, ThermoFisher Scientific), tsentrifuugiti kiirusel 300 g ja külvati tihedusega ligikaudu 7 × 105 rakku/ml. Kõik katsed viidi läbi diferentseerumata SH-SY5Y rakkudega passaažide 19–22 vahel. PPA-d manustatakse NaP-na. NaP pulber (CAS nr 137-40-6, keemiline valem C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) lahustatakse soojas MilliQ vees kontsentratsioonini 1 M ja säilitatakse temperatuuril 4 °C. Ravi päeval lahjendatakse see lahus 1 M PPA-ga kontsentratsioonini 3 mM ja 5 mM PPA-ga seerumivabas söötmes (DMEM/F-12 L-glutamiiniga). Kõigi katsete ravikontsentratsioonid olid PPA-ta (0 mM, kontroll), 3 mM ja 5 mM PPA. Katsed viidi läbi vähemalt kolmes bioloogilises korduses.
SH-SY5Y rakud külvati 25 cm5 kolbidesse kiirusega 5,5 × 105 rakku/ml ja kasvatati 24 tundi. PPA töötlus lisati kolbi enne 24-tunnist inkubatsiooni. Koguge rakupelletid vastavalt tavalistele imetajate kudede subkultuuri protokollidele (kirjeldatud eespool). Resuspendeerige rakupellet 100 µl 2,5% glutaraldehüüdi, 1× PBS-i lahuses ja hoidke temperatuuril 4 °C kuni töötlemiseni. SH-SY5Y rakke tsentrifuugiti lühidalt, et rakupelletid moodustada ja eemaldada 2,5% glutaraldehüüdi, 1× PBS lahus. Resuspendeerige sete destilleeritud vees valmistatud 4% agaroosgeelis (agaroosi ja sette mahu suhe on 1:1). Agaroositükid asetati tasastel plaatidel olevatele restidele ja kaeti 1-heksadetseeniga enne kõrgsurve külmutamist. Proove külmutati 100% kuivas atsetoonis temperatuuril -90 °C 24 tundi. Seejärel tõsteti temperatuur -80 °C-ni ja lisati 1% osmiumtetroksiidi ja 0,1% glutaraldehüüdi lahus. Proove hoiti temperatuuril -80 °C 24 tundi. Seejärel tõsteti temperatuur järk-järgult mitme päeva jooksul toatemperatuurini: –80 °C-lt –50 °C-ni 24 tunniks, –30 °C-ni 24 tunniks, –10 °C-ni 24 tunniks ja lõpuks toatemperatuurini.
Pärast krüogeenset ettevalmistamist immutati proovid vaiguga ja üliõhukesed sektsioonid (∼100 nm) valmistati Leica Reichert UltracutS ultramikrotoomi (Leica Microsystems) abil. Sektsioonid värviti 2% uranüülatsetaadi ja pliitsitraadiga. Proove vaadeldi FEI Tecnai 20 transmissioon-elektronmikroskoobi (ThermoFisher (endine FEI), Eindhoven, Holland) abil, mis töötas 200 kV pingel (Lab6 saatja) ja Gatan CCD-kaamera (Gatan, Ühendkuningriik) abil, mis oli varustatud Tridiemi energiafiltriga.
Igas tehnilises korduses saadi vähemalt 24 üksikrakulist pilti, kokku 266 pilti. Kõiki pilte analüüsiti huvipakkuva piirkonna (ROI) makro ja mitokondrite makro abil. Mitokondriaalne makro põhineb avaldatud meetoditel17,31,32 ja võimaldab TEM-piltide poolautomaatset partiitöötlust Fiji/ImageJ69-s. Lühidalt: pilti inverteeritakse ja pööratakse ümber, kasutades veereva palli tausta lahutamist (60 piksli raadius) ja FFT ribapääsfiltrit (kasutades vastavalt 60 ja 8 piksli ülemist ja alumist piiri) ning vertikaalsete joone summutamist 5% orientatsioonitolerantsiga. Töödeldud pildile määratakse automaatselt maksimaalse entroopia algoritmi abil läviväärtus ja genereeritakse binaarne mask. Ekstraheeriti töötlemata TEM-piltidel käsitsi valitud ROI-dega seotud pildipiirkonnad, iseloomustades mitokondreid ning jättes välja plasmamembraani ja muud suure kontrastsusega piirkonnad. Iga ekstraheeritud investeeringutasuvuse (ROI) jaoks analüüsiti üle 600 piksli suuruseid binaarseid osakesi ning osakeste pindala, perimeetrit, suuremaid ja väiksemaid telgi, Fereti läbimõõtu, ümarust ja ringikujulisust mõõdeti Fiji/ImageJ sisseehitatud mõõtmisfunktsioonide abil. Merrilli, Flippo ja Stracki (2017) järgides arvutati nende andmete põhjal pindala 2, osakeste kuvasuhe (suure ja väikese telje suhe) ja kujutegur (FF), kus FF = perimeeter 2/4pi x pindala. Parameetrilise valemi definitsiooni leiab Merrilli, Flippo ja Stracki (2017) tööst. Mainitud makrod on saadaval GitHubis (vt andmete kättesaadavuse avaldust). Keskmiselt analüüsiti PPA töötluse kohta ligikaudu 5600 osakest, kokku ligikaudu 17 000 osakest (andmeid pole esitatud).
SH-SH5Y rakud paigutati 8-kambrilistesse kultuurinõudesse (ThermoFisher, #155411), et võimaldada adhesiooni üleöö, ja seejärel inkubeeriti TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) ja Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024) värvimisega. Kujutised saadi 405 nm ja 561 nm laseritega 10 minuti jooksul ning toorkujutised saadi z-virnadena, mis sisaldasid 10 pildimikrofotot 0,2 μm az-sammuga pildikaadrite vahel 12 järjestikusel ajahetkel. Kujutised koguti Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 superresolutsiooniga platvormil (Carl Zeiss, Oberkochen, Saksamaa), kasutades LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 objektiivi. Pilte analüüsiti ImageJ-s, kasutades eelnevalt kirjeldatud torujuhet ja ImageJ pluginat, et mõõta fusiooni- ja lõhustumissündmusi, mitokondriaalsete struktuuride keskmist arvu ja keskmist mitokondriaalset mahtu raku kohta33. MEL-makrod on saadaval GitHubis (vt andmete kättesaadavuse avaldust).
SH-SY5Y rakke kasvatati kuue süvendiga plaatidel tihedusega 0,3 × 106 rakku/ml 24 tundi enne töötlemist. RNA ekstraheeriti Quick-RNA™ Miniprep protokolli (ZR R1055, Zymo Research) abil väikeste muudatustega: enne eemaldamist lisati igasse süvendisse 300 μl RNA lüüsipuhvrit ja lüüsiti iga proov viimase sammuna 30 μl DNaasi/RNaasi elueerimisvaba veega. Kõikide proovide kvantiteeti ja kvaliteeti kontrolliti NanoDrop ND-1000 UV-Vis spektrofotomeetriga. Rakulüsaatidest saadud koguvalk saadi 200 μl RIPA lüüsipuhvriga ja valgu kontsentratsioon kvantifitseeriti Bradfordi valguanalüüsi abil70.
cDNA süntees viidi läbi Tetro™ cDNA sünteesikomplekti (BIO-65043, Meridian Bioscience) abil vastavalt tootja juhistele ja mõningate muudatustega. cDNA sünteesiti 20 μl reaktsioonides, kasutades 0,7 kuni 1 μg totaal-RNA-d. Praimerid valiti varem avaldatud artiklitest 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (tabel S1) ja kaasnevad sondid disainiti Integrated DNA Technologies PrimerQuesti tööriista abil. Kõik huvipakkuvad geenid normaliseeriti tuuma B2M geeni suhtes. STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC ja OPA1 geeniekspressiooni mõõdeti RT-qPCR abil. Põhisegu sisaldas LUNA Taq polümeraasi (M3003L, New England Biolabs), 10 μM otse- ja tagasipraimereid, cDNA-d ja PCR-kvaliteediga vett, saades iga reaktsiooni lõppmahuks 10 μL. Jagunemis- ja lõhustumisgeenide (DRP1, MFN1/2) ekspressiooni mõõdeti TaqMani multipleksanalüüside abil. Kasutati Luna Universal Probe qPCR Master Mixi (M3004S, New England Biolabs) vastavalt tootja juhistele väikeste muudatustega. Multipleksne RT-qPCR põhisegu sisaldab 1X LUNA Taq polümeraasi, 10 μM otse- ja tagasipraimereid, 10 μM sondi, cDNA-d ja PCR-kvaliteediga vett, mille tulemuseks on iga reaktsiooni lõppmaht 20 μL. RT-qPCR viidi läbi Rotor-Gene Q 6-plexi abil (QIAGEN RG – seerianumber: R0618110). Tsükleerimistingimused on toodud tabelis S1. Kõik cDNA proovid amplifitseeriti kolmes korduses ja standardkõver genereeriti kümnekordsete lahjenduste seeria abil. Kolmekordsetes proovides esinevad erandid, mille tsükli lävi standardhälve (Ct) oli >0,5, eemaldati analüüsist, et tagada andmete reprodutseeritavus30,72. Suhteline geeniekspressioon arvutati 2-ΔΔCt79 meetodi abil.
Valguproovid (60 μg) segati Laemmli laadimispuhvriga suhtega 2:1 ja töödeldi 12% värvitul valgugeelil (Bio-Rad #1610184). Valgud kanti PVDF (polüvinülideenfluoriid) membraanile (#170-84156, Bio-Rad), kasutades Trans-Blot Turbo süsteemi (#170-4155, Bio-Rad). Membraan blokeeriti ja inkubeeriti sobivate primaarsete antikehadega (OPA1, MFN1, MFN2 ja DRP1) (lahjendatud 1:1000) 48 tundi, millele järgnes inkubeerimine sekundaarsete antikehadega (1:10 000) 1 tund. Seejärel pildistati membraane Clarity Western ECL Substrate'i (#170-5061, Bio-Rad) abil ja registreeriti Bio-Rad ChemiDoc MP süsteemi abil. Western blot analüüsiks kasutati ImageLab versiooni 6.1. Algne geel ja blot on näidatud joonisel S1. Antikehade teave on esitatud tabelis S2.
Andmekogumid on esitatud vähemalt kolme sõltumatu valimi keskmise ja keskmise standardveana (SEM). Andmekogumite normaalsust kontrolliti Shapiro-Wilksi testiga (kui pole teisiti märgitud) enne Gaussi jaotuse ja võrdsete standardhälvete eeldamist ning analüüsidega jätkamist. Lisaks andmekogumi analüüsile kasutati olulisuse määramiseks Fisheri MEL LSD-d (p < 0,05), ühesuunalist ANOVA-d (ravi vs kontrollkeskmine) ja Dunnetti mitmekordse võrdluse testi (p < 0,05). Olulised p-väärtused on graafikul näidatud järgmiselt: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Kõik statistilised analüüsid ja graafikud viidi läbi ja genereeriti GraphPad Prism 9.4.0 abil.
TEM-piltide analüüsi Fiji/ImageJ makrod on avalikult saadaval GitHubis: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Mitokondriaalse sündmuste lokaatori (MEL) makro on avalikult saadaval GitHubis: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM ja Vijaya A. Mitokondrid: ainevahetuse, homöostaasi, stressi, vananemise ja epigeneetika peamised regulaatorid. Indoneesia. Biomeditsiiniline Teadus. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Mitmetahuline mitokondriaalne düsfunktsioon skisofreenia korral, kompleks I kui võimalik patoloogiline sihtmärk. Skisofreenia. ressurss. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. ja Beal, MF. Mitokondriaalne düsfunktsioon Parkinsoni tõve korral. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG ja Mehta V. Stressis mitokondrid: invasiooni sihtmärgid Alzheimeri tõve korral. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF ja Ferreira GK Mitokondrid ja aju: bioenergeetika ja muu. Neurotoksiinid. resource. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. jt. Pleiotroopsed mitokondrid: mitokondrite mõju neuronite arengule ja haigustele. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. ja Morais, VA. Mitokondriaalne biogenees neuronites: kuidas ja kus. Rahvusvahelisus. J. Mohr. The Science. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. ja Zhao, J. Imetajate mitokondriaalse dünaamika regulatsioon: võimalused ja väljakutsed. front. endokriinne. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. ja Slack, RS. Mitokondriaalne dünaamika neurogeneesi regulatsioonis: arenevast ajust täiskasvanu ajuni. development. dynamic. 247, 47–53 (2018).