Praegune aadress: Köln 50931, Saksamaa, Kölni tippklaster, mis uurib rakulist stressireaktsiooni vananemisega seotud haiguste korral (CECAD).
Mitokondriaalsete haiguste neurodegeneratsiooni peetakse pöördumatuks, kuna neuronite metaboolne plastilisus on piiratud, kuid mitokondriaalse düsfunktsiooni mõju neuronaalse metabolismi raku autonoomiale organismis on halvasti mõistetav. Siin tutvustame Purkinje neuronite rakuspetsiifilist proteoomi, millel on progresseeruv OXPHOS-i puudulikkus, mille on põhjustanud häiritud mitokondriaalse fusiooni dünaamika. Leidsime, et mitokondriaalne düsfunktsioon vallandas proteoomika valdkonnas põhjaliku muutuse, mis viis lõpuks täpsete metaboolsete programmide järjestikuse aktiveerimiseni enne rakusurma. Ootamatult tuvastasime püruvaatkarboksülaasi (PCx) ja teiste vananemisvastaste ensüümide ilmse indutseerimise, mis täiendavad TCA tsükli vaheühendeid. PCx pärssimine süvendas oksüdatiivset stressi ja neurodegeneratsiooni, mis näitab, et ateroskleroosil on OXPHOS-i puuduvate neuronite puhul kaitsev toime. Mitokondriaalse fusiooni taastamine terminaalselt degenereerunud neuronites pöörab need metaboolsed omadused täielikult tagasi, ennetades seeläbi rakusurma. Meie leiud tuvastavad seni tundmatud rajad, mis annavad vastupidavuse mitokondriaalsele düsfunktsioonile, ja näitavad, et neurodegeneratsiooni saab tagasi pöörata isegi haiguse hilisemas staadiumis.
Mitokondrite keskset rolli neuronaalse energia metabolismi säilitamisel rõhutavad ulatuslikud neuroloogilised sümptomid, mis on seotud inimese mitokondriaalsete haigustega. Enamik neist haigustest on põhjustatud geenimutatsioonidest, mis reguleerivad mitokondrite geenide ekspressiooni (1, 2) või mitokondrite dünaamikaga seotud geenide hävimisest, mis kaudselt mõjutavad mitokondriaalse DNA (mtDNA) stabiilsust (3, 4). Loommudelites tehtud uuringud on näidanud, et vastusena mitokondriaalsele düsfunktsioonile ümbritsevates kudedes võivad aktiveeruda konservatiivsed ainevahetusrajad (5-7), mis annab olulist teavet nende keeruliste haiguste patogeneesi põhjalikuks mõistmiseks. Teravas kontrastis on meie arusaam spetsiifiliste rakutüüpide ainevahetusmuutustest, mis on põhjustatud aju mitokondriaalse adenosiintrifosfaadi (ATP) tootmise üldisest ebaõnnestumisest, fundamentaalne (8), rõhutades vajadust tuvastada terapeutilisi sihtmärke, mida saab kasutada haiguste ennetamiseks või ennetamiseks. Neurodegeneratsiooni ennetamine (9). Teabe puudumine seisneb asjaolus, et närvirakke peetakse laialdaselt väga piiratud metaboolse paindlikkusega võrreldes ümbritsevate kudede rakutüüpidega (10). Arvestades, et need rakud mängivad keskset rolli metaboliitide neuronitele tarnimise koordineerimisel, et soodustada sünaptilist ülekannet ning reageerida vigastustele ja haigusseisunditele, on rakkude ainevahetuse kohandamise võime ajukoe keeruliste tingimustega peaaegu piiratud gliaalrakkudega (11–14). Lisaks takistab ajukoe loomupärane rakuline heterogeensus suuresti spetsiifilistes neuronaalsetes alarühmades toimuvate ainevahetuslike muutuste uurimist. Seetõttu on neuronite mitokondriaalse düsfunktsiooni täpsete rakuliste ja ainevahetuslike tagajärgede kohta vähe teada.
Mitokondriaalse düsfunktsiooni metaboolsete tagajärgede mõistmiseks isoleerisime Purkinje neuronid (PN-id) neurodegeneratsiooni erinevates etappides, mis on põhjustatud mitokondriaalse välismembraani fusiooni (Mfn2) hävimisest. Kuigi Mfn2 mutatsioonid inimestel on seotud päriliku motoorse sensoorse neuropaatia vormiga, mida tuntakse Charcot-Marie-Tooth tüüpi 2A nime all (15), on Mfn2 tingimuslik hävimine hiirtel tuntud oksüdatsiooni fosforüülimise (OXPHOS) düsfunktsiooni indutseerimise meetod. Erinevate neuronaalsete alatüüpidega (16-19) ja sellest tuleneva neurodegeneratiivse fenotüübiga kaasnevad progresseeruvad neuroloogilised sümptomid, nagu liikumishäired (18, 19) või väikeaju ataksia (16). Kasutades märgistusvaba kvantitatiivse (LFQ) proteoomika, metaboloomika, pildistamise ja viroloogiliste meetodite kombinatsiooni, näitame, et progresseeruv neurodegeneratsioon indutseerib tugevalt püruvaatkarboksülaasi (PCx) ja teisi PN-ide arterioskleroosiga seotud tegureid in vivo ensüümide ekspressioonis. Selle leiu asjakohasuse kontrollimiseks vähendasime spetsiifiliselt PCx ekspressiooni Mfn2-defitsiitsetes närvirakkudes ja leidsime, et see operatsioon süvendas oksüdatiivset stressi ja kiirendas neurodegeneratsiooni, tõestades seega, et azoospermia annab rakusurmale metaboolse kohanemisvõime. MFN2 tugev ekspressioon võib täielikult päästa terminaalse degeneratsiooniga närvirakkudest, millel on raske OXPHOS-defitsiit, tohutu mitokondriaalse DNA tarbimine ja ilmselt katkenud mitokondriaalne võrgustik, mis rõhutab veelgi, et see neurodegeneratsiooni vorm võib taastuda isegi haiguse kaugelearenenud staadiumis enne rakusurma.
Mfn2 väljalülitusega PN-rakkude mitokondrite visualiseerimiseks kasutasime hiire tüve, mis võimaldab Cre-sõltuvatel mitokondritel sihtida kollase fluorestseeruva valgu (YFP) (mtYFP) (20) Cre ekspressiooni ja kontrollisime mitokondrite morfoloogiat in vivo. Leidsime, et Mfn2 geeni hävimine PN-rakkudes viib mitokondrite võrgustiku järkjärgulise jagunemiseni (joonis S1A) ja varaseim muutus leiti 3 nädala vanuselt. Seevastu PN-rakkude kihi oluline degeneratsioon, mida tõendab Calbindini immunovärvimise kadumine, algas alles 12 nädala vanuselt (joonis 1, A ja B). Ajaline mittevastavus mitokondrite morfoloogia varaseimate muutuste ja neuronite surma nähtava alguse vahel ajendas meid uurima metaboolseid muutusi, mida mitokondriaalne düsfunktsioon enne rakusurma esile kutsus. Töötasime välja fluorestsents-aktiveeritud rakkude sorteerimisel (FACS) põhineva strateegia YFP-d (YFP+) ekspresseerivate PN-rakkude isoleerimiseks (joonis 1C) ja kontrollhiirtel (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP: : L7-cre), edaspidi nimetatud kui CTRL (joonis S1B). YFP-signaali suhtelisel intensiivsusel põhinev väravdamisstrateegia optimeerimine võimaldab meil puhastada YFP+ keha (YFPhigh) PN-rakkudest mitte-PN-rakkudest (YFPneg) (joonis S1B) või oletatavatest fluorestseeruvatest aksoni/dendriitifragmentidest (YFPlow; joonis S1D, vasakul), mida kinnitati konfokaalse mikroskoobiga (joonis S1D, paremal). Klassifitseeritud populatsiooni identiteedi kontrollimiseks viisime läbi LFQ proteoomika ja seejärel peamiste komponentide analüüsi ning leidsime, et YFPhigh ja YFPneg rakkude vahel on selge eristus (joonis S1C). YFPhigh rakud näitasid teadaolevate PN-markerite (st Calb1, Pcp2, Grid2 ja Itpr3) neto rikastumist (21, 22), kuid neuronites või teistes rakutüüpides tavaliselt ekspresseeritavate valkude rikastumist ei täheldatud (joonis 1D). Sõltumatutes katsetes kogutud klassifitseeritud YFPhigh rakkude proovide võrdlus näitas korrelatsioonikordajat > 0,9, mis näitab head reprodutseeritavust bioloogiliste replikaatide vahel (joonis S1E). Kokkuvõttes kinnitasid need andmed meie plaani teostatava PN-i ägedaks ja spetsiifiliseks isoleerimiseks. Kuna kasutatud L7-cre draiverisüsteem indutseerib mosaiikrekombinatsiooni esimesel nädalal pärast sündi (23), hakkasime hiiri CTRL-ist välja praakima ja tingimuslikult (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) neuroneid koguma. Pärast rekombinatsiooni lõppu nimetatakse seda 4 nädala vanuselt Mfn2cKO-ks. Lõpp-punktiks valisime 8 nädala vanuse, mil PN-kiht oli vaatamata ilmsele mitokondriaalsele fragmentatsioonile terve (joonis 1B ja joonis S1A). Kokku kvantifitseerisime 3013 valku, millest umbes 22% põhinesid MitoCarta 2.0 annotatsioonidel, mis põhinesid mitokondriaalsel proteoomil mitokondritena (joonis 1E) (joonis 1E) (24). 8. nädalal läbi viidud diferentsiaalse geeniekspressiooni analüüs näitas, et ainult 10,5%-l kõigist valkudest olid olulised muutused (joonis 1F ja joonis S1F), millest 195 valku oli allareguleeritud ja 120 valku ülesreguleeritud (joonis 1F). Väärib märkimist, et selle andmestiku „uuendusliku raja analüüs“ näitab, et diferentsiaalselt ekspresseeritud geenid kuuluvad peamiselt piiratud hulga spetsiifiliste metaboolsete radade hulka (joonis 1G). Huvitaval kombel, kuigi OXPHOS-i ja kaltsiumi signaaliülekandega seotud radade allareguleerimine kinnitab mitokondriaalse düsfunktsiooni teket fusioonipuudulikkusega polünukleaarsetes närvirakkudes, on teised kategooriad, mis hõlmavad peamiselt aminohapete metabolismi, oluliselt ülesreguleeritud, mis on kooskõlas mitokondriaalsetes polünukleaarsetes närvirakkudes toimuva metabolismi düsfunktsiooniga. Ümberprogrammeerimine on järjepidev.
(A) CTRL ja Mfn2cKO hiirte väikeaju lõikude representatiivsed konfokaalsed fotod, mis näitavad PN-ide progresseeruvat kadu (kalbindiin, hall); tuumad värviti DAPI-ga kontrastvärviga. (B) (A) kvantifitseerimine (ühesuunaline dispersioonanalüüs, ***P<0,001; n = 4 kuni 6 ringi kolmelt hiirelt). (C) Eksperimentaalne töövoog. (D) Purkinje (üleval) ja teiste rakutüüpide (keskel) spetsiifiliste markerite soojuskaardi jaotus. (E) Venni diagramm, mis näitab klassifitseeritud PN-is tuvastatud mitokondriaalsete valkude arvu. (F) Mfn2cKO neuronite diferentsiaalselt ekspresseeritud valkude vulkaanidiagramm 8. nädalal (olulisuse piirväärtus 1,3). (G) Loovusraja analüüs näitab viit kõige olulisemat ülesreguleerimise (punane) ja allareguleerimise (sinine) rada Mfn2cKO PN-is, mis on klassifitseeritud 8. nädalaks. Näidatud on iga tuvastatud valgu keskmine ekspressioonitase. Halltoonide soojuskaart: korrigeeritud P-väärtus. ns, pole oluline.
Proteomika andmed näitasid, et komplekside I, III ja IV valguekspressioon vähenes järk-järgult. Kompleksid I, III ja IV sisaldasid kõik olulisi mtDNA-kodeeritud subühikuid, samas kui kompleks II, mis oli kodeeritud ainult tuumas, jäi praktiliselt muutumatuks (joonis 2A ja joonis S2A). Kooskõlas proteoomika tulemustega näitas väikeaju koelõikude immunohistokeemia, et kompleksi IV MTCO1 (mitokondriaalne tsütokroom C oksüdaasi subühik 1) subühiku tase PN-is vähenes järk-järgult (joonis 2B). mtDNA-kodeeritud subühik Mtatp8 vähenes oluliselt (joonis S2A), samas kui tuumakodeeritud ATP süntaasi subühiku püsiseisundi tase jäi muutumatuks, mis on kooskõlas teadaoleva stabiilse ATP süntaasi alamkogumi F1 kompleksiga, kui mtDNA ekspressioon on stabiilne. Moodustamine on järjepidev. Katkestus (7). mtDNA taseme hindamine sorteeritud Mfn2cKO PN-ides reaalajas polümeraasi ahelreaktsiooni (qPCR) abil kinnitas mtDNA koopiate arvu järkjärgulist vähenemist. Võrreldes kontrollrühmaga oli 8 nädala vanuselt säilinud vaid umbes 20% mtDNA tasemest (joonis 2C). Kooskõlas nende tulemustega kasutati DNA tuvastamiseks Mfn2cKO PN-ide konfokaalset mikroskoopilist värvimist, mis näitas mitokondriaalsete nukleotiidide ajast sõltuvat tarbimist (joonis 2D). Leidsime, et ainult mõned mitokondriaalsete valkude lagundamisel ja stressireaktsioonil osalevad kandidaadid olid ülesreguleeritud, sealhulgas Lonp1, Afg3l2 ja Clpx ning OXPHOS-i kompleksi assamblee faktorid. Apoptoosis osalevate valkude tasemes olulisi muutusi ei tuvastatud (joonis S2B). Samuti leidsime, et kaltsiumi transpordis osalevates mitokondrites ja endoplasmaatilise retiikulumi kanalites on vaid väikesed muutused (joonis S2C). Lisaks ei leitud autofaagiaga seotud valkude hindamisel olulisi muutusi, mis on kooskõlas autofagosoomide nähtava indutseerimisega, mida on täheldatud in vivo immunohistokeemia ja elektronmikroskoopia abil (joonis S3). PN-ide progresseeruva OXPHOS-i düsfunktsiooniga kaasnevad aga ilmsed ultrastruktuurilised mitokondriaalsed muutused. Mitokondriaalseid klastreid võib näha 5 ja 8 nädala vanuste Mfn2cKO PN-ide rakkude kehades ja dendriitpuudes ning sisemembraani struktuur on läbi teinud põhjalikud muutused (joonis S4, A ja B). Kooskõlas nende ultrastruktuuriliste muutuste ja mtDNA olulise vähenemisega näitas ägedate aju-väikeaju viilude analüüs tetrametüül-rodamiinmetüülestriga (TMRM), et Mfn2cKO PN-ide mitokondriaalse membraani potentsiaal oli oluliselt vähenenud (joonis S4C).
(A) OXPHOS-kompleksi ekspressioonitaseme ajaline analüüs. Arvesse võetakse ainult valke, mille P<0,05 8. nädalal (kahesuunaline ANOVA). Katkendjoon: CTRL-iga võrreldes korrigeerimist ei tehtud. (B) Vasakul: Näide väikeaju lõigust, mis on märgistatud anti-MTCO1 antikehaga (skaalariba, 20 μm). Purkinje rakkude poolt hõivatud ala on kaetud kollasega. Paremal: MTCO1 tasemete kvantifitseerimine (ühesuunaline dispersioonanalüüs; n = 7 kuni 20 rakku analüüsiti kolmelt hiirelt). (C) mtDNA koopiate arvu qPCR analüüs sorteeritud PN-is (ühesuunaline dispersioonanalüüs; n = 3 kuni 7 hiirt). (D) Vasakul: Näide väikeaju lõigust, mis on märgistatud anti-DNA antikehaga (skaalariba, 20 μm). Purkinje rakkude poolt hõivatud ala on kaetud kollasega. Paremal: mtDNA kahjustuste kvantifitseerimine (ühesuunaline dispersioonanalüüs; n = 5 kuni 9 rakku kolmelt hiirelt). (E) Näide ägedast väikeaju lõigust, mis näitab mitoYFP + Purkinje rakke (nool) täisrakulise plaastriklambri salvestusel. (F) IV kõvera kvantifitseerimine. (G) Depolariseeriva voolu süstimise representatiivsed salvestused CTRL ja Mfn2cKO Purkinje rakkudes. Ülemine jälg: esimene impulss, mis vallandas AP. Alumine jälg: maksimaalne AP sagedus. (H) Postsünaptiliste spontaansete sisendite (sPSP-de) kvantifitseerimine. Representatiivne salvestusjälg ja selle suumi suhe on näidatud joonisel (I). Ühesuunaline dispersioonanalüüs analüüsis n = 5 kuni 20 rakku kolmelt hiirelt. Andmed on väljendatud keskmisena ± SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Spontaanse AP representatiivsed kõverad, mis registreeriti perforeeritud plaastriklambri režiimis. Ülemine jälg: maksimaalne AP sagedus. Alumine jälg: üksiku AP suum. (K) Kvantifitseerige keskmine ja maksimaalne AP sagedus vastavalt punktile (J). Mann-Whitney test; analüüsiti n = 5 rakku neljalt hiirelt. Andmed on väljendatud keskmisena ± SEM; mitte oluline.
8-nädalasel Mfn2cKO PN-l tuvastati ilmne OXPHOS-i kahjustus, mis viitab neuronite füsioloogilise funktsiooni tõsisele kõrvalekaldele. Seetõttu analüüsisime OXPHOS-i defitsiitsete neuronite passiivseid elektrilisi omadusi 4–5 nädala ja 7–8 nädala vanuselt, tehes ägedate väikeaju viilude täisrakulise plaastriklambri salvestusi (joonis 2E). Ootamatult olid Mfn2cKO neuronite keskmine puhkemembraani potentsiaal ja sisendtakistus sarnased kontrollrühmaga, kuigi rakkude vahel esines peeneid erinevusi (tabel 1). Samamoodi ei leitud 4–5 nädala vanuselt olulisi muutusi voolu-pinge suhtes (IV kõver) (joonis 2F). Siiski ei elanud ükski 7–8 nädala vanune Mfn2cKO neuron IV raviskeemi (hüperpolarisatsiooni etapp) üle, mis näitab, et selles hilises staadiumis on hüperpolarisatsioonipotentsiaali suhtes selge tundlikkus. Seevastu Mfn2cKO neuronites talutakse korduvaid aktsioonipotentsiaali (AP) tühjenemisi põhjustavaid depolariseerivaid voolusid hästi, mis näitab, et nende üldised tühjenemismustrid ei erine oluliselt 8-nädalaste kontrollneuronite omadest (tabel 1 ja joonis 2G). Samamoodi oli spontaansete postsünaptiliste voolude (sPSC) sagedus ja amplituud võrreldav kontrollrühma omadega ning sündmuste sagedus suurenes 4 nädalalt 5 nädalale, 7 nädalale ja 8 nädalale sarnase suurenemisega (joonis 2, H ja I). ​​Sünaptilise küpsemise periood PN-ides (25). Sarnased tulemused saadi ka pärast perforeeritud PN-plaastreid. See konfiguratsioon hoiab ära rakuliste ATP-defektide võimaliku kompenseerimise, mis võib juhtuda täisrakulise plaastriklambri registreerimisel. Eelkõige ei mõjutatud Mfn2cKO neuronite puhkemembraani potentsiaali ja spontaanset tulistamissagedust (joonis 2, J ja K). Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et ilmse OXPHOS-i düsfunktsiooniga PN-id saavad kõrgsageduslike tühjenemismustritega hästi hakkama, mis näitab, et on olemas kompensatsioonimehhanism, mis võimaldab neil säilitada peaaegu normaalseid elektrofüsioloogilisi reaktsioone.
Andmed on väljendatud keskmisena ± SEM (ühesuunaline dispersioonanalüüs, Holm-Sidaki mitmekordse võrdluse test; *P<0,05). Ühiku number on märgitud sulgudes.
Meie eesmärk oli uurida, kas proteoomika andmestikus (joonis 1G) olev kategooria sisaldab radasid, mis suudavad neutraliseerida rasket OXPHOS-i puudulikkust, selgitades seeläbi, miks kahjustatud perifeerne neuropaatia suudab säilitada peaaegu normaalse elektrofüsioloogia (joonis 2, E kuni K). Proteoomika analüüs näitas, et hargnenud ahelaga aminohapete (BCAA) katabolismiga seotud ensüümid olid oluliselt ülesreguleeritud (joonis 3A ja joonis S5A) ning lõpp-produkt atsetüül-CoA (CoA) või suktsüül-CoA saab täiendada trikarboksülaate arterioskleroosi happe (TCA) tsüklis. Leidsime, et nii BCAA transaminaasi 1 (BCAT1) kui ka BCAT2 sisaldus suurenes. Need katalüüsivad BCAA katabolismi esimest etappi, genereerides glutamaadi α-ketoglutaraadist (26). Kõik hargnenud ahelaga ketohappe dehüdrogenaasi (BCKD) kompleksi moodustavad subühikud on ülesreguleeritud (kompleks katalüüsib saadud BCAA süsinikskeleti järgnevat ja pöördumatut dekarboksüülimist) (joonis 3A ja joonis S5A). Sorteeritud polünukleotiidis (PN) ei leitud siiski mingeid ilmseid muutusi BCAA-s endas, mis võib olla tingitud nende essentsiaalsete aminohapete suurenenud rakulisest omastamisest või muude allikate (glükoos või piimhape) kasutamisest TCA tsükli täiendamiseks (joonis S5B). OXPHOS-i puuduvatel PN-idel ilmnes ka 8 nädala vanuselt suurenenud glutamiini lagunemise ja transaminatsiooni aktiivsus, mida võib kajastada mitokondriaalsete ensüümide glutaminaasi (GLS) ja glutamiinpüruvaattransaminaasi 2 (GPT2) ülesreguleerimises (joonis 3, A ja C). Tasub märkida, et GLS-i ülesreguleerimine piirdub splaissitud isovormi glutaminaas C-ga (GLS-GAC) (Mfn2cKO/CTRL muutus on ligikaudu 4,5-kordne, P = 0,05) ja selle spetsiifiline ülesreguleerimine vähi kudedes võib toetada mitokondriaalset bioenergiat. (27).
(A) Soojuskaart näitab valgu taseme muutust 8 nädala möödudes määratud manustamisviisi korral. (B) Näide anti-PCx antikehaga märgistatud väikeajulõigust (skaalariba, 20 μm). Kollane nool osutab Purkinje rakkudele. (C) Aja jooksul valgu ekspressiooni analüüs, mis on identifitseeritud olulise ateroskleroosi kandidaadina (mitmekordne t-test, *FDR <5%; n = 3-5 hiirt). (D) Ülal: Skemaatiline diagramm, mis näitab [1-13C]püruvaadi märgistusaines sisalduva märgistatud süsiniku sisenemise erinevaid viise (st PDH või transarteriaalse tee kaudu). All: Viiulidiagramm näitab üksikmärgistatud süsiniku (M1) protsenti, mis on muundatud asparagiinhappeks, sidrunhappeks ja õunhappeks pärast ägedate väikeajulõikude märgistamist [1-13C]püruvaadiga (paaris t-test; ** P <0,01). (E) Näidatud raja põhjalik aja jooksul toimuv analüüs. Arvesse võetakse ainult valke, mille P <0,05 on 8 nädala möödudes. Katkendjoon: korrigeerimisväärtust ei ole (kahesuunaline dispersioonanalüüs; * P <0,05; *** P <0,001). Andmed on väljendatud keskmisena ± standardviga.
Meie analüüsis on BCAA katabolism muutunud üheks peamiseks ülesreguleerimise rajaks. See asjaolu viitab tugevalt sellele, et TCA tsüklisse sisenev ventilatsioonimaht võib OXPHOS-i puuduliku PN-i korral muutuda. See võib esindada neuronaalse metaboolse ümberlülitumise peamist vormi, millel võib olla otsene mõju neuronaalsele füsioloogiale ja ellujäämisele raske OXPHOS-i düsfunktsiooni säilitamise ajal. Kooskõlas selle hüpoteesiga leidsime, et peamine ateroskleroosivastane ensüüm PCx on ülesreguleeritud (Mfn2cKO/CTRL muutub ligikaudu 1,5 korda; joonis 3A), mis katalüüsib püruvaadi muundumist oksaloatsetaadiks (28), mida arvatakse olevat ajukoes. Ekspressioon piirdub astrotsüütidega (29, 30). Kooskõlas proteoomika tulemustega näitas konfokaalne mikroskoopia, et PCx ekspressioon oli spetsiifiliselt ja oluliselt suurenenud OXPHOS-i puudulike PN-ide puhul, samas kui PCx reaktsioonivõime piirdus peamiselt kontrollrühma külgnevate Bergmanni gliaalrakkudega (joonis 3B). PCx täheldatud ülesreguleerimise funktsionaalseks testimiseks töödeldi ägedaid väikeaju viile [1-13C]püruvaadi märgistusainega. Kui püruvaat oksüdeeriti püruvaatdehüdrogenaasi (PDH) poolt, kadus selle isotoopmärgis, kuid see inkorporeeriti TCA tsükli vaheühenditesse, kui püruvaat metaboliseeritakse vaskulaarsete reaktsioonide kaudu (joonis 3D). Meie proteoomikaandmete toetuseks täheldasime Mfn2cKO viilude asparagiinhappes suurt hulka selle märgistusaine markereid, samas kui sidrunhappel ja õunhappel oli samuti mõõdukas trend, kuigi mitte oluline (joonis 3D).
MitoParki hiirte dopamiini neuronites, mille mitokondriaalne düsfunktsioon on põhjustatud mitokondriaalse transkriptsioonifaktori A geeni (Tfam) spetsiifiliselt hävitavatest dopamiini neuronitest (joonis S6B), oli PCx ekspressioon samuti oluliselt ülesreguleeritud (31), mis näitab, et atsetoonhappe arterioskleroos. Haiguse esinemist reguleeritakse organismi neuronaalse OXPHOS-i düsfunktsiooni ajal. Väärib märkimist, et on leitud, et unikaalsed ensüümid (32–34), mida võivad ekspresseerida neuronites, mis võivad olla seotud arterioskleroosiga, on oluliselt ülesreguleeritud OXPHOS-i puudulikes PN-ides, näiteks propionüül-CoA karboksülaas (PCC-A), malonüül-CoA muundab propionüül-CoA suktsüül-CoA-ks ja mitokondriaalne õunhappe ensüüm 3 (ME3), mille peamine roll on püruvaadi eraldamine malaadist (joonis 3, A ja C) (33, 35). Lisaks leidsime Pdk3 ensüümi olulise suurenemise, mis fosforüülib ja seega inaktiveerib PDH-d (36), samas kui Pdp1 ensüümis, mis aktiveerib PDH-d, ega PDH ensüümikompleksis endas muutusi ei tuvastatud (joonis 3A). Järjepidevalt suurenes Mern2cKO PN-ides Ser293-s asuva PDH kompleksi püruvaatdehüdrogenaasi E1 komponendi α1 subühiku α (PDHE1α) subühiku fosforüülimine (teadaolevalt inhibeerib PDH ensüümiaktiivsust) (joonis S6C). Püruvaadil puudub vaskulaarne juurdepääs.
Lõpuks leidsime, et seriini ja glütsiini biosünteesi superrada, sellega seotud mitokondriaalne folaadi (1C) tsükkel ja proliini biosüntees (joonis 1G ja joonis S5C) on aktivatsiooniprotsessi ajal märkimisväärselt ülesreguleeritud. Ümbritsevad koed on mitokondriaalse düsfunktsiooniga aktiveeritud (5-7). Neid proteoomikaandmeid toetav konfokaalne analüüs näitas, et OXPHOS-i puuduva PN-i korral allutati 8-nädalaste hiirte väikeaju viiludele seriinhüdroksümetüültransferaas 2 (SHMT2), mis on mitokondriaalse folaaditsükli võtmeensüüm. Märkimisväärne immuunvastus (joonis S5D). 13 CU-glükoosiga inkubeeritud ägedas väikeaju viilus kinnitasid metaboolse jälgimise katsed veelgi seriini ja proliini biosünteesi ülesreguleerimist, mis näitab, et süsiniku isovormide voog seriiniks ja proliiniks suurenes (joonis S5E). Kuna GLS-i ja GPT2 poolt soodustatud reaktsioonid vastutavad glutamaadi sünteesi eest glutamiinist ja glutamaadi ning α-ketoglutaraadi vahelise transaminatsiooni eest, näitab nende ülesreguleerimine, et OXPHOS-defitsiitsetel neuronitel on suurenenud glutamaadi nõudlus. See võib olla suunatud proliini suurenenud biosünteesi säilitamisele (joonis S5C). Vastupidiselt neile muutustele näitas PN-spetsiifiliste Mfn2cKO hiirte väikeaju astrotsüütide proteoomiline analüüs, et nende radade (sealhulgas kõigi antiperoksidaaside) ekspressioon ei muutunud oluliselt, mis näitab seega, et see metaboolne ümbersuunamine on selektiivne degradeeritud PN-i suhtes (joonis S6, D kuni G).
Kokkuvõttes näitasid need analüüsid PN-ide spetsiifiliste metaboolsete radade ajalise aktiveerimise oluliselt erinevaid mustreid. Kuigi ebanormaalne neuronaalne mitokondriaalne funktsioon võib viia varajase ateroskleroosi ja 1C remodelleerumiseni (joonis 3E ja joonis S5C) ning isegi prognoositavate muutusteni I ja IV komplekside ekspressioonis, on seriini de novo sünteesi muutused ainult OXPHOS-i düsfunktsiooni põhjuseks (joonis 3E ja joonis S5C). Need leiud määratlevad järjestikuse protsessi, milles stressist tingitud mitokondriaalne (1C tsükkel) ja tsütoplasmaatiline (seriini biosüntees) reageerivad sünergiliselt ateroskleroosi suurenemisega TCA tsüklis, et kujundada ümber neuronaalset metabolismi.
8-nädalased OXPHOS-defitsiitsed PN-rakud suudavad säilitada kõrgsageduslikku ergastusaktiivsust ja läbida olulise metaboolse taasühendamise, et kompenseerida mitokondriaalset düsfunktsiooni. See avastus tõstatab huvitava võimaluse, et isegi praegusel hetkel võivad need rakud saada terapeutilist sekkumist neurodegeneratsiooni edasilükkamiseks või ennetamiseks. Lahendasime selle võimaluse kahe sõltumatu sekkumise abil. Esimeses meetodis konstrueerisime Cre-sõltuva adeno-assotsieerunud viiruse (AAV) vektori, et MFN2 saaks selektiivselt ekspresseerida OXPHOS-defitsiitsetes PN-rakkudes in vivo (joonis S7A). MFN2-d kodeeriv AAV ja fluorestseeruv reportergeen mCherry (Mfn2-AAV) kontrolliti primaarsete neuronite kultuurides in vitro, mis põhjustas MFN2 ekspressiooni Cre-sõltuval viisil ja taastas mitokondriaalse morfoloogia, ennetades seeläbi neuromutatsiooni Mfn2cKO neuronites (joonis S7, B, D ja E). Järgmisena viisime läbi in vivo katseid, et stereotaktiliselt manustada 8-nädalast Mfn2-AAV-d Mfn2cKO ja kontrollhiirte väikeajukoorde ning analüüsisime 12-nädalaseid hiiri (joonis 4A). Töödeldud Mfn2cKO hiired surid (joonis 1, A ja B) (16). Viiruse transduktsioon in vivo andis tulemuseks PN-i selektiivse ekspressiooni mõnedes väikeaju ringides (joonis S7, G ja H). Ainult mCherryt ekspresseeriva kontroll-AAV (Ctrl-AAV) süstimine ei avaldanud Mfn2cKO loomade neurodegeneratsiooni astmele olulist mõju. Seevastu Mfn2-AAV-ga transdutseeritud Mfn2cKO-de analüüs näitas PN-rakkude kihi olulist kaitsvat toimet (joonis 4, B ja C). Eelkõige tundub neuronite tihedus olevat kontroll-loomadest peaaegu eristamatu (joonis 4, B ja C ning joonis S7, H ja I). MFN1, kuid mitte MFN2 ekspressioon on neuronite surma peatamisel võrdselt efektiivne (joonis 4C ja joonis S7, C ja F), mis näitab, et ektoopilise MFN1 ekspressioon suudab tõhusalt kompenseerida MFN2 puudumist. Edasine analüüs üksiku PN tasandil näitas, et Mfn2-AAV taastas suures osas mitokondrite ultrastruktuuri, normaliseeris mtDNA tasemed ja pööras angiogeneesi vastase markeri PCx ​​kõrge ekspressiooni tagasi (joonis 4, C kuni E). Päästetud Mfn2cKO hiirte visuaalne kontroll puhkeolekus näitas, et nende rüht ja motoorsed sümptomid (liigutused S1 kuni S3) olid paranenud. Kokkuvõttes näitavad need katsed, et MFN2 hilinenud taaskehtestamine OXPHOS-i raske puudulikkusega PN-idesse on piisav mtDNA tarbimise tagasipööramiseks ja ateroskleroosi esilekutsumiseks, ennetades seeläbi aksonite degeneratsiooni ja neuronite surma in vivo.
(A) Skeem, mis näitab MFN2 kodeeriva AAV süstimise eksperimentaalset ajakava, kui näidatud metaboolne rada on aktiveeritud. (B) 12-nädalaste väikeajulõigude representatiivsed konfokaalsed pildid, mis on transdutseeritud 8. nädalal Mfn2cKO hiirtele ja märgistatud anti-Calbindin antikehaga. Paremal: Aksonkiudude skaleerimine. Aksonisuumi skaala on 450 ja 75 μm. (C) Vasakul: Purkinje rakkude tiheduse kvantifitseerimine AAV transduktsiooniahelas (AAV+) (ühesuunaline dispersioonanalüüs; n = 3 hiirt). Paremal: mtDNA fookuse analüüs transdutseeritud PN-is 12. nädalal (paaritu t-test; n = 6 rakku kolmelt hiirelt). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Näidatud viirusvektoritega transdutseeritud Mfn2cKO väikeajulõikude PN-ide representatiivsed transmissioon-elektronmikroskoobid. Roosa mask illustreerib dendriitide poolt hõivatud ala ja kollane punktiirjoontega ruut illustreerib paremal olevat suumi; n tähistab tuuma. Skaalariba, 1 μm. (E) näitab PCx värvumise näidet PN-is, mis on transdutseeritud 12. nädalal. Skaalariba, 20 μm. OE, üleekspressioon; FC, muutus kordades.
Lõpuks uurisime peroksidaasi poolt indutseeritud rakkude ellujäämise olulisust PN-ides, millel on esinenud OXPHOS-i düsfunktsioon. Genereerisime mCherry, mis kodeerib AAV-shRNA-d (lühikese juuksenõela RNA), mis on spetsiifiliselt suunatud hiire PCx mRNA-le (AAV-shPCx), ja süstisime viiruse või selle segatud kontrolli (AAV-scr) Mfn2cKO hiirte väikeajusse. Süst tehti neljandal elunädalal (joonis 5A), et saavutada efektiivne PCx vaigistamine perioodil, mil PCx ekspressioon suurenes (joonis 3C) ja PN-rakkude kiht oli veel terve (joonis 1A). Väärib märkimist, et PCx vaigistamine (joonis S8A) viib PN-surma olulise kiirenemiseni, mis piirdub nakatunud ringiga (joonis 5, B ja C). PCx ülesreguleerimise poolt esilekutsutud metaboolsete efektide mehhanismi mõistmiseks uurisime PN-ide redoksseisundit pärast PCx ​​väljalülitamist ja AAV-vahendatud optilise biosensori Grx1-roGFP2 samaaegset ekspresseerimist (joonis S8, B kuni D), et hinnata glutatiooni peptiidi redokspotentsiaali suhtelist muutust (38). Seejärel viisime läbi kahe footoni fluorestsentsi eluaegse pildistamise mikroskoopia (FLIM) 7-nädalaste Mfn2cKO või kontrollpesakonnakaaslaste ägedates ajulõikudes, et tuvastada tsütoplasmaatilise redoksseisundi võimalikke muutusi pärast FLIM-tingimuste kontrollimist (joonis S8, E kuni G). Analüüs näitas ühe PCx ekspressioonita Mfn2cKO PN-i oksüdatsiooniseisundi olulist suurenemist, mis erineb kontrollneuronitest või ainult segatud shRNA-d ekspresseerivatest Mfn2cKO PN-idest (joonis 5, D ja E). Kui PCx ekspressioon oli alla reguleeritud, suurenes Mfn2cKO PN-ide osakaal, millel oli väga oksüdeerunud olek, rohkem kui kolm korda (joonis 5E), mis näitab, et PCx ülesreguleerimine säilitas degenereerunud neuronite redoksvõime.
(A) Skeem, mis näitab shPCx-i kodeeriva AAV süstimise eksperimentaalset ajakava, kui näidatud metaboolne rada on aktiveeritud. (B) 8-nädalaste Mfn2cKO hiirte väikeajuosa lõikude representatiivsed konfokaalsed fotod, mis on transdutseeritud ja märgistatud kaltsineuriinivastase antikehaga 4. nädalal. Skaalariba, 450 μm. (C) Purkinje rakkude tiheduse kvantifitseerimine AAV-transdutseeritud silmustes (ühesuunaline dispersioonanalüüs; n = 3 kuni 4 hiirt). Andmed on väljendatud keskmisena ± SEM; ***P < 0,001. (D) Representatiivne FLIM-pilt näitab 7-nädalaste glutatiooni redokssensorit Grx1-roGFP2 ekspresseerivate PN-ide keskmist eluiga kindlaksmääratud katsetingimustes. LUT (otsingutabel) suhe: ellujäämisaja intervall (pikosekundites). Skaalariba, 25 μm. (E) Histogramm näitab Grx1-roGFP2 eluea väärtuste jaotust (D)-st (n = 158 kuni 368 rakku kahel hiirel igas seisundis). Iga histogrammi kohal olev sektordiagramm näitab oluliselt pikema (punane, oksüdeeritud) või lühema (sinine, lühenenud) eluea väärtustega rakkude arvu, mis ületavad 1 standardhälbe CTRL-AAV-scr keskmise eluea väärtusest. (F) Kavandatud mudel näitab neuronaalse PCx ülesreguleerimise kaitsvat toimet.
Kokkuvõttes näitavad meie esitatud andmed, et MFN2 taasekspressioon suudab täielikult päästa kaugelearenenud perifeerse neuropaatia, millel on raske OXPHOS-i puudulikkus, raske mtDNA vähenemine ja äärmiselt ebanormaalne ista-sarnane morfoloogia, tagades seeläbi pideva progresseerumise isegi kaugelearenenud haiguste korral. Neurodegeneratsioon annab pöörduvaid tõendeid staadiumist enne rakusurma. Seda metaboolse paindlikkuse astet rõhutab veelgi neuronite võime indutseerida ateroskleroosi (TCA tsükli ümberprogrammeerimine), mis pärsib PCx ekspressiooni OXPHOS-i puuduvates perifeersetes rakkudes ja suurendab rakkude surma, mängides seeläbi kaitsvat rolli (joonis 5F).
Selles uuringus esitasime tõendeid selle kohta, et PN-ide vastus OXPHOS-i düsfunktsioonile on järkjärguline lähenemine TCA tsükli ateroskleroosile metaboolsete programmide poolt aktiveeritud diferentsiaalse aktivatsiooniraja kaudu. Kinnitasime proteoomilise analüüsi paljude täiendavate meetoditega ja selgus, et raske mitokondriaalse düsfunktsiooni korral on neuronitel seni tundmatu metaboolne elastsus. Meie üllatuseks ei tähista kogu ümberprogrammeerimisprotsess tingimata neurodegeneratsiooniga järk-järgult ja pöördumatult kaasnevat terminaalset metaboolset seisundit, kuid meie andmed viitavad sellele, et see võib moodustada säilitusneuroni isegi enne rakusurma staadiumis funktsionaalse kompensatsioonimehhanismi kaudu. See leid näitab, et neuronitel on organismis märkimisväärne metaboolne plastilisus. See fakt tõestab, et MFN2 hilisem taaskehtestamine võib pöörata tagasi peamiste metaboolsete markerite ekspressiooni ja ennetada PN-i degeneratsiooni. Vastupidi, see pärsib ateroskleroosi ja kiirendab närvide tööd.
Üks meie uurimistöö kõige põnevamaid tulemusi on see, et OXPHOS-i puuduvad perifeersed närvirakud (PN-id) võivad muuta TCA tsükli metabolismi, ülesreguleerides ensüüme, mis spetsiifiliselt stimuleerivad arterioskleroosi. Ainevahetuslik ümberkorraldus on vähirakkude tavaline tunnus, millest mõned tuginevad glutamiinile TCA tsükli vaheühendite täiendamiseks redutseerivate ekvivalentide tootmiseks, mis juhivad hingamisahelat ja säilitavad lipiidide ja nukleotiidide biosünteesi eellaste tootmist (39, 40). Hiljutine uuring näitas, et OXPHOS-i düsfunktsiooniga perifeersetes kudedes on glutamiini/glutamaadi metabolismi taasühendumine samuti oluline tunnus (5, 41), kus glutamiini sisenemise suund TCA tsüklisse sõltub OXPHOS-i kahjustuse raskusastmest (41). Siiski puuduvad selged tõendid neuronaalse metaboolse plastilisuse sarnasuse ja selle võimaliku olulisuse kohta haiguse kontekstis. Hiljutises in vitro uuringus näidati, et primaarsed kortikaalsed neuronid mobiliseerivad glutamaadi varusid neurotransmissiooniks, soodustades seeläbi oksüdatiivset metabolismi ja ateroskleroosi metaboolse stressi tingimustes (42). Väärib märkimist, et TCA tsükli ensüümi suktsinaatdehüdrogenaasi farmakoloogilise inhibeerimise korral arvatakse, et püruvaatkarboksüleerimine säilitab oksaloatsetaadi sünteesi kultiveeritud väikeaju graanulite neuronites (34). Siiski on nende mehhanismide füsioloogiline olulisus ajukoes (kus ateroskleroos arvatakse piirduvat peamiselt astrotsüütidega) endiselt oluline (43). Antud juhul näitavad meie andmed, et OXPHOS-i poolt organismis kahjustatud närvirakud (PN-id) võivad lülituda BCAA lagundamise ja püruvaatkarboksüleerimise suunas, mis on kaks peamist TCA vaheühendite täiendamise allikat. Kuigi on pakutud välja BCAA katabolismi oletatav panus neuronaalsesse energia metabolismi, lisaks glutamaadi ja GABA rollile neurotransmissioonis (44), puuduvad nende mehhanismide kohta in vivo endiselt tõendid. Seetõttu on lihtne oletada, et düsfunktsionaalsed PN-id saavad automaatselt kompenseerida assimilatsiooniprotsessi poolt juhitud TCA vaheühendite tarbimist, suurendades ateroskleroosi. Eelkõige võib PCx ülesreguleerimine olla vajalik asparagiinhappe suurenenud nõudluse säilitamiseks, mida soovitatakse mitokondriaalse düsfunktsiooniga prolifereeruvates rakkudes (45). Meie metaboloomika analüüs ei näidanud aga Mfn2cKO PN-ide asparagiinhappe püsiseisundi taseme olulisi muutusi (joonis S6A), mis arvatavasti peegeldab asparagiinhappe erinevat metaboolset kasutamist prolifereeruvate rakkude ja postmitootiliste neuronite vahel. Kuigi PCx ülesreguleerimise täpne mehhanism düsfunktsionaalsetes neuronites in vivo on veel iseloomustamata, näitasime, et see enneaegne reaktsioon mängib olulist rolli neuronite redoksseisundi säilitamisel, mida demonstreeriti FLIM-katsetes väikeaju viiludel. Eelkõige võib PN-ide PCx ülesreguleerimise takistamine viia oksüdeerituma olekuni ja kiirendada rakkude surma. BCAA lagunemise aktiveerimine ja püruvaadi karboksüülimine ei ole viisid mitokondriaalse düsfunktsiooniga perifeersete kudede iseloomustamiseks (7). Seetõttu tunduvad need olevat OXPHOS-defitsiitsete neuronite prioriteetne omadus, isegi kui mitte ainus omadus, mis on oluline neurodegeneratsiooni jaoks.
Tserebellaarne haigus on heterogeenne neurodegeneratiivse haiguse tüüp, mis avaldub tavaliselt ataksia vormis ja kahjustab sageli perifeerseid närvirakke (PN-e) (46). See neuronite populatsioon on eriti haavatav mitokondriaalse düsfunktsiooni suhtes, kuna nende selektiivne degeneratsioon hiirtel on piisav, et paljuneda paljusid motoorseid sümptomeid, mis iseloomustavad inimese spinotserebellaarset ataksiat (16, 47, 48). Aruannete kohaselt seostatakse mutantse geeniga transgeenset hiiremudelit inimese spinotserebellaarse ataksiaga ja sellel on mitokondriaalne düsfunktsioon (49, 50), mis rõhutab OXPHOS-i puudulikkuse tagajärgede uurimise olulisust PNPH-s. Seetõttu on see eriti sobiv selle ainulaadse neuronite populatsiooni tõhusaks isoleerimiseks ja uurimiseks. Arvestades aga, et PN-id on rõhu suhtes väga tundlikud ja moodustavad väikese osa kogu väikeaju rakkude populatsioonist, on paljude oomika-põhiste uuringute jaoks nende selektiivne eraldamine tervete rakkudena endiselt keeruline aspekt. Kuigi teiste rakutüüpide (eriti täiskasvanud kudede) absoluutse saastumise puudumise saavutamine on peaaegu võimatu, kombineerisime efektiivse dissotsiatsioonietapi FACS-iga, et saada piisav arv elujõulisi neuroneid allavoolu proteoomika analüüsiks ja saavutada üsna kõrge valgusisaldus (umbes 3000 valku) võrreldes kogu väikeaju olemasoleva andmekogumiga (51). Säilitades tervete rakkude elujõulisuse, võimaldab siin pakutav meetod meil kontrollida mitte ainult mitokondrite metaboolsete radade muutusi, vaid ka nende tsütoplasmaatiliste vastete muutusi, mis täiendab mitokondriaalsete membraanmärgiste kasutamist rakutüübi rikastamiseks. Uus meetod mitokondrite arvu määramiseks keerukates kudedes (52, 53). Meie kirjeldatud meetod ei ole seotud ainult Purkinje rakkude uurimisega, vaid seda saab hõlpsasti rakendada mis tahes tüüpi rakkudele, et käsitleda metaboolseid muutusi haigestunud ajus, sealhulgas teisi mitokondriaalse düsfunktsiooni mudeleid.
Lõpuks oleme tuvastanud selle metaboolse ümberkorralduse protsessi käigus terapeutilise akna, mis suudab täielikult tagasi pöörata rakulise stressi peamised tunnused ja ennetada neuronite degeneratsiooni. Seega võib siin kirjeldatud ümberkorralduse funktsionaalsete tagajärgede mõistmine anda põhjaliku ülevaate võimalikest ravimeetoditest neuronite elujõulisuse säilitamiseks mitokondriaalse düsfunktsiooni ajal. Selle põhimõtte rakendatavuse täielikuks selgitamiseks teiste neuroloogiliste haiguste korral on vaja edasisi uuringuid, mille eesmärk on analüüsida energia metabolismi muutusi teistes ajurakkude tüüpides.
MitoParki hiiri on varem kirjeldatud (31). C57BL/6N hiiri, kellel on loxP külgnevad Mfn2 geenid, on varem kirjeldatud (18) ja neid on ristatud L7-Cre hiirtega (23). Saadud topeltheterosügootsed järglased ristati seejärel homosügootsete Mfn2loxP/Mfn2loxP hiirtega, et genereerida Purkinje-spetsiifilised Mfn2 geeni väljalülitusgeenid (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Paaritumiste alamhulgas viidi täiendavate ristamiste kaudu sisse Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP alleel (stop-mtYFP) (20). Kõik loomadega tehtavad protseduurid viidi läbi vastavalt Euroopa, riiklikele ja institutsionaalsetele suunistele ning need kiideti heaks LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen, Saksamaa. Loomkatsed järgivad ka Euroopa Laboriloomade Teaduste Assotsiatsioonide Föderatsiooni juhiseid.
Pärast raseda naise kaelanihestuse tuimestamist isoleeritakse hiireembrüo (E13). Ajukoor lõigati lahti Hanksi tasakaalustatud soolalahuses (HBSS), millele oli lisatud 10 mM Hepes'i, ja seejärel viidi Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmesse, mis sisaldas papaiini (20 U/ml) ja tsüsteiini (1 μg/ml). Kude inkubeeriti DMEM-is (Ml) ja dissotsieeriti ensümaatilise seedimise teel temperatuuril 37 °C 20 minutit ning seejärel jahvatati mehaaniliselt DMEM-is, millele oli lisatud 10% loote veise seerumit. Rakud külvati polülüsiiniga kaetud klaasist katteklaasidele tihedusega 2 × 106 6 cm kultuurinõu kohta või tihedusega 0,5 × 105 rakku/cm2 pildianalüüsiks. 4 tunni pärast asendati sööde seerumivaba Neurobasal söötmega, mis sisaldas 1% B27 lisandit ja 0,5 mM GlutaMaxi. Seejärel hoiti neuroneid kogu katse vältel temperatuuril 37 °C ja 5% CO2 juures ning neid toideti üks kord nädalas. Rekombinatsiooni esilekutsumiseks in vitro kasutati neuronite töötlemiseks teisel päeval in vitro 3 μl (24-süvendilise kultuurinõu jaoks) või 0,5 μl (24-süvendilise plaadi jaoks) järgmist AAV9 viirusvektorit: AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, katalooginumber 105530-AAV9) ja AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, katalooginumber 105545-AAV9).
Hiire Mfn1 ja Mfn2 komplementaarne DNA (saadud vastavalt Addgene plasmiididest #23212 ja #23213) on C-otsas tähistatud V5 järjestusega (GKPIPNPLLGLDST) ja on T2A järjestuse kaudu raamis ühendatud mCherryga. Grx1-roGFP2 on kingitus Heidelberg TP Dick DFKZ-lt (Deutsches Krebsforschungszentrum). Asendades tdTomato kasseti tavapäraste kloonimismeetodite abil, subklooniti kassett pAAV-CAG-FLEX-tdTomato karkassi (Addgene viitenumber 28306), et genereerida vektorid pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 ja pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Sarnast strateegiat kasutati kontrollvektori pAAV-CAG-FLEX-mCherry genereerimiseks. AAV-shPCx konstruktsiooni genereerimiseks on vaja plasmiidi AAV vektorit (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), mis sisaldab hiire PCx-i sihtivat shRNA-d kodeerivat DNA järjestust (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). U6 promootori kontrolli all kasutatakse mCherryt CMV promootori kontrolli all. Abivektorite tootmine viidi läbi vastavalt tootja juhistele (Cell Biolabs). Lühidalt, kasutage ülekandeplasmiidi, mis kannab mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) kodeerivat geeni, samuti AAV1 kapsiidvalku ja abivalku kodeerivat pakkimisplasmiidi plasmiidi kaltsiumfosfaadi meetodil. Toorviiruse supernatant saadi külmutus-sulatamistsüklitega kuivjää/etanooli vannis ja rakud lüüsiti fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS). AAV-vektor puhastati katkendliku jodiksanooli gradiendiga ultratsentrifuugimise teel (24 tundi kiirusel 32 000 p/min ja temperatuuril 4 °C) ning kontsentreeriti Amicon ultra-15 tsentrifugaalfiltri abil. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9 × 1013 genoomi koopiat (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1 × 1012 GC/ml) ja AAV1-CAG-FLEX genoomi tiiter oli eelnevalt kirjeldatud (54) järgi, mõõdetuna reaalajas kvantitatiivse PCR-i (qPCR) abil -MFN1-V5 (1,9 × 1013 GC/ml) ja AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9 × 1012 GC/ml).
Primaarsed neuronid kraabiti jääkülmas 1x PBS-is ära, timmeeriti ja homogeniseeriti seejärel 0,5% Triton X-100 / 0,5% naatriumdeoksükolaadi/PBS-i lüüsipuhvris, mis sisaldas fosfataasi ja proteaasi inhibiitorit (Roche). Valkude kvantifitseerimine viidi läbi bitsinkoniinhappe testi abil (Thermo Fisher Scientific). Seejärel eraldati valgud SDS-polüakrüülamiidgeelelektroforeesil ja seejärel blotiti polüvinülideenfluoriidmembraanile (GE Healthcare). Blokeerige mittespetsiifilised kohad ja inkubeerige primaarse antikehaga (üksikasjad vt tabelist S1) 5% piimas TBST-s (Tris-puhverdatud soolalahus Tweeniga), pesemisetapid ja sekundaarne antikeha TBST-s. Inkubeerige. Inkubeerige primaarse antikehaga üleöö temperatuuril +4 °C. Pärast pesemist kandke sekundaarne antikeha 2 tunniks toatemperatuuril. Seejärel, inkubeerides sama blotti anti-β-aktiini antikehaga, kinnitati sama laadimist. Detekteerimine kemoluminestsentsiks konverteerimise ja kemoluminestsentsi võimendamise teel (GE Healthcare).
Eelnevalt klaasist katteklaasidele külvatud neuronid fikseeriti kindlaksmääratud ajahetkel toatemperatuuril 10 minutit 4% paraformaldehüüdi (PFA)/PBS-iga. Katteklaasid läbistatakse esmalt 5 minutit toatemperatuuril 0,1% Triton X-100/PBS-iga ja seejärel blokeerimispuhvris [3% veise seerumi albumiin (BSA)/PBS]. Teisel päeval pesti katteklaase blokeerimispuhvriga ja inkubeeriti sobiva fluorofooriga konjugeeritud sekundaarse antikehaga 2 tundi toatemperatuuril; lõpuks pesti proove põhjalikult PBS-is, millele oli lisatud 4',6-diamidino-2-fenüülindooli (DAPI), värviti kontrastvärviga ja seejärel fikseeriti mikroskoobislaidile Aqua-Poly/Mount abil.
Hiired (isased ja emased) tuimestati ketamiini (130 mg/kg) ja ksülasiini (10 mg/kg) intraperitoneaalse süstimise teel ning seejärel manustati naha alla karprofeeni valuvaigistit (5 mg/kg) ja asetati soojenduspadjaga varustatud stereotaktilisse instrumenti (Kopf). Kolju paljastati ja hambapuuriga õhendati väikeajukoore osa, mis vastab luukesele (lambdast: saba 1.8, lateraalne 1, mis vastab lobulitele IV ja V). Kumera süstlanõelaga tehti ettevaatlikult kolju sisse väike auk, et vältida allpool oleva veresoonkonna kahjustamist. Seejärel sisestati õhuke tõmmatud klaasist kapillaar aeglaselt mikroauku (dura mater'i ventraalsel küljel -1.3 kuni -1) ja mikroinjektorisse (Narishige) süstiti käsitsi süstaldega (Narishige) mitu korda madalal rõhul 200–300 nl AAV-d käsitsi süstaldega (Narishige) 10–20 minuti jooksul mitu korda madalal rõhul. Pärast infusiooni asetage kapillaar veel 10 minutiks haava, et viirus saaks täielikult levida. Pärast kapillaaride eemaldamist õmmeldakse nahk ettevaatlikult kinni, et minimeerida haavapõletikku ja võimaldada loomal taastuda. Loomi raviti pärast operatsiooni mitu päeva valuvaigistitega (kaspofeen), mille jooksul jälgiti hoolikalt nende füüsilist seisundit ja seejärel eutaneeriti nad ettenähtud ajal. Kõik protseduurid viidi läbi vastavalt Euroopa, riiklikele ja institutsionaalsetele suunistele ning need kiitis heaks LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen, Saksamaa.
Loomad tuimestati ketamiini (100 mg/kg) ja ksülasiiniga (10 mg/kg) ning südant perfundeeriti esmalt 0,1 M PBS-iga ja seejärel 4% PFA-ga PBS-is. Kude dissekteeriti ja fikseeriti 4% PFA/PBS-is üleöö temperatuuril 4 °C. Fikseeritud ajust PBS-is valmistati sagitaalsed sektsioonid (50 μm paksused) vibreeriva nuga abil (Leica Microsystems GmbH, Viin, Austria). Kui ei ole teisiti täpsustatud, värviti vabalt ujuvaid sektsioonid toatemperatuuril ja segades nagu eespool kirjeldatud (13). Lühidalt, esmalt permeabiliseeriti saadud viile 0,5% Triton X-100/PBS-iga 15 minutit toatemperatuuril; mõnede epitoopide (Pcx ja Shmt2) puhul kuumutati viile 25 minutit tris-EDTA puhvris temperatuuril 80 °C (PH 9) selle etapi asemel. Seejärel inkubeeriti lõike primaarse antikehaga (vt tabel S1) blokeerimispuhvris (3% BSA/PBS) temperatuuril 4 °C üleöö segades. Järgmisel päeval pesti lõike blokeerimispuhvriga ja inkubeeriti sobiva fluorofooriga konjugeeritud sekundaarse antikehaga 2 tundi toatemperatuuril; lõpuks pesti lõike põhjalikult PBS-is, värviti DAPI-ga ja fikseeriti seejärel AquaPolymount'iga mikroskoobislaidil.
Proovi pildistamiseks kasutati laserskaneerivat konfokaalset mikroskoopi (TCS SP8-X või TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems), mis oli varustatud valge valguslaseri ja 405 dioodultraviolettlaseriga. Fluorofoori ergastamiseks ja signaali kogumiseks hübriiddetektoriga (HyDs) kasutati LAS-X tarkvara, et koguda Nyquisti valimile vastavaid virnastatud kujutisi järjestikuses režiimis: mittekvantitatiivsete paneelide puhul on tegemist väga dünaamiliste signaalidega (näiteks somaatilistes rakkudes ja dendriitides) (mtYFP). HyD abil tuvastatakse PN-ide arv BrightR režiimis. Tausta vähendamiseks rakendatakse väravdamist vahemikus 0,3 kuni 6 ns.
Sorteeritud rakkude reaalajas pildistamine. Pärast sorteerimist Neurobasal-A söötmes, mis sisaldas 1% B27 lisandit ja 0,5 mM GlutaMaxi, külvati rakud kohe polü-L-lüsiiniga kaetud klaasslaididele (μ-Slide8 Well, Ibidi, katalooginumber 80826) ja seejärel hoiti neid temperatuuril 37 °C ja 5% CO2 juures 1 tund, et lasta rakkudel settida. Reaalajas pildistamine viidi läbi Leica SP8 laserskaneeriva konfokaalse mikroskoobiga, mis oli varustatud valge laseri, HyD, 63×[1,4 numbrilise apertuuriga (NA)] õliobjektiivi ja kuumutuslauaga.
Hiir tuimestati kiiresti süsinikdioksiidiga ja dekapiteeriti, aju eemaldati kiiresti koljult ja lõigati 200 μm paksuseks (13C-märgistamise katse jaoks) või 275 μm paksuseks (kahe footonikatse jaoks) sagitaalseks sektsiooniks, mis täideti järgmiste materjalidega. Jäätis (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Saksamaa) täideti järgmiste ainetega: 125 mM jääkülma, süsinikuga küllastunud (95% O2 ja 5% CO2) madala Ca2 sisaldusega + kunstlikku tserebrospinaalvedelikku (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM naatriumfosfaatpuhvrit, 25 mM NaHCO3, 25 mM glükoosi, 0,5 mM CaCl2 ja 3,5 mM MgCl2 (osmootne rõhk 310 kuni 330 mmol). Viige saadud ajukiilud eelinkubatsioonikambrisse, mis sisaldab kõrgema Ca2 sisaldusega ACSF-i (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM naatriumfosfaatpuhver, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glükoos, 1,0 mM CaCl2 ja 2,0 mM MgCl2), pH 7,4 ja kontsentratsioon 310–320 mmol.
Pildistamisprotsessi käigus viidi viilud spetsiaalsesse pildistusruumi ja katse viidi läbi pideva ACSF-i perfusiooni all konstantsel temperatuuril 32–33 °C. Viilude pildistamiseks kasutati multifootonilist laserskaneerivat mikroskoopi (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems), mis oli varustatud Leica 25x objektiiviga (NA 0,95, vesi) ja Ti:Safiirlaseriga (Chameleon Vision II, Coherent). FLIM-moodul (PicoHarp300, PicoQuant).
Grx1-roGFP2 FLIM. PN-ide tsütoplasmaatilise redoksseisundi muutusi mõõdeti kahefootonilise FLIM-iga sagitaalsetes ajulõikudes, kus Grx1-roGFP2 biosensor oli suunatud PN-idele. PN-kihis valitakse registreerimisväli umbes 50–80 μm viilu pinnast allpool, et tagada elujõulise PN-i olemasolu (st pärlstruktuuri või neuronaalsete morfoloogiliste muutuste puudumine dendriitide ääres) ning topeltpositiivse roGFP2 anduri ja shRNA PCx-i või selle kontrolljärjestust kodeeriva AAV olemasolu (mõlemad ekspresseerivad koos mCherry'ga). Koguge ühe virna pilte 2x digitaalse suumiga [ergastuslainepikkus: 890 nm; 512 nm 512 pikslit]. Detekteerimine: sisemine HyD, fluorestseiinisotiotsüanaadi (FITC) filtrirühm ja piltide keskmistamine 2–3 minuti jooksul, et tagada piisava footonite kogumine (kokku 1000 footonit) kõvera sobitamiseks. Grx1-roGFP2 sondi tundlikkust ja FLIM tingimuste kontrollimist uuriti roGFP2 eluea väärtuse jälgimisega, kui perfusiooni-ACSF-ile lisati eksogeenset 10 mM H2O2 (oksüdatsiooni maksimeerimiseks, mille tulemuseks on eluea pikenemine) ja seejärel lisati 2 mM ditiotreitooli (minimeerib redutseerimise astet, mille tulemuseks on eluea lühenemine) (joonis S8, D kuni G). Saadud tulemuste analüüsimiseks kasutati FLIMfit 5.1.1 tarkvara, kogu pildi ühe eksponentsiaalse lagunemiskõvera sobitamiseks mõõdetud IRF-iga (instrumendi vastusfunktsioon) sai tulemuseks χ2, mis on ligikaudu 1. Ühe PN-i eluea arvutamiseks joonistati käsitsi mask närvikeha ümber ja kvantifitseerimiseks kasutati iga maski keskmist eluiga.
Mitokondriaalse potentsiaali analüüs. Pärast ägeda sektsiooni inkubeerimist 30 minuti jooksul perfuseeritud ACSF-ile otse lisatud 100 nM TMRM-iga mõõdeti PN-ide mitokondriaalse potentsiaali muutusi kahefootonilise mikroskoobi abil. TMRM-kuvamine viidi läbi sondi ergastamisel 920 nm juures ja signaalide kogumiseks sisemise HyD (tetrametüül-rodamiinisotiotsüanaat: 585/40 nm) abil; kasutades sama ergastuslainepikkust, kuid erinevat sisemist HyD-d (FITC: 525/50) mtYFP kuvamiseks. Mitokondriaalse potentsiaali hindamiseks üksikrakkude tasandil kasutage ImageJ Image Calculator pluginat. Lühidalt, plugina võrrandit: signaal = min (mtYFP, TMRM) kasutatakse mitokondriaalse piirkonna tuvastamiseks, mis näitab Purkinje somaali keeles TMRM-signaali vastava kanali ühekihilisel konfokaalsel pildil. Seejärel kvantifitseeritakse saadud maski pikslite pindala ja normaliseeritakse see mtYFP kanali vastava läviväärtusega ühekihilisel pildil, et saada mitokondriaalne fraktsioon, mis näitab mitokondriaalset potentsiaali.
Pilt dekonvolutsiooniti Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) tarkvaraga. Plaatide skannitud piltide puhul tehakse üksiku plaadi montaaž LAS-X tarkvara automaatse liitmisalgoritmi abil. Pärast pildi kalibreerimist kasutage pildi edasiseks töötlemiseks ja heleduse ja kontrastsuse ühtlaseks reguleerimiseks ImageJ ja Adobe Photoshopi. Graafilise ettevalmistuse jaoks kasutage Adobe Illustratorit.
mtDNA fookusanalüüs. mtDNA kahjustuste arv kvantifitseeriti DNA-vastaste antikehadega märgistatud väikeaju lõikudel konfokaalse mikroskoobi abil. Iga sihtala loodi iga raku keha ja tuuma jaoks ning vastav pindala arvutati Multi Measure plugina (ImageJ tarkvara) abil. Tsütoplasmaatilise pindala saamiseks lahutati tuuma pindala raku keha pindalast. Lõpuks kasutati Analyze Particles pluginat (ImageJ tarkvara), et automaatselt kvantifitseerida tsütoplasmaatilise DNA punkte, mis näitavad mtDNA-d läviväärtuse pildil, ja saadud tulemused normaliseeriti CTRL hiirte PN-keskmise suhtes. Tulemused on väljendatud nukleosiidide keskmise arvuna raku kohta.
Valgu ekspressiooni analüüs. Kasutage ImageJ Image Calculator pluginat, et hinnata valgu ekspressiooni PN-is üksiku raku tasandil. Lühidalt, vastava kanali ühekihilises konfokaalses pildis identifitseeritakse valemi signaal = min (mtYFP, antikeha) abil mitokondriaalne piirkond, mis näitab immunoreaktiivsust teatud Purkina antikeha suhtes. Seejärel kvantifitseeritakse saadud maski pikslipind ja normaliseeritakse seejärel mtYFP kanali vastava läviväärtusega ühekihilise pildi põhjal, et saada kuvatava valgu mitokondriaalne fraktsioon.
Purkinje rakkude tiheduse analüüs. Purkinje tiheduse hindamiseks kasutati ImageJ Cell Counter pluginat, jagades loendatud Purkinje rakkude arvu loendatud rakkude poolt hõivatud väikeaju rõnga pikkusega.
Proovi ettevalmistamine ja kogumine. Kontrollrühma ja Mfn2cKO hiirte ajud fikseeriti 2% PFA/2,5% glutaraldehüüdis 0,1 M fosfaatpuhvris (PB) ja seejärel valmistati koronaalsed lõigud ripsloomade abil (Leica Mikrosysteme GmbH, Viin, Austria) (paksus 50–60 μm). Seejärel fikseeriti PB-puhvris 1% os tetraoksiidis ja 1,5% kaaliumferrotsüaniidis toatemperatuuril 1 tund. Lõike pesti kolm korda destilleeritud veega ja värviti seejärel 70% etanooliga, mis sisaldas 1% uranüülatsetaati, 20 minutit. Seejärel dehüdreeriti lõigud gradueeritud alkoholis ja asetati silikoonkattega klaasslaidide vahele Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoksüvaiku (Electron Microscopy Sciences, katalooginumber 14040) ning lõpuks polümeriseeriti ahjus 60 °C juures 48 tundi. Väikeajukoore piirkond valiti välja ja Leica Ultracuti (Leica Mikrosysteme GmbH, Viin, Austria) abil lõigati 50 nm paksused üliõhukesed lõigud, mis kaeti polüstüreenkilega kaetud 2×1 mm vaskvõrgust. Lõike värviti 4% uranüülatsetaadi lahusega vees 10 minutit, pesti mitu korda veega, seejärel Reynoldsi pliitsitraadi lahusega vees 10 minutit ja seejärel pesti mitu korda veega. Mikrofotod tehti transmissioon-elektronmikroskoobiga Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), kasutades TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 digitaalkaamerat (TVIPS GmbH, Gauting, USA, Saksamaa).
AAV-ga nakatatud hiirtel eraldati aju ja lõigati see 1 mm paksuseks sagitaalseks lõiguks ning väikeaju uuriti fluorestsentsmikroskoobi abil, et tuvastada AAV-ga nakatatud ring (st mCherryt ekspresseeriv). Kasutatakse ainult katseid, kus AAV süstimine annab tulemuseks Purkinje rakkude kihi (st peaaegu kogu kihi) väga kõrge transduktsiooniefektiivsuse vähemalt kahes järjestikuses väikeaju rõngas. AAV-ga transdutseeritud silmus mikrodissekteeriti üleöö pärast fikseerimist (4% PFA ja 2,5% glutaraldehüüd 0,1 M kokoaatpuhvris) ja töödeldi edasi. EPON-i manustamiseks pesti fikseeritud kude 0,1 M naatriumkokoaatpuhvriga (Applichem) ja inkubeeriti 2% OsO4-ga (os, Science Services; Caco) 0,1 M naatriumkokoaatpuhvris (Applichem) 4 tundi, seejärel pesti 2 tundi. Korda 3 korda 0,1 M kokamiidpuhvriga. Seejärel inkubeeriti iga etanoolilahust 15 minutit temperatuuril 4 °C, kasutades etanooli tõusvat seeriat, et koed dehüdreerida. Kude viidi propüleenoksiidi ja inkubeeriti üleöö EPON-is (Sigma-Aldrich) temperatuuril 4 °C. Asetage kude 2 tunniks värskesse EPON-i toatemperatuurile ja seejärel manustage see 72 tunniks temperatuurile 62 °C. Kasutage ultramikrotoomi (Leica Microsystems, UC6) ja teemantnuga (Diatome, Biel, Šveits), et lõigata 70 nm üliõhukesed lõigud ning värvida 1,5% uranüülatsetaadiga 15 minutit temperatuuril 37 °C ja seejärel 4 minutit pliitsitraadi lahusega. Elektronmikroskoobid tehti JEM-2100 Plus transmissioon-elektronmikroskoobi (JEOL) abil, mis oli varustatud Camera OneView 4K 16-bitise (Gatan) ja DigitalMicrograph tarkvaraga (Gatan). Analüüsiks saadi elektronmikroskoobid 5000× või 10 000× digitaalse suumiga.
Mitokondrite morfoloogiline analüüs. Kõikide analüüside jaoks joonistati üksikute mitokondrite kontuurid käsitsi digitaalsetele piltidele ImageJ tarkvara abil. Analüüsiti erinevaid morfoloogilisi parameetreid. Mitokondrite tihedust väljendatakse protsendina, mis saadakse iga raku mitokondrite kogupindala jagamisel tsütoplasma pindalaga (tsütoplasma pindala = raku pindala - rakutuuma pindala) × 100. Mitokondrite ümarus arvutatakse valemiga [4π∙(pindala/ümbermõõt 2)]. Mitokondrite morfoloogiat analüüsiti ja jagati kahte kategooriasse („torukujuline” ja „villjas”) vastavalt nende põhikujule.
Autofagosoomide/lüsosoomide arvu ja tiheduse analüüs. Kasutage ImageJ tarkvara, et digitaalsel pildil iga autofagosoomi/lüsosoomi kontuurid käsitsi visandada. Autofagosoomide/lüsosoomide pindala väljendatakse protsendina, mis arvutatakse iga raku autofagosoomide/lüsosoomide struktuuri kogupindala jagamisel tsütoplasma pindalaga (tsütoplasma pindala = raku pindala - tuuma pindala) × 100. Autofagosoomide/lüsosoomide tihedus arvutatakse, jagades koguarvu autofagosoomide/lüsosoomide struktuuride arvuga raku kohta (tsütoplasma pindala järgi) (tsütoplasmaatiline pindala = raku pindala - tuuma pindala).
Ägeda sektsiooni ja proovi ettevalmistamise märgistamine. Glükoosiga märgistamist vajavate katsete puhul viige ägedad ajulõigud eelinkubatsioonikambrisse, mis sisaldab küllastunud süsinikku (95% O2 ja 5% CO2), kõrge Ca2 + sisaldusega ACSF-i (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM naatriumfosfaatpuhver, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glükoos, 1,0 mM CaCl2 ja 2,0 mM MgCl2, pH reguleeritud väärtusele 7,4 ja 310 kuni 320 mOsm), milles glükoos on 13C6-glükoosi asendus (Eurisotop, katalooginumber CLM-1396). Püruvaadi märgistamist vajavate katsete puhul viige ägedad ajulõigud kõrgema Ca2 + ACSF-i (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM naatriumfosfaatpuhver, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glükoos, 1,0 mM CaCl2) ja lisage 2,0 mM MgCl2, reguleerige pH väärtusele 7,4 ja 310 kuni 320 mOsm) ning lisage 1 mM 1-[1-13C]püruvaat (Eurisotop, katalooginumber CLM-1082). Inkubeerige lõike 90 minutit temperatuuril 37 °C. Katse lõpus pesti lõike kiiresti 75 mM ammooniumkarbonaati sisaldava vesilahusega (pH 7,4) ja homogeniseeriti seejärel atsetonitriili (ACN): metanooli: vee 40:40:20 (v:v:v) segus. Pärast lõikude 30-minutilist jääl inkubeerimist tsentrifuugiti proove 10 minutit kiirusel 21 000 g temperatuuril 4 °C ja selget supernatanti kuivatati SpeedVac kontsentraatoris. Saadud kuivatatud metaboliidipelletit säilitati temperatuuril -80 °C kuni analüüsini.
13C-märgistatud aminohapete vedelikkromatograafia-massispektromeetria analüüs. Vedelikkromatograafia-massispektromeetria (LC-MS) analüüsiks suspendeeriti metaboliidipellet uuesti 75 μl LC-MS-kvaliteediga vees (Honeywell). Pärast tsentrifuugimist kiirusel 21 000 g 5 minutit temperatuuril 4 °C kasutati aminohapete voo analüüsiks 20 μl selitatud supernatanti, ülejäänud ekstrakti aga kohe anioonide analüüsiks (vt allpool). Aminohapete analüüs viidi läbi, kasutades eelnevalt kirjeldatud bensoüülkloriidi derivatiseerimisprotokolli (55, 56). Esimeses etapis lisati 20 μl metaboliidiekstraktile 10 μl 100 mM naatriumkarbonaati (Sigma-Aldrich) ja seejärel lisati LC-kvaliteediga ACN-ile 10 μl 2% bensoüülkloriidi (Sigma-Aldrich). Proovi segati lühidalt vorteksil ja seejärel tsentrifuugiti kiirusel 21 000 g 5 minutit temperatuuril 20 °C. Selitatud supernatant viidi 2 ml koonilise klaasist sisetükiga automaatse proovivõtja viaali (maht 200 μl). Proove analüüsiti Acquity iClass ülikõrge jõudlusega LC-süsteemi (Waters) abil, mis oli ühendatud Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) kõrge eraldusvõimega täppis-massispektromeetriga (Thermo Fisher Scientific). Analüüsiks süstiti 2 μl derivatiseeritud proovi 100 × 1,0 mm ülitugevasse silikageelist T3 kolonni (Waters), mis sisaldas 1,8 μm osakesi. Voolukiirus on 100 μl/min ja puhversüsteem koosneb puhvrist A (10 mM ammooniumformiaat ja 0,15% sipelghape vees) ja puhvrist B (ACN). Gradient on järgmine: 0%B 0 minutil; 0%B. 0 kuni 15% B 0 kuni 0,1 minutil; 15 kuni 17% B 0,1 kuni 0,5 minutil; B 17–55% juures 0,5–14 minutil; B 55–70% juures 14–14,5 minutil; 14,5–70–100% juures B 18 minutil; 100% B 18–19 minutil; 100–0% B 19–19,1 minutil; 0% B 19,1–28 minutil (55, 56). QE-HF massispektromeeter töötab positiivse ionisatsiooni režiimis massivahemikuga m/z (massi/laengu suhe) 50–750. Rakendatud eraldusvõime on 60 000, võimenduse juhtimisega (AGC) saadud ioonsihtmärk on 3×106 ja maksimaalne iooniaeg on 100 millisekundit. Kuumutatud elektropihustus-ionisatsiooni (ESI) allikas töötab pihustuspingel 3,5 kV, kapillaaritemperatuuril 250 °C, kesta õhuvoolul 60 AU (suvalised ühikud) ja abiõhuvoolul 20 AU. 250 °C. S-lääts on seatud 60 AU peale.
13C-märgistatud orgaaniliste hapete anioonkromatograafia-MS-analüüs. Ülejäänud metaboliidi sadest (55 μl) analüüsiti Dionex ioonkromatograafiasüsteemiga (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific), mis oli ühendatud QE-HF massispektromeetriga (Thermo Fisher Scientific). Lühidalt, 5 μl metaboliidi ekstrakti süstiti Dionex IonPac AS11-HC kolonni, mis oli varustatud HPLC-ga (2 mm × 250 mm, osakeste suurus 4 μm, Thermo Fisher Scientific) sisselükatava osalise silmuse režiimis täitesuhtega 1. Dionex IonPac AG11-HC kaitsekolonn (2 mm x 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific). Kolonni temperatuuri hoitakse 30 °C juures ja automaatne proovivõtja on seatud 6 °C-le. Kaaliumhüdroksiidi gradiendi genereerimiseks eluendigeneraatori kaudu kasutatakse deioniseeritud veega kaaliumhüdroksiidi padrunit. Metaboliitide eraldamine voolukiirusel 380 μl/min, rakendades järgmist gradienti: 0 kuni 3 minutit, 10 mM KOH; 3 kuni 12 minutit, 10 kuni 50 mM KOH; 12 kuni 19 minutit, 50 kuni 100 mM KOH; 19 kuni 21 minutit, 100 mM KOH; 21 kuni 21,5 minutit, 100 kuni 10 mM KOH. Kolonni tasakaalustati uuesti 10 mM KOH all 8,5 minutit.
Elueeritud metaboliidid kombineeritakse pärast kolonni 150 μl/min isopropanooli lisavooluga ja suunatakse seejärel negatiivse ionisatsiooni režiimis töötavasse kõrge eraldusvõimega massispektromeetrisse. MS jälgib massivahemikku m/z 50 kuni 750 eraldusvõimega 60 000. AGC on seatud väärtusele 1×106 ja maksimaalne iooniaeg hoitakse 100 ms juures. Kuumutatud ESI allikat töötati pihustuspingega 3,5 kV. Iooniallika muud seadistused on järgmised: kapillaari temperatuur 275 °C; kestagaasi vool 60 AU; abigaasi vool 20 AU temperatuuril 300 °C ja S-läätse seadistus 60 AU-le.
13C-märgistatud metaboliitide andmete analüüs. Isotoopide suhte andmete analüüsimiseks kasutage TraceFinder tarkvara (versioon 4.2, Thermo Fisher Scientific). Iga ühendi identiteeti kontrolliti usaldusväärse võrdlusühendi abil ja analüüsiti sõltumatult. Isotoopide rikastamise analüüsi teostamiseks ekstraheeriti iga 13C isotoobi (Mn) ekstraheeritud ioonkromatogrammi (XIC) pindala [M + H]+-st, kus n on sihtühendi süsinikuaatomarv, mida kasutatakse aminohapete analüüsimiseks või [MH]+-st anioonide analüüsimiseks. XIC massi täpsus on alla viie miljondikosa ja RT täpsus on 0,05 minutit. Rikastamise analüüs viiakse läbi, arvutades iga tuvastatud isotoobi suhte vastava ühendi kõigi isotoopide summasse. Need suhted on antud iga isotoobi protsentuaalsete väärtustena ja tulemused on väljendatud molaarse rikastamise protsendina (MPE), nagu eelnevalt kirjeldatud (42).
Külmutatud neuronite pellet homogeniseeriti jääkülmas 80% metanoolis (v/v), segati vorteksil ja inkubeeriti temperatuuril -20 °C 30 minutit. Proovi segati uuesti vorteksil ja segati temperatuuril +4 °C 30 minutit. Proovi tsentrifuugiti kiirusel 21 000 g 5 minutit temperatuuril 4 °C ja seejärel koguti saadud supernatant ja kuivatati SpeedVac kontsentraatori abil temperatuuril 25 °C järgnevaks analüüsiks. Nagu eespool kirjeldatud, viidi sorteeritud rakkude aminohapetega läbi LC-MS analüüs. TraceFinderi (versioon 4.2, Thermo Fisher Scientific) abil viidi läbi andmeanalüüs, kasutades iga ühendi monoisotoopset massi. Metaboliitide andmete kvantitatiivne normaliseerimine viidi läbi tarkvarapaketi preprocessCore (57) abil.
Viilude ettevalmistamine. Hiir tuimestati kiiresti süsinikdioksiidiga ja dekapiteeriti, aju eemaldati kiiresti koljult ja jääga täidetud vibreeriva nuga (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Saksamaa) abil lõigati see 300–375 μm sagitaalseteks lõikudeks. Külm süsinikgaasistamine (95% O2 ja 5% CO2), madal Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM naatriumfosfaatpuhver, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glükoos, 1,0 mM CaCl2 ja 6,0 mM MgCl2, pH reguleeriti väärtusele 7,4 ja 310–330 mOsm). Viige saadud ajulõigud kambrisse, mis sisaldab kõrgema Ca2 + ACSF-i sisaldusega lahuseid (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM naatriumfosfaatpuhver, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glükoos, 4,0 mM CaCl2 ja mM 3,5 MgCl2, pH 7,4 ja tihedus 310–320 mOsm). Hoidke viile 20–30 minutit, et neid saaks enne registreerimist taastada.
salvestus. Kõigi salvestuste jaoks kasutati fikseeritud salvestuskambri ja 20-kordse veeimmersiooniga objektiiviga (Scientifica) varustatud mikroskoobialust. Oletatavad Purkinje rakud identifitseeriti (i) keha suuruse, (ii) väikeaju anatoomilise asukoha ja (iii) fluorestseeruva mtYFP reportergeeni ekspressiooni järgi. 5–11 megaoomi otsatakistusega pipett tõmmatakse välja borosilikaatklaasist kapillaari (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Saksamaa) ja horisontaalse pipeti Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA) abil. Kõik salvestused tehti ELC-03XS npi plaastriklambri võimendiga (npi electronic GmbH, Tam, Saksamaa), mida juhtis tarkvara Signal (versioon 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Ühendkuningriik). Katse registreeriti 12,5 kHz diskreetimissagedusega. Signaali filtreeritakse kahe lühipääs-Besseli filtriga, mille piirsagedused on vastavalt 1,3 ja 10 kHz. Membraani ja pipeti mahtuvust kompenseeritakse kompensatsiooniahelaga võimendi abil. Kõik katsed viidi läbi Orca-Flash 4.0 kaamera (Hamamatsu, Gerden, Saksamaa) juhtimisel, mida juhtis Hokawo tarkvara (versioon 2.8, Hamamatsu, Gerden, Saksamaa).
Rutiinne täisrakuline konfiguratsioon ja analüüs. Vahetult enne registreerimist täidetakse pipett siselahusega, mis sisaldab järgmisi aineid: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM kaaliumglükonaat, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM guanosiintrifosfaat (GTP) (Na) ja 10,0 mM kreatiniinfosfaat, pH reguleeriti väärtusele 7,25 ja osmootne rõhk oli 290 mOsm (sahharoos). Vahetult pärast 0 pA jõu rakendamist membraani purustamiseks mõõdetakse membraani puhkepotentsiaali. Sisendtakistust mõõdetakse hüperpolariseeritud voolude -40, -30, -20 ja -10 pA rakendamisega. Mõõdetakse pingevastuse suurus ja sisendtakistuse arvutamiseks kasutatakse Ohmi seadust. Spontaanset aktiivsust registreeriti pingeklambriga 5 minuti jooksul ning sPSC tuvastati ja mõõdeti Igor Pro-s (versioon 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) poolautomaatse tuvastusskripti abil. IV kõverat ja püsivoolu mõõdeti aku pingestamise teel erinevatel potentsiaalidel (alates -110 mV-st) ja pinge suurendamisega 5 mV sammudega. AP teket testiti depolariseeriva voolu rakendamisega. Kinnitage element pingele -70 mV, rakendades samal ajal depolariseeriva vooluimpulssi. Reguleerige iga salvestusseadme sammu suurust eraldi (10 kuni 60 pA). Arvutage maksimaalne AP sagedus, loendades käsitsi impulsi tippe, mis põhjustavad kõrgeima AP sageduse. AP läve analüüsitakse, kasutades depolarisatsiooniimpulsi teist tuletist, mis esimesena käivitab ühe või mitu AP-d.
Perforeeritud plaastri konfiguratsioon ja analüüs. Tehke perforeeritud plaastri registreerimine standardprotokollide abil. Kasutage ATP- ja GTP-vaba pipetti, mis ei sisalda järgmisi koostisosi: 128 mM glükonaat K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA ja 2 mM MgCl2 ning reguleerige pH väärtuseni 7,2 (kasutades KOH-d). ATP ja GTP jäetakse rakusisesest lahusest välja, et vältida rakumembraani kontrollimatut läbilaskvust. Plaastri pipett täidetakse amfoteritsiini sisaldava sisemise lahusega (ligikaudu 200 kuni 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich), et saada perforeeritud plaastri salvestus. Amfoteritsiin lahustati dimetüülsulfoksiidis (lõppkontsentratsioon: 0,1 kuni 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Kasutatud DMSO kontsentratsioonil ei olnud uuritud neuronitele olulist mõju. Perforeerimisprotsessi ajal jälgiti pidevalt kanali takistust (Ra) ja katse alustati pärast Ra ja AP amplituudi stabiliseerumist (20–40 minutit). Spontaanset aktiivsust mõõdetakse pinge- ja/või voolutangidega 2 kuni 5 minuti jooksul. Andmete analüüs viidi läbi, kasutades Igor Pro (versioon 7.05.2, WaveMetrics, USA), Exceli (versioon 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) ja GraphPad Prismi (versioon 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Ameerika Ühendriigid. Spontaansete AP-de tuvastamiseks kasutatakse IgorPro NeuroMatic v3.0c pluginat. AP-d tuvastatakse automaatselt etteantud läviväärtuse abil, mida reguleeritakse iga kirje jaoks eraldi. Kasutades piikintervalli, määratakse piiksagedus koos maksimaalse hetkelise piiksagedusega ja keskmise piiksagedusega.
PN-i eraldamine. Kohandades eelnevalt avaldatud protokolli, puhastati PN-id hiire väikeajust kindlaksmääratud staadiumis (58). Lühidalt, väikeaju dissekteeriti ja hakiti jääkülmas dissotsiatsioonikeskkonnas [ilma HBSS Ca2+ ja Mg2+-ta, millele oli lisatud 20 mM glükoosi, penitsilliini (50 U/ml) ja streptomütsiini (0,05 mg/ml)] ning seejärel seediti keskkonda papaiiniga [HBSS, millele oli lisatud 1-tsüsteiin·HCl (1 mg/ml), papaiini (16 U/ml) ja deoksüribonukleaas I-d (DNase I; 0,1 mg/ml)]. Töödeldi 30 minutit temperatuuril 30 °C. Esmalt peske kudesid toatemperatuuril HBSS söötmes, mis sisaldab munalima (10 mg/ml), BSA-d (10 mg/ml) ja DNaasi (0,1 mg/ml), et vältida ensümaatilist seedimist, ning seejärel HBSS söötmes, mis sisaldab 20 mM glükoosi. HBSS-i, penitsilliini (50 U/ml), streptomütsiini (0,05 mg/ml) ja DNaasi (0,1 mg/ml) õrnalt peenestades vabastatakse üksikud rakud. Saadud rakususpensioon filtriti läbi 70 μm rakufiltri, seejärel tsentrifuugiti rakud pelletitega (1110 p/min, 5 minutit, 4 °C) ja suspendeeriti uuesti sorteerimiskeskkonnas [HBSS, millele on lisatud 20 mM glükoosi, 20% loote veise seerumit, penitsilliini (50 U/ml) ja streptomütsiini (0,05 mg/ml)]; hinnake rakkude elujõulisust propiidiumjodiidiga ja reguleerige rakkude tihedust 1 × 106 kuni 2 × 106 rakku/ml. Enne voolutsütomeetriat filtriti suspensioon läbi 50 μm rakufiltri.
Voolutsütomeeter. Rakkude sorteerimine viidi läbi temperatuuril 4 °C, kasutades FACSAria III masinat (BD Biosciences) ja FACSDiva tarkvara (BD Biosciences, versioon 8.0.1). Rakususpensiooni sorteeriti 100 μm otsiku abil rõhul 20 psi kiirusega ~2800 sündmust sekundis. Kuna traditsioonilised väravdamiskriteeriumid (raku suurus, bimodaalne diskrimineerimine ja hajumisomadused) ei suuda tagada PN-i õiget isoleerimist teistest rakutüüpidest, seatakse väravdamisstrateegia mitoYFP+ ​​​​ja kontroll-mitoYFP-hiirte YFP intensiivsuse ja autofluorestsentsi otsese võrdluse põhjal. YFP ergastatakse proovi kiiritades 488 nm laserjoonega ja signaali detekteeritakse 530/30 nm ribapääsfiltri abil. MitoYFP+ ​​​​hiirtel kasutatakse Rosa26-mitoYFP reportergeeni suhtelist tugevust ka neuronaalse keha ja aksoni fragmentide eristamiseks. 7-AAD-d ergastatakse 561 nm kollase laseriga ja detekteeritakse surnud rakkude eraldamiseks 675/20 nm ribafiltriga. Astrotsüütide samaaegseks eraldamiseks värviti rakususpensioon ACSA-2-APC-ga, seejärel kiiritati proovi 640 nm laserjoonega ja signaali detekteerimiseks kasutati 660/20 nm ribafiltrit.
Kogutud rakud sadestati tsentrifuugimise teel (1110 p/min, 5 minutit, 4 °C) ja säilitati temperatuuril -80 °C kuni kasutamiseni. Mfn2cKO hiired ja nende pesakonna pojad klassifitseeritakse samal päeval, et minimeerida protseduurilist varieeruvust. FACS-andmete esitamine ja analüüs viidi läbi FlowJo tarkvara abil (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Nagu eespool mainitud (59), kasutatakse sorteeritud neuronitest DNA eraldamiseks järgnevaks mtDNA kvantifitseerimiseks reaalaja PCR-i. Lineaarsust ja läviväärtustundlikkust testiti esialgu qPCR-i abil erineva arvu rakkudega. Lühidalt, koguge 300 PN-i lüüsipuhvrisse, mis koosneb 50 mM tris-HCl-ist (pH 8,5), 1 mM EDTA-st, 0,5% Tween 20-st ja proteinaas K-st (200 ng/ml) ning inkubeerige temperatuuril 55 °C 120 minutit. Rakke inkubeeriti veel 10 minutit temperatuuril 95 °C, et tagada proteinaas K täielik inaktiveerimine. Kasutades mt-Nd1-spetsiifilist TaqMan sondi (Thermo Fisher), mõõdeti mtDNA-d poolkvantitatiivse PCR-iga 7900HT reaalaja PCR-süsteemis (Thermo Fisher Scientific). Science, katalooginumber Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, katalooginumber AIVI3E8) ja 18S (Thermo Fisher Scientific, katalooginumber Hs99999901_s1) geenid.
Proteoomiproovi ettevalmistamine. Lahust kuumutati 10 minutit temperatuuril 95 °C ja seejärel ultraheliti lüüsipuhvris [6 M guanidiinkloriidi, 10 mM tris(2-karboksüetüül)fosfiinvesinikkloriidi, 10 mM kloroatseetamiid ja 100 mM tris-Lüüsiti külmutatud neuronipelletid HCl-is]. Bioruptoril (Diagenode) 10 minutit (30 sekundit impulssi / 30 sekundit pausiperioodi). Proovi lahjendati 1:10 20 mM tris-HCl-is (pH 8,0), segati 300 ng trüpsiini kullaga (Promega) ja inkubeeriti üleöö temperatuuril 37 °C, et saavutada täielik seedimine. Teisel päeval tsentrifuugiti proovi 20 minutit kiirusel 20 000 g. Supernatant lahjendati 0,1% sipelghappega ja lahus magestati isevalmistatud StageTips-otstega. Proovi kuivatati SpeedVac instrumendis (Eppendorfi kontsentraator pluss 5305) temperatuuril 45 °C ja seejärel suspendeeriti peptiid 0,1% sipelghappes. Kõik proovid valmistas ette samaaegselt sama isik. Astrotsüütide proovide analüüsimiseks märgistati 4 μg soolatustatud peptiide tandemmassimärgisega (TMT10plex, katalooginumber 90110, Thermo Fisher Scientific) peptiidi ja TMT reagendi suhtega 1:20. TMT märgistamiseks resuspendeeriti 0,8 mg TMT reagenti 70 μl veevabas ACN-is ja kuivatatud peptiid lahustati 9 μl 0,1 M TEAB-s (trietüülammooniumvesinikkarbonaat), millele lisati 7 μl TMT reagenti ACN-is. Kontsentratsioon oli 43,75%. Pärast 60-minutilist inkubeerimist peatati reaktsioon 2 μl 5% hüdroksüülamiiniga. Märgistatud peptiidid koguti, kuivatati, resuspendeeriti 200 μl 0,1% sipelghappes (FA), jagati kaheks ja seejärel magestati isevalmistatud StageTips-otsikutega. Kasutades UltiMate 3000 ülikõrge jõudlusega vedelikkromatograafi (UltiMate 3000 ülikõrge jõudlusega vedelikkromatograaf), fraktsioneeriti üks kahest poolest 1 mm x 150 mm Acquity kromatograafilisel kolonnil, mis oli täidetud 130Å1,7 μm C18 osakestega (Waters, katalooginumber SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Eraldage peptiidid voolukiirusel 30 μl/min, eraldage 1% kuni 50% puhvrit B 85 minuti jooksul astmelise gradiendiga 96 minutit, 50% kuni 95% puhvrit B 3 minutit, seejärel 8 minutit 95% puhvri B jaoks; Puhver A on 5% ACN ja 10 mM ammooniumvesinikkarbonaat (ABC) ning puhver B on 80% ACN ja 10 mM ABC. Koguge fraktsioone iga 3 minuti järel ja ühendage need kahte rühma (1 + 17, 2 + 18 jne) ning kuivatage vaakumtsentrifuugis.
LC-MS/MS analüüs. Massispektromeetria jaoks eraldati peptiidid (number r119.aq) 25 cm pikkusel, 75 μm sisediameetriga PicoFrit analüütilisel kolonnil (uus objektiiv, tootenumber PF7508250), mis oli varustatud 1,9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ söötmega (Dr. Maisch, mat), kasutades EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Saksamaa). Kolonni hoiti temperatuuril 50 °C. Puhvrid A ja B on vastavalt 0,1% sipelghape vees ja 0,1% sipelghape 80% ACN-is. Peptiide eraldati 6% kuni 31% puhvrist B 65 minutit ja 31% kuni 50% puhvrist B 5 minutit gradiendiga 200 nl/min. Elueeritud peptiide analüüsiti Orbitrap Fusion massispektromeetril (Thermo Fisher Scientific). Peptiidi eelkäija m/z mõõtmine viiakse läbi 120 000 resolutsiooniga vahemikus 350 kuni 1500 m/z. Kasutades 27% normaliseeritud kokkupõrkeenergiat, valitakse kõrge energiaga C-lõksu dissotsiatsiooni (HCD) lõhustamiseks tugevaim eelkäija, mille laengutase on 2 kuni 6. Tsükliaeg on seatud 1 sekundile. Peptiidifragmendi m/z väärtus mõõdeti ioonlõksus, kasutades väikseimat AGC sihtmärki 5×104 ja maksimaalset süstimisaega 86 ms. Pärast fragmenteerimist paigutati eelkäija 45 sekundiks dünaamilisse välistamisloendisse. TMT-märgistatud peptiidid eraldati 50 cm, 75 μm Acclaim PepMap kolonnil (Thermo Fisher Scientific, katalooginumber 164942) ja migratsioonispektreid analüüsiti Orbitrap Lumos Tribrid massispektromeetril (Thermo Fisher Scientific), mis oli varustatud suure väljaga asümmeetrilise lainekuju ioonide (FAIMS) seadmega (Thermo Fisher Scientific), mis töötab kahel kompensatsioonipingel -50 ja -70 V. Sünkroniseerimisprekursori põhjal valitud MS3-d kasutatakse TMT aruande ioonsignaali mõõtmiseks. Peptiidide eraldamine viidi läbi EASY-nLC 1200-l, kasutades 90% lineaarset gradiendi elueerimist, puhvri kontsentratsiooniga 6% kuni 31%; puhver A oli 0,1% FA ja puhver B oli 0,1% FA ja 80% ACN. Analüütiline kolonn töötab temperatuuril 50 °C. Algse faili jagamiseks FAIMS-i kompensatsioonipinge järgi kasutage FreeStyle'i (versioon 1.6, Thermo Fisher Scientific).
Valkude identifitseerimine ja kvantifitseerimine. Kasutades integreeritud Andromeda otsingumootorit, analüüsiti algandmeid MaxQuant versiooniga 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Lisaks Aequorea victoriast saadud Cre rekombinaasi ja YFP järjestustele otsiti peptiidfragmentide spektreid hiire referentsproteoomi kanoonilise järjestuse ja isovormi järjestuse leidmiseks (proteoomi ID UP000000589, alla laaditud UniProtist mais 2017). Metioniini oksüdatsioon ja valgu N-terminaalne atsetüülimine määrati muutuvate modifikatsioonidena; tsüsteiini karbamoüülmetüülimine määrati fikseeritud modifikatsioonidena. Lõhustamisparameetrid on seatud väärtusele „spetsiifilisus“ ja „trüpsiin/P“. Valkude identifitseerimiseks kasutatavate peptiidide ja habemenugapeptiidide minimaalne arv on 1; minimaalne unikaalsete peptiidide arv on 0. Peptiidikaardi sobitamise tingimustes oli valkude identifitseerimise määr 0,01. Valik „Teine peptiid“ on lubatud. Edukate identifitseerimiste edastamiseks erinevate originaalfailide vahel kasutage valikut „Sobivus jooksude vahel“. Märgistusvaba kvantifitseerimise (LFQ) jaoks kasutage LFQ minimaalse suhte loendust 1 (60). LFQ intensiivsus filtreeritakse vähemalt kahe kehtiva väärtuse jaoks vähemalt ühes genotüübirühmas igal ajahetkel ja ekstrapoleeritakse normaaljaotusest laiusega 0,3, liigutades allapoole 1,8 võrra. LFQ tulemuste analüüsimiseks kasutage Perseuse arvutusplatvormi (https://maxquant.net/perseus/) ja R-i (https://r-project.org/). Diferentsiaalse ekspressiooni analüüsiks kasutati Limma tarkvarapaketi kahesuunalist mõõdukat t-testi (61). Uurimuslik andmeanalüüs viidi läbi, kasutades ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally ja pheatmap. TMT-põhiseid proteoomika andmeid analüüsiti MaxQuant versiooni 1.6.10.43 abil. Otsige toores proteoomika andmeid UniProti inimese proteoomika andmebaasist, mis laaditi alla 2018. aasta septembris. Analüüs sisaldab tootja esitatud isotoopide puhtuse parandustegurit. Diferentsiaalse ekspressiooni analüüsiks kasutage R-is limmat. Algandmed, andmebaasi otsingu tulemused ning andmeanalüüsi töövoog ja tulemused salvestatakse kõik ProteomeXchange alliance'i PRIDE partnerrepositooriumi kaudu andmekogumi identifikaatoriga PXD019690.
Funktsionaalsed annotatsioonid rikastavad analüüsi. Andmestiku funktsionaalsete annotatsiooniterminite rikkuse määramiseks 8. nädalal kasutati Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) tööriista (joonis 1). Lühidalt öeldes kasutatakse LC-MS/MS (tandem-massispektromeetria) andmeanalüüsist saadud kvantitatiivset valkude loendit järgmiste filtrikriteeriumidega: liigiks ja taustaks on valitud Mus musculus ning kategooria näitab Benjamini poolt korrigeeritud P-väärtust rikastuse korral, mida peetakse oluliseks. 0,05 või madalamat rikastust peetakse oluliseks. Sellel graafikul on näidatud iga klastri viis üleliigset kategooriat, mis põhinevad korrigeeritud P-väärtusel. Kasutades mitmekordset t-testi, kasutades Benjamini, Kriegeri ja Yekutieli kaheastmelist lineaarset võimendusprogrammi (Q = 5%), teostatakse igas kategoorias tuvastatud oluliste kandidaatide puhul ajalise kulgemise valkude ekspressiooni analüüs ja iga rida analüüsitakse eraldi. Järjepideva standardhälbe kasutamiseks pole vajadust.
Selle uuringu tulemuste võrdlemiseks avaldatud andmebaasidega ja joonisel 1 kujutatud Venni diagrammi loomiseks ühendasime kvantitatiivse valkude loendi MitoCarta 2.0 annotatsioonidega (24). Diagrammi loomiseks kasutasime veebitööriista Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/).
Proteoomika analüüsis kasutatud statistiliste protseduuride kohta leiate üksikasjalikku teavet materjalide ja meetodite vastavast jaotisest. Kõigi teiste katsete kohta leiate üksikasjalikku teavet vastavast legendist. Kui pole teisiti täpsustatud, on kõik andmed väljendatud keskmisena ± standardvea ja kõik statistilised analüüsid viidi läbi GraphPad Prism 8.1.2 tarkvara abil.
Selle artikli lisamaterjalide saamiseks külastage palun veebilehte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1.
See on avatud juurdepääsuga artikkel, mis on levitatud Creative Commonsi litsentsi "Autorile viitamine + Mitteäriline eesmärk" tingimuste kohaselt, mis lubab kasutamist, levitamist ja reprodutseerimist mis tahes meediumis, kui lõppkasutus ei ole ärilise kasu saamiseks ja eelduseks on algse teose õigsus. Viide.
Märkus: Palume teil oma e-posti aadressi esitada ainult selleks, et lehele soovitatud inimene teaks, et soovite talle e-kirja näidata ja et see pole rämpspost. Me ei salvesta ühtegi e-posti aadressi.
Selle küsimuse abil kontrollitakse, kas olete külastaja, ja takistatakse automaatset rämpsposti saatmist.
Autorid: E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Düsfunktsionaalsete neuronite proteoomika analüüs näitas, et neurodegeneratsiooni vastu võitlemiseks aktiveeritakse metaboolsed programmid.
Autorid: E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Düsfunktsionaalsete neuronite proteoomika analüüs näitas, et neurodegeneratsiooni vastu võitlemiseks aktiveeritakse metaboolsed programmid.
©2020 American Association for the Advanced of Science of Science. kõik õigused kaitstud. AAAS on HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ja COUNTER partner. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.