Artikkel on osa uurimisteemast „Täiustatud biopuhastustehnoloogiad ja sünteetiliste orgaaniliste ühendite (SOC) ringlussevõtu protsessid“. Vaata kõiki 14 artiklit.
Madala molekulmassiga polütsüklilisi aromaatseid süsivesinikke (PAH-e), nagu naftaleen ja asendatud naftaleenid (metüülnaftaleen, naftoehape, 1-naftüül-N-metüülkarbamaat jne), kasutatakse laialdaselt erinevates tööstusharudes ning need on organismidele genotoksilised, mutageensed ja/või kantserogeensed. Neid sünteetilisi orgaanilisi ühendeid (SOC-e) ehk ksenobiootikume peetakse prioriteetseteks saasteaineteks ning need kujutavad endast tõsist ohtu globaalsele keskkonnale ja rahvatervisele. Inimtegevuse intensiivsus (nt söe gaasistamine, nafta rafineerimine, sõidukite heitgaasid ja põllumajanduslikud rakendused) määrab nende kõikjal esinevate ja püsivate ühendite kontsentratsiooni, saatuse ja transpordi. Lisaks füüsikalistele ja keemilistele töötlemis-/eemaldamismeetoditele on ohutu, kulutõhusa ja paljutõotava alternatiivina esile kerkinud rohelised ja keskkonnasõbralikud tehnoloogiad, näiteks biopuhastus, mis kasutavad mikroorganisme, mis on võimelised POC-e täielikult lagundama või muutma need mittetoksilisteks kõrvalsaadusteks. Erinevad bakteriliigid, mis kuuluvad mulla mikrobiootas leiduvate hõimkondadesse Proteobacteria (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia ja Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus ja Paenibacillus) ja Actinobacteria (Rhodococcus ja Arthrobacter), on näidanud võimet lagundada mitmesuguseid orgaanilisi ühendeid. Ainevahetusuuringud, genoomika ja metagenoomiline analüüs aitavad meil mõista nende lihtsate eluvormide kataboolset keerukust ja mitmekesisust, mida saab edaspidi rakendada tõhusa biolagundamise jaoks. PAH-ide pikaajaline olemasolu on toonud kaasa uudsete lagundamise fenotüüpide tekkimise horisontaalse geeniülekande kaudu, kasutades geneetilisi elemente nagu plasmiidid, transposoonid, bakteriofaagid, genoomsed saared ja integreerivad konjugatiivsed elemendid. Süsteemibioloogia ja spetsiifiliste isolaatide või mudelkoosluste (konsortsiumide) geenitehnoloogia abil saab sünergistlike efektide kaudu võimaldada nende PAH-ide ulatuslikku, kiiret ja tõhusat biopuhastust. Selles ülevaates keskendume naftaleeni ja asendatud naftaleeni lagundavate bakterite erinevatele ainevahetusradadele ja mitmekesisusele, geneetilisele koostisele ja mitmekesisusele ning rakulistele reaktsioonidele/kohandustele. See annab ökoloogilist teavet välitöödeks ja tüvede optimeerimiseks tõhusa biopuhastuse eesmärgil.
Tööstusharude (naftakeemia, põllumajandus, farmaatsia, tekstiilivärvid, kosmeetika jne) kiire areng on aidanud kaasa ülemaailmsele majanduslikule õitsengule ja elatustaseme paranemisele. See eksponentsiaalne areng on toonud kaasa suure hulga sünteetiliste orgaaniliste ühendite (SOC-de) tootmise, mida kasutatakse mitmesuguste toodete valmistamiseks. Nende võõrühendite ehk SOC-de hulka kuuluvad polütsüklilised aromaatsed süsivesinikud (PAH-id), pestitsiidid, herbitsiidid, plastifikaatorid, värvained, ravimid, organofosfaadid, leegiaeglustid, lenduvad orgaanilised lahustid jne. Need satuvad atmosfääri, vee- ja maismaaökosüsteemidesse, kus neil on mitmemõõtmeline mõju, põhjustades kahjulikku mõju erinevatele biovormidele, muutes füüsikalis-keemilisi omadusi ja koosluste struktuuri (Petrie jt, 2015; Bernhardt jt, 2017; Sarkar jt, 2020). Paljudel aromaatsetel saasteainetel on tugev ja hävitav mõju paljudele puutumatutele ökosüsteemidele/bioloogilise mitmekesisuse levialadele (nt korallriffid, Arktika/Antarktika jääkatted, kõrgmäestikujärved, süvamere setted jne) (Jones 2010; Beyer jt 2020; Nordborg jt 2020). Hiljutised geomikrobioloogilised uuringud on näidanud, et sünteetilise orgaanilise aine (nt aromaatsete saasteainete) ja nende derivaatide sadestumine tehisstruktuuride (ehitatud keskkond) (nt graniidist, kivist, puidust ja metallist kultuuripärandi objektid ja monumendid) pindadele kiirendab nende lagunemist (Gadd 2017; Liu jt 2018). Inimtegevus võib õhusaaste ja kliimamuutuste kaudu mälestiste ja hoonete bioloogilist lagunemist süvendada ja süvendada (Liu jt 2020). Need orgaanilised saasteained reageerivad atmosfääris oleva veeauruga ja settivad konstruktsioonile, põhjustades materjali füüsikalist ja keemilist lagunemist. Biolagunemist peetakse laialdaselt elusorganismide põhjustatud soovimatuteks muutusteks materjalide välimuses ja omadustes, mis mõjutavad nende säilimist (Pochon ja Jaton, 1967). Nende ühendite edasine mikroobne toime (metabolism) võib vähendada struktuurilist terviklikkust, konserveerimise efektiivsust ja kultuurilist väärtust (Gadd, 2017; Liu jt, 2018). Teisest küljest on mõnel juhul leitud, et mikroobide kohanemine ja reageerimine nendele struktuuridele on kasulik, kuna need moodustavad biokilesid ja muid kaitsvaid koorikuid, mis vähendavad lagunemise/lagunemise kiirust (Martino, 2016). Seetõttu nõuab kivi-, metall- ja puitmälestiste tõhusate pikaajaliste säästvate konserveerimisstrateegiate väljatöötamine põhjalikku arusaamist selle protsessiga seotud põhiprotsessidest. Võrreldes looduslike protsessidega (geoloogilised protsessid, metsatulekahjud, vulkaanipursked, taimede ja bakterite reaktsioonid) põhjustab inimtegevus suurtes kogustes polütsükliliste aromaatsete süsivesinike (PAH-de) ja muu orgaanilise süsiniku (OC) vabanemist ökosüsteemidesse. Paljud põllumajanduses (insektitsiidid ja pestitsiidid nagu DDT, atrasiin, karbarüül, pentaklorofenool jne), tööstuses (toornafta, naftajäätmed/setted, naftast saadud plastid, PCBd, plastifikaatorid, pesuvahendid, desinfitseerimisvahendid, fumigandid, lõhnaained ja säilitusained), isikuhooldustoodetes (päikesekaitsekreemid, desinfitseerimisvahendid, putukatõrjevahendid ja polütsüklilised muskusühendid) ja laskemoonas (lõhkeained nagu 2,4,6-TNT) kasutatavad PAH-id on potentsiaalsed ksenobiootikumid, mis võivad mõjutada planeedi tervist (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna ja Phale, 2008; Petrie jt, 2015). Seda loetelu saab laiendada, et see hõlmaks naftast saadud ühendeid (kütteõlid, määrdeained, asfalteenid), suure molekulmassiga bioplastmassi ja ioonvedelikke (Amde jt, 2015). Tabelis 1 on loetletud mitmesugused aromaatsed saasteained ja nende rakendused erinevates tööstusharudes. Viimastel aastatel on lenduvate orgaaniliste ühendite, samuti süsinikdioksiidi ja muude kasvuhoonegaaside inimtekkelised heitkogused hakanud suurenema (Dvorak jt, 2017). Inimtekkelised mõjud ületavad aga oluliselt looduslikke. Lisaks leidsime, et mitmed orgaanilised ühendid püsivad paljudes keskkonnakeskkondades ja on tuvastatud tekkivate saasteainetena, millel on bioomidele kahjulik mõju (joonis 1). Keskkonnaagentuurid, näiteks Ameerika Ühendriikide Keskkonnakaitseagentuur (USEPA), on lisanud paljud neist saasteainetest oma prioriteetide nimekirja nende tsütotoksiliste, genotoksiliste, mutageensete ja kantserogeensete omaduste tõttu. Seetõttu on vaja rangeid kõrvaldamiseeskirju ja tõhusaid strateegiaid jäätmete töötlemiseks/saastunud ökosüsteemidest eemaldamiseks. Erinevad füüsikalised ja keemilised töötlusmeetodid, nagu pürolüüs, oksüdatiivne termiline töötlemine, õhu aereerimine, prügilasse ladestamine, põletamine jne, on ebaefektiivsed ja kulukad ning tekitavad söövitavaid, toksilisi ja raskesti töödeldavaid kõrvalsaadusi. Kasvava globaalse keskkonnateadlikkusega on üha enam tähelepanu pälvinud mikroorganismid, mis on võimelised lagundama neid saasteaineid ja nende derivaate (näiteks halogeenitud, nitro-, alküül- ja/või metüülühendeid) (Fennell jt, 2004; Haritash ja Kaushik, 2009; Phale jt, 2020; Sarkar jt, 2020; Schwanemann jt, 2020). Nende kohalike kandidaatmikroorganismide kasutamine üksi või segakultuurides (kolooniates) aromaatsete saasteainete eemaldamiseks pakub eeliseid keskkonnaohutuse, kulude, tõhususe, efektiivsuse ja jätkusuutlikkuse osas. Teadlased uurivad ka mikroobsete protsesside integreerimist elektrokeemiliste redoksmeetoditega, nimelt bioelektrokeemiliste süsteemidega (BES), mis on paljulubav tehnoloogia saasteainete töötlemiseks/eemaldamiseks (Huang jt, 2011). BES-tehnoloogia on pälvinud üha suuremat tähelepanu tänu oma kõrgele efektiivsusele, madalale hinnale, keskkonnaohutusele, toatemperatuuril töötamisele, bioühilduvatele materjalidele ja võimele taaskasutada väärtuslikke kõrvalsaadusi (nt elekter, kütus ja kemikaalid) (Pant jt, 2012; Nazari jt, 2020). Suure läbilaskevõimega genoomi sekveneerimise ja omika tööriistade/meetodite tulek on andnud rohkelt uut teavet erinevate lagundavate mikroorganismide reaktsioonide geneetilise regulatsiooni, proteoomika ja fluksoomika kohta. Nende tööriistade kombineerimine süsteemibioloogiaga on veelgi parandanud meie arusaama mikroorganismide sihtmärkide kataboolsete radade valikust ja peenhäälestamisest (st metaboolne disain), et saavutada tõhus ja efektiivne biolagundamine. Tõhusate biopuhastusstrateegiate väljatöötamiseks, kasutades sobivaid kandidaat-mikroorganisme, peame mõistma mikroorganismide biokeemilist potentsiaali, metaboolset mitmekesisust, geneetilist koostist ja ökoloogiat (autoökoloogia/sünekoloogia).
Joonis 1. Madala molekulmassiga PAH-ide allikad ja levikuteed erinevates keskkonnakeskkondades ja mitmesugused biootat mõjutavad tegurid. Katkendlikud jooned kujutavad ökosüsteemi elementide vastastikmõjusid.
Selles ülevaates oleme püüdnud kokku võtta andmeid lihtsate PAH-ide, näiteks naftaleeni ja asendatud naftaleenide, lagunemise kohta erinevate bakteriaalsete isolaatide poolt, hõlmates metaboolseid radu ja mitmekesisust, lagundamisega seotud ensüüme, geenide koostist/sisaldust ja mitmekesisust, rakulisi reaktsioone ja biopuhastuse erinevaid aspekte. Biokeemilise ja molekulaarse taseme mõistmine aitab tuvastada sobivaid peremeestüvesid ja nende edasist geneetilist muundamist selliste prioriteetsete saasteainete tõhusaks biopuhastuseks. See aitab välja töötada strateegiaid kohapõhiste bakteriaalsete konsortsiumide loomiseks tõhusa biopuhastuse tagamiseks.
Suure hulga toksiliste ja ohtlike aromaatsete ühendite (mis vastavad Huckle'i reeglile 4n + 2π elektronid, n = 1, 2, 3, ...) olemasolu kujutab endast tõsist ohtu mitmesugustele keskkonnaelementidele, nagu õhk, pinnas, setted ning pinna- ja põhjavesi (Puglisi jt, 2007). Nendel ühenditel on üksikud benseenitsüklid (monotsüklilised) või mitu benseenitsüklit (polütsüklilised), mis on paigutatud lineaarselt, nurgeliselt või klastrite kujul ning neil on keskkonnas stabiilsus (stabiilsus/ebastabiilsus) tänu kõrgele negatiivsele resonantsienergiale ja inertsusele (inertsusele), mida saab seletada nende hüdrofoobsuse ja redutseeritud olekuga. Kui aromaatne tsükkel asendatakse edasi metüül- (-CH3), karboksüül- (-COOH), hüdroksüül- (-OH) või sulfonaat- (-HSO3) rühmadega, muutub see stabiilsemaks, omab tugevamat afiinsust makromolekulide suhtes ja on bioloogilistes süsteemides bioakumuleeruv (Seo jt, 2009; Phale jt, 2020). Mõned madala molekulmassiga polütsüklilised aromaatsed süsivesinikud (LMWAH-id), näiteks naftaleen ja selle derivaadid [metüülnaftaleen, naftoehape, naftaleensulfonaat ja 1-naftüül-N-metüülkarbamaat (karbarüül)], on USA Keskkonnakaitseagentuuri poolt kantud prioriteetsete orgaaniliste saasteainete nimekirja genotoksiliste, mutageensete ja/või kantserogeensetena (Cerniglia, 1984). Selle klassi NM-PAH-ide keskkonda sattumine võib põhjustada nende ühendite bioakumuleerumist toiduahela kõigil tasanditel, mõjutades seeläbi ökosüsteemide tervist (Binkova jt, 2000; Srogi, 2007; Quinn jt, 2009).
PAH-ide allikad ja teed elustikku toimuvad peamiselt migratsiooni ja interaktsioonide kaudu erinevate ökosüsteemi komponentide, näiteks pinnase, põhjavee, pinnavee, põllukultuuride ja atmosfääri vahel (Arey ja Atkinson, 2003). Joonis 1 näitab erinevate madalmolekulaarsete PAH-ide interaktsioone ja jaotust ökosüsteemides ning nende teid elustiku/inimeste kokkupuuteni. PAH-id ladestuvad pindadele õhusaaste tagajärjel ning sõidukite heitgaaside, tööstuslike heitgaaside (kivisöe gaasistamine, põletamine ja koksi tootmine) migratsiooni (triivi) ja nende ladestumise kaudu. Tööstustegevused, nagu sünteetiliste tekstiilide, värvainete ja värvide tootmine; puidukaitse; kummi töötlemine; tsemendi tootmine; pestitsiidide tootmine; ja põllumajanduslikud rakendused, on peamised PAH-ide allikad maismaa- ja veeökosüsteemides (Bamforth ja Singleton, 2005; Wick jt, 2011). Uuringud on näidanud, et äärelinnade ja linnapiirkondade, maanteede lähedal ja suurlinnades on pinnas polütsükliliste aromaatsete süsivesinike (PAH-ide) suhtes vastuvõtlikum elektrijaamade heitkoguste, elamute kütmise, õhu- ja teeliikluse koormuse ning ehitustegevuse tõttu (Suman jt, 2016). (2008) näitas, et PAH-ide sisaldus New Orleansi, Louisiana osariigi, USA teede lähedal asuvas pinnases oli koguni 7189 μg/kg, samas kui avatud ruumis oli see vaid 2404 μg/kg. Samuti on mitmes USA linnas söe gaasistamiskohtade lähedal asuvates piirkondades teatatud PAH-ide tasemest kuni 300 μg/kg (Kanaly ja Harayama, 2000; Bamforth ja Singleton, 2005). On teatatud, et mitmete India linnade, näiteks Delhi (Sharma jt, 2008), Agras (Dubey jt, 2014), Mumbai (Kulkarni ja Venkataraman, 2000) ja Visakhapatnami (Kulkarni jt, 2014) mullad sisaldavad suuri PAH-ide kontsentratsioone. Aromaatsed ühendid adsorbeeruvad kergemini mullaosakestele, orgaanilisele ainele ja savimineraalidele, muutudes seega ökosüsteemides olulisteks süsiniku neeldajateks (Srogi, 2007; Peng jt, 2008). PAH-ide peamised allikad veeökosüsteemides on sademed (märg/kuiv sade ja veeaur), linnade äravool, reovee äravool, põhjavee toitumine jne (Srogi, 2007). Hinnanguliselt pärineb umbes 80% PAH-idest mereökosüsteemides sademetest, settimisest ja jäätmete heitest (Motelay-Massei jt, 2006; Srogi, 2007). Pinnavees või tahkete jäätmete prügilate nõrgvees sisalduvate PAH-ide suurem kontsentratsioon imbub lõpuks põhjavette, kujutades endast suurt ohtu rahvatervisele, kuna Lõuna- ja Kagu-Aasias joob põhjavett enam kui 70% elanikkonnast (Duttagupta jt, 2019). Duttagupta jt (2020) hiljutine uuring Lääne-Bengalis Indias tehtud jõgede (32) ja põhjavee (235) analüüside kohta näitas, et hinnanguliselt 53% linnaelanikest ja 44% maapiirkondade elanikest (kokku 20 miljonit elanikku) võivad kokku puutuda naftaleeni (4,9–10,6 μg/l) ja selle derivaatidega. Erinevaid maakasutusmustreid ja suurenenud põhjavee kaevandamist peetakse peamisteks teguriteks, mis kontrollivad madalmolekulaarsete PAH-ide vertikaalset transporti (advektsiooni) pinnases. On leitud, et PAH-id mõjutavad jõgede vesikondades ja pinnasestes setetes põllumajanduslikku äravoolu, olme- ja tööstusreovee äravoolu ning tahkete jäätmete/prügi heitmeid. Atmosfääri sademed süvendavad veelgi PAH-reostust. PAH-ide ja nende alküülderivaatide kõrgeid kontsentratsioone (kokku 51) on täheldatud jõgedes/vesikondades üle maailma, näiteks Fraseri jões, Louani jões, Denso jões, Missouri jões, Anacostia jões, Ebro jões ja Delaware'i jões (Yunker jt, 2002; Motelay-Massei jt, 2006; Li jt, 2010; Amoako jt, 2011; Kim jt, 2018). Gangesi jõe vesikonna setetes leiti kõige olulisemateks naftaleeni ja fenantreeni (tuvastatud 70% proovidest) (Duttagupta jt, 2019). Lisaks on uuringud näidanud, et joogivee kloorimine võib viia mürgisemate hapnikuga rikastatud ja klooritud PAH-ide moodustumiseni (Manoli ja Samara, 1999). PAH-id kogunevad teraviljadesse, puu- ja köögiviljadesse taimede omastamise tagajärjel saastunud pinnasest, põhjaveest ja sademetest (Fismes jt, 2002). Paljud veeorganismid, näiteks kalad, rannakarbid, karbid ja krevetid, saastuvad PAH-idega saastunud toidu ja merevee tarbimise kaudu, samuti kudede ja naha kaudu (Mackay ja Fraser, 2000). Küpsetamis-/töötlemismeetodid, nagu grillimine, röstimine, suitsutamine, praadimine, kuivatamine, küpsetamine ja söel küpsetamine, võivad samuti põhjustada märkimisväärse koguse PAH-e toidus. See sõltub suuresti suitsutusmaterjali valikust, fenoolsete/aromaatsete süsivesinike sisaldusest, küpsetusprotseduurist, kütteseadme tüübist, niiskusesisaldusest, hapnikuvarustusest ja põlemistemperatuurist (Guillén jt, 2000; Gomes jt, 2013). Polütsüklilisi aromaatseid süsivesinikke (PAH-e) on erinevates kontsentratsioonides (0,75–2,1 mg/l) leitud ka piimast (Girelli jt, 2014). Nende PAH-ide akumuleerumine toidus sõltub ka toidu füüsikalis-keemilistest omadustest, samas kui nende toksiline toime on seotud füsioloogiliste funktsioonide, metaboolse aktiivsuse, imendumise, jaotumise ja jaotumisega organismis (Mechini et al., 2011).
Polütsükliliste aromaatsete süsivesinike (PAH-ide) toksilisus ja kahjulik mõju on teada juba pikka aega (Cherniglia, 1984). Madala molekulmassiga polütsüklilised aromaatsed süsivesinikud (LMW-PAH-id) (kaks kuni kolm tsüklit) võivad kovalentselt seonduda erinevate makromolekulidega, nagu DNA, RNA ja valgud, ning on kantserogeensed (Santarelli jt, 2008). Oma hüdrofoobse olemuse tõttu on nad eraldatud lipiidmembraanidega. Inimestel oksüdeerivad tsütokroom P450 monooksügenaasid PAH-e epoksiidideks, millest mõned on väga reaktiivsed (nt baedioolepoksiid) ja võivad viia normaalsete rakkude muutumiseni pahaloomulisteks (Marston jt, 2001). Lisaks on PAH-ide transformatsiooniproduktid, nagu kinoonid, fenoolid, epoksiidid, dioolid jne, toksilisemad kui lähteühendid. Mõned PAH-id ja nende ainevahetuse vaheühendid võivad mõjutada hormoone ja mitmesuguseid ainevahetuses osalevaid ensüüme, avaldades seeläbi kahjulikku mõju kasvule, kesknärvisüsteemile, reproduktiiv- ja immuunsüsteemile (Swetha ja Phale, 2005; Vamsee-Krishna jt, 2006; Oostingh jt, 2008). On teatatud, et lühiajaline kokkupuude madala molekulmassiga PAH-idega põhjustab astmaatikutel kopsufunktsiooni häireid ja tromboosi ning suurendab naha-, kopsu-, põie- ja seedetraktivähi riski (Olsson jt, 2010; Diggs jt, 2011). Loomkatsed on samuti näidanud, et PAH-idega kokkupuude võib kahjustada reproduktiivfunktsiooni ja arengut ning põhjustada katarakti, neeru- ja maksakahjustusi ning kollatõbe. On näidatud, et mitmesugused PAH-ide biotransformatsiooni produktid, nagu dioolid, epoksiidid, kinoonid ja vabad radikaalid (katioonid), moodustavad DNA adukte. Stabiilsed aduktid on näidanud, et muudavad DNA replikatsioonimehhanismi, samas kui ebastabiilsed aduktid võivad DNA-d depurineerida (peamiselt adeniiniks ja mõnikord guaniiniks); mõlemad võivad tekitada vigu, mis viivad mutatsioonideni (Schweigert jt 2001). Lisaks võivad kinoonid (benso-/pan-) tekitada reaktiivseid hapnikuühendeid (ROS), põhjustades DNA-le ja teistele makromolekulidele surmavat kahjustust, mõjutades seeläbi kudede funktsiooni/elujõulisust (Ewa ja Danuta 2017). On teatatud, et krooniline kokkupuude püreeni, bifenüüli ja naftaleeni madalate kontsentratsioonidega põhjustab katseloomadel vähki (Diggs jt 2012). Nende surmava toksilisuse tõttu on nende PAH-ide puhastamine/eemaldamine kahjustatud/saastunud kohtadest prioriteet.
PAH-ide eemaldamiseks saastunud kohtadest/keskkondadest on kasutatud mitmesuguseid füüsikalisi ja keemilisi meetodeid. Sellistel protsessidel nagu põletamine, dekloorimine, UV-oksüdeerimine, fikseerimine ja lahustiekstraktsioonil on palju puudusi, sealhulgas toksiliste kõrvalsaaduste teke, protsessi keerukus, ohutus- ja regulatiivsed probleemid, madal efektiivsus ja kõrge hind. Mikroobne biolagundamine (nn biopuhastus) on aga paljulubav alternatiivne lähenemisviis, mis hõlmab mikroorganismide kasutamist puhaskultuuride või kolooniate kujul. Võrreldes füüsikaliste ja keemiliste meetoditega on see protsess keskkonnasõbralik, mitteinvasiivne, kulutõhus ja jätkusuutlik. Biopuhastust saab läbi viia kahjustatud kohas (in situ) või spetsiaalselt ettevalmistatud kohas (ex situ) ning seetõttu peetakse seda jätkusuutlikumaks puhastusmeetodiks kui traditsioonilisi füüsikalisi ja keemilisi meetodeid (Juhasz ja Naidu, 2000; Andreoni ja Gianfreda, 2007; Megharaj jt, 2011; Phale jt, 2020; Sarkar jt, 2020).
Aromaatsete saasteainete lagundamisega seotud mikroobsete ainevahetusetappide mõistmisel on tohutu teaduslik ja majanduslik mõju ökoloogilisele ja keskkonnasäästlikkusele. Hinnanguliselt on kogu maailmas setetes ja orgaanilistes ühendites (st nafta, maagaas ja kivisüsi ehk fossiilkütused) talletatud 2,1 × 1018 grammi süsinikku (C), mis annab olulise panuse globaalsesse süsinikuringlusse. Kiire industrialiseerimine, fossiilkütuste kaevandamine ja inimtegevus aga kahandavad neid litosfääri süsinikureservuaare, vabastades atmosfääri hinnanguliselt 5,5 × 1015 g orgaanilist süsinikku (saasteainetena) aastas (Gonzalez-Gaya jt, 2019). Suurem osa sellest orgaanilisest süsinikust siseneb maismaa- ja mereökosüsteemidesse sette, transpordi ja äravoolu kaudu. Lisaks saastavad fossiilkütustest saadud uued sünteetilised saasteained, nagu plastid, plastifikaatorid ja plastistabilisaatorid (ftalaadid ja nende isomeerid), tõsiselt mere-, pinnase- ja veeökosüsteeme ning nende elustikku, süvendades seeläbi globaalseid kliimariske. Vaikse ookeani põhja-Ameerika ja Kagu-Aasia vahele on kogunenud mitmesuguseid mikroplasti, nanoplasti, plastfragmente ja nende toksilisi monomeerprodukte, mis on saadud polüetüleentereftalaadist (PET), moodustades nn suure Vaikse ookeani prügimäe, kahjustades mereelustikku (Newell jt, 2020). Teaduslikud uuringud on tõestanud, et selliseid saasteaineid/jäätmeid ei ole võimalik eemaldada füüsikaliste ega keemiliste meetoditega. Selles kontekstis on kõige kasulikumad mikroorganismid need, mis on võimelised saasteaineid oksüdatiivselt metaboliseerima süsinikdioksiidiks, keemiliseks energiaks ja muudeks mittetoksilisteks kõrvalsaadusteks, mis lõpuks sisenevad teistesse toitainete ringlusprotsessidesse (H, O, N, S, P, Fe jne). Seega on aromaatsete saasteainete mineralisatsiooni mikroobse ökofüsioloogia ja selle keskkonnakontrolli mõistmine ülioluline mikroobse süsinikuringluse, süsiniku netobilansi ja tulevaste kliimariskide hindamiseks. Arvestades pakilist vajadust sellised ühendid keskkonnast eemaldada, on tekkinud mitmesugused puhastele tehnoloogiatele keskendunud ökotööstused. Teise võimalusena peetakse ökosüsteemides akumuleerunud tööstusjäätmete/jäätmekmikaalide väärindamise meetodit (st jäätmetest rikkuseks lähenemisviisi) ringmajanduse ja säästva arengu eesmärkide üheks alustalaks (Close jt, 2012). Seetõttu on nende potentsiaalsete lagunemiskandidaatide metaboolsete, ensümaatiliste ja geneetiliste aspektide mõistmine äärmiselt oluline selliste aromaatsete saasteainete tõhusaks eemaldamiseks ja biopuhastamiseks.
Paljude aromaatsete saasteainete hulgas pöörame erilist tähelepanu madala molekulmassiga PAH-idele, nagu naftaleen ja asendatud naftaleenid. Need ühendid on nafta baasil toodetud kütuste, tekstiilivärvide, tarbekaupade, pestitsiidide (nahiirte ja putukatõrjevahendite), plastifikaatorite ja tanniinide peamised komponendid ning on seetõttu paljudes ökosüsteemides laialt levinud (Preuss jt, 2003). Hiljutised aruanded toovad esile naftaleeni kontsentratsioonide akumuleerumise põhjaveekihi setetes, põhjavees ja pinnase all olevas pinnases, vadose tsoonides ja jõesängides, mis viitab selle bioakumuleerumisele keskkonnas (Duttagupta jt, 2019, 2020). Tabel 2 võtab kokku naftaleeni ja selle derivaatide füüsikalis-keemilised omadused, rakendused ja tervisemõjud. Võrreldes teiste suure molekulmassiga PAH-idega on naftaleen ja selle derivaadid vähem hüdrofoobsed, vees lahustuvamad ja ökosüsteemides laialdasemalt levinud, mistõttu neid kasutatakse sageli mudelsubstraatidena PAH-ide metabolismi, geneetika ja metaboolse mitmekesisuse uurimiseks. Suur hulk mikroorganisme on võimelised metaboliseerima naftaleeni ja selle derivaate ning nende ainevahetusradade, ensüümide ja regulatiivsete omaduste kohta on saadaval põhjalik teave (Mallick jt, 2011; Phale jt, 2019, 2020). Lisaks on naftaleen ja selle derivaadid oma suure külluse ja biosaadavuse tõttu määratud keskkonnareostuse hindamise prototüüpühenditeks. USA Keskkonnakaitseagentuuri hinnangul on naftaleeni keskmine tase sigaretisuitsus, peamiselt mittetäieliku põlemise tagajärjel, 5,19 μg kuupmeetri kohta ja kõrvalsuitsus 7,8–46 μg, samas kui kreosoodi ja naftaleeniga kokkupuude on 100–10 000 korda suurem (Preuss jt 2003). Eelkõige on naftaleeni puhul leitud liigi-, piirkonna- ja soospetsiifilist hingamisteede toksilisust ja kantserogeensust. Loomkatsete põhjal on Rahvusvaheline Vähiuuringute Agentuur (IARC) klassifitseerinud naftaleeni „võimalikuks inimese kantserogeeniks” (rühm 2B)1. Kokkupuude asendatud naftaleenidega, peamiselt sissehingamise või parenteraalse (suukaudse) manustamise teel, põhjustab kopsukoe kahjustusi ja suurendab kopsukasvajate esinemissagedust rottidel ja hiirtel (riiklik toksikoloogiaprogramm 2). Ägedate mõjude hulka kuuluvad iiveldus, oksendamine, kõhuvalu, kõhulahtisus, peavalu, segasus, tugev higistamine, palavik, tahhükardia jne. Teisest küljest on laia toimespektriga karbamaat-insektitsiid karbarüül (1-naftüül-N-metüülkarbamaat) osutunud mürgiseks veeselgrootutele, kahepaiksetele, mesilastele ja inimestele ning on näidatud, et see pärsib atsetüülkoliinesteraasi, põhjustades paralüüsi (Smulders et al., 2003; Bulen ja Distel, 2011). Seetõttu on mikroobse lagunemise, geneetilise regulatsiooni, ensümaatiliste ja rakuliste reaktsioonide mehhanismide mõistmine saastunud keskkonnas biopuhastusstrateegiate väljatöötamisel ülioluline.
Tabel 2. Üksikasjalik teave naftaleeni ja selle derivaatide füüsikalis-keemiliste omaduste, kasutusalade, identifitseerimismeetodite ja kaasnevate haiguste kohta.
Saastunud niššides võivad hüdrofoobsed ja lipofiilsed aromaatsed saasteained põhjustada keskkonna mikrobioomile (kooslusele) mitmesuguseid rakulisi mõjusid, näiteks muutusi membraani voolavuses, membraani läbilaskvuses, lipiidide kaksikkihi turset, energiaülekande häireid (elektronide transpordiahel/prootonite liikumapanev jõud) ja membraaniga seotud valkude aktiivsust (Sikkema jt, 1995). Lisaks tekitavad mõned lahustuvad vaheühendid, näiteks katehhoolid ja kinoonid, reaktiivseid hapnikuühendeid (ROS) ja moodustavad adukte DNA ja valkudega (Penning jt, 1999). Seega avaldab selliste ühendite rohkus ökosüsteemides mikroobikooslustele selektiivset survet, et nad muutuksid tõhusateks lagundajateks erinevatel füsioloogilistel tasemetel, sealhulgas omastamine/transport, rakusisene transformatsioon, assimilatsioon/kasutamine ja kompartmentalisatsioon.
Ribosoomide andmebaasi projekti II (RDP-II) otsing näitas, et naftaleeni või selle derivaatidega saastunud söötmetest või rikastuskultuuridest eraldati kokku 926 bakteriliiki. Proteobakterite rühmal oli kõige rohkem esindajaid (n = 755), millele järgnesid Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) ja klassifitseerimata bakterid (8) (joonis 2). γ-proteobakterite (Pseudomonadales ja Xanthomonadales) esindajad domineerisid kõigis gramnegatiivsetes rühmades, millel oli kõrge G+C sisaldus (54%), samas kui Clostridiales ja Bacillales (30%) olid grampositiivsed rühmad, millel oli madal G+C sisaldus. Pseudomonas (kõige rohkem, 338 liiki) on võimelised lagundama naftaleeni ja selle metüülderivaate erinevates saastunud ökosüsteemides (kivisöetõrv, nafta, toornafta, setted, naftareostused, reovesi, orgaanilised jäätmed ja prügilad) ning ka tervetes ökosüsteemides (pinnas, jõed, setted ja põhjavesi) (joonis 2). Lisaks näitasid mõnede nende piirkondade rikastusuuringud ja metagenoomiline analüüs, et kultiveerimata Legionella ja Clostridium liikidel võib olla lagundav võime, mis näitab vajadust neid baktereid kultiveerida uute radade ja metaboolse mitmekesisuse uurimiseks.
Joonis 2. Naftaleeni ja naftaleeni derivaatidega saastunud keskkondades esinevate bakterite esindajate taksonoomiline mitmekesisus ja ökoloogiline levik.
Erinevatest aromaatseid süsivesinikke lagundavatest mikroorganismidest on enamik võimelised lagundama naftaleeni, mis on ainsa süsiniku ja energia allikas. Naftaleeni metabolismiga seotud sündmuste jada on kirjeldatud Pseudomonas sp. puhul. (tüved: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 ja CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 ja teised tüved (ND6 ja AS1) (Mahajan jt, 1994; Resnick jt, 1996; Annweiler jt, 2000; Basu jt, 2003; Dennis ja Zylstra, 2004; Sota jt, 2006; Metabolismi käivitab mitmekomponentne dioksügenaas [naftaleendioksügenaas (NDO), tsükli hüdroksüüliv dioksügenaas], mis katalüüsib naftaleeni ühe aromaatse tsükli oksüdeerimist, kasutades teise substraadina molekulaarset hapnikku, muutes naftaleeni cis-naftaleendiooliks (joonis 3). Cis-dihüdrodiool muundatakse dehüdrogenaasi abil 1,2-dihüdroksünaftaleeniks. A Tsüklit lõhustav dioksügenaas, 1,2-dihüdroksünaftaleen-dioksügenaas (12DHNDO), muundab 1,2-dihüdroksünaftaleeni 2-hüdroksükromeen-2-karboksüülhappeks. Ensümaatiline cis-trans-isomerisatsioon annab trans-o-hüdroksübensülideenpüruvaadi, mille hüdrataas-aldolaas lõhustab salitsüülaldehüüdiks ja püruvaadiks. Orgaaniline happepüruvaat oli esimene C3-ühend, mis pärines naftaleeni süsinikuskeletist ja suunati tsentraalsesse süsiniku rada. Lisaks muundab NAD+-sõltuv salitsüülaldehüüddehüdrogenaas salitsüülaldehüüdi salitsüülhappeks. Selles etapis toimuvat ainevahetust nimetatakse naftaleeni lagunemise "ülemiseks rajaks". See rada on enamikus naftaleeni lagundavates bakterites väga levinud. Siiski on ka mõned erandid; näiteks termofiilses Bacillus hamburgii 2-s algatab naftaleeni lagunemise naftaleeni 2,3-dioksügenaas, moodustades 2,3-dihüdroksünaftaleeni (Annweiler jt., 2000).
Joonis 3. Naftaleeni, metüülnaftaleeni, naftoehappe ja karbarüüli lagunemise rajad. Ringis olevad numbrid tähistavad ensüüme, mis vastutavad naftaleeni ja selle derivaatide järjestikuse muundamise eest järgnevateks produktideks. 1 — naftaleendioksigenaas (NDO); 2, cis-dihüdrodiooldehüdrogenaas; 3, 1,2-dihüdroksünaftaleendioksigenaas; 4, 2-hüdroksükromeen-2-karboksüülhappe isomeraas; 5, trans-O-hüdroksübensülideenpüruvaadi hüdrataas-aldolaas; 6, salitsüülaldehüüddehüdrogenaas; 7, salitsülaat-1-hüdroksülaas; 8, katehhool-2,3-dioksigenaas (C23DO); 9, 2-hüdroksümukonaadi semialdehüüddehüdrogenaas; 10, 2-oksopent-4-enoaadi hüdrataas; 11, 4-hüdroksü-2-oksopentanoaadi aldolaas; 12, atseetaldehüüddehüdrogenaas; 13, katehhool-1,2-dioksügenaas (C12DO); 14, mukonaadi tsükloisomeraas; 15, mukonolaktoon delta-isomeraas; 16, β-ketoadipatenollaktoonhüdrolaas; 17, β-ketoadipaat-suktsüül-CoA transferaas; 18, β-ketoadipaat-CoA tiolaas; 19, suktsüül-CoA: atsetüül-CoA suktsüültransferaas; 20, salitsülaat-5-hüdroksülaas; 21 – gentisaat-1,2-dioksügenaas (GDO); 22, maleüülpüruvaadi isomeraas; 23, fumarüülpüruvaadi hüdrolaas; 24, metüülnaftaleeni hüdroksülaas (NDO); 25, hüdroksümetüülnaftaleeni dehüdrogenaas; 26, naftaldehüüddehüdrogenaas; 27, 3-formüülsalitsüülhappe oksüdaas; 28, hüdroksüisoftalaatdekarboksülaas; 29, karbarüülhüdrolaas (CH); 30, 1-naftool-2-hüdroksülaas.
Sõltuvalt organismist ja selle geneetilisest ülesehitusest metaboliseeritakse saadud salitsüülhape edasi kas katehhooli raja kaudu salitsülaat-1-hüdroksülaasi (S1H) abil või gentisaadi raja kaudu salitsülaat-5-hüdroksülaasi (S5H) abil (joonis 3). Kuna salitsüülhape on naftaleeni metabolismi peamine vaheühend (ülemine rada), nimetatakse salitsüülhappest TCA vaheühendini jõudmise etappe sageli alumiseks rajaks ja geenid on organiseeritud ühte operoni. On tavaline näha, et ülemise raja operoni (nah) ja alumise raja operoni (sal) geene reguleerivad ühised regulatiivsed faktorid; näiteks NahR ja salitsüülhape toimivad indutseerijatena, võimaldades mõlemal operonil naftaleeni täielikult metaboliseerida (Phale et al., 2019, 2020).
Lisaks lõhustub katehhool tsükliliselt 2-hüdroksümukonaatsemialdehüüdiks meta-raja kaudu katehhool-2,3-dioksügenaasi (C23DO) abil (Yen jt, 1988) ja hüdrolüüsitakse edasi 2-hüdroksümukonaatsemialdehüüdi hüdrolaasi abil, moodustades 2-hüdroksüpent-2,4-dieenhappe. Seejärel muundatakse 2-hüdroksüpent-2,4-dienoaat püruvaadiks ja atseetaldehüüdiks hüdraasi (2-oksopent-4-enoaathüdrataas) ja aldolaasi (4-hüdroksü-2-oksopentanoaataldolaas) abil ning siseneb seejärel tsentraalsesse süsiniku rajale (joonis 3). Teise võimalusena lõhustub katehhool tsükliliselt cis,cis-mukonaadiks orto-raja kaudu katehhool-1,2-oksügenaasi (C12DO) abil. Mukonaadi tsükloisomeraas, mukonolaktoonisomeraas ja β-ketoadipaat-nollaktoonhüdrolaas muudavad cis,cis-mukonaadi 3-oksoadipaadiks, mis siseneb tsentraalsesse süsiniku rada suktsüül-CoA ja atsetüül-CoA kaudu (Nozaki jt, 1968) (joonis 3).
Gentisaat (2,5-dihüdroksübensoaat) rajas lõhustatakse aromaatne tsükkel gentisaat-1,2-dioksügenaasi (GDO) abil, moodustades maleüülpüruvaadi. Seda produkti saab otse hüdrolüüsida püruvaadiks ja malaadiks või isomeriseerida fumarüülpüruvaadiks, mida saab seejärel hüdrolüüsida püruvaadiks ja fumaraadiks (Larkin ja Day, 1986). Alternatiivse raja valikut on täheldatud nii gramnegatiivsete kui ka grampositiivsete bakterite puhul biokeemilisel ja geneetilisel tasandil (Morawski jt, 1997; Whyte jt, 1997). Gramnegatiivsed bakterid (Pseudomonas) eelistavad kasutada salitsüülhapet, mis on naftaleeni metabolismi indutseerija, dekarboksüülides selle katehooliks salitsülaat-1-hüdroksülaasi abil (Gibson ja Subramanian, 1984). Teisest küljest, grampositiivsetes bakterites (Rhodococcus) muundab salitsülaat-5-hüdroksülaas salitsüülhappe gentishappeks, samas kui salitsüülhappel puudub naftaleenigeenide transkriptsioonile indutseeriv mõju (Grund jt, 1992) (joonis 3).
On teatatud, et sellised liigid nagu Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas ja Mycobacterium suudavad lagundada monometülnaftaleeni või dimetüülnaftaleeni (Dean-Raymond ja Bartha, 1975; Cane ja Williams, 1982; Mahajan jt, 1994; Dutta jt, 1998; Hedlund jt, 1999). Nende hulgas on Pseudomonas sp. CSV86 1-metüülnaftaleeni ja 2-metüülnaftaleeni lagundamise rada selgelt uuritud biokeemilisel ja ensümaatilisel tasandil (Mahajan jt, 1994). 1-metüülnaftaleen metaboliseerub kahel rajal. Esiteks hüdroksüülitakse aromaatne ring (metüülnaftaleeni asendamata ring), moodustades cis-1,2-dihüdroksü-1,2-dihüdro-8-metüülnaftaleeni, mis oksüdeeritakse edasi metüülsalitsülaadiks ja metüülkatehhooliks ning siseneb pärast tsükli lõhustumist tsentraalsesse süsiniku rada (joonis 3). Seda rada nimetatakse "süsinikuallika rajaks". Teises "detoksifitseerimisrajas" saab metüülrühma NDO abil hüdroksüülida, moodustades 1-hüdroksümetüülnaftaleeni, mis oksüdeeritakse edasi 1-naftoehappeks ja eritatakse söötmesse ummikproduktina. Uuringud on näidanud, et tüvi CSV86 ei ole võimeline kasvama 1- ja 2-naftoehappel ainsa süsiniku- ja energiaallikana, mis kinnitab selle detoksifitseerimisrada (Mahajan jt, 1994; Basu jt, 2003). 2-metüülnaftaleenis hüdroksüülitakse metüülrühm hüdroksülaasi abil, moodustades 2-hüdroksümetüülnaftaleeni. Lisaks läbib naftaleenitsükli asendamata tsükkel tsükli hüdroksüülimise, moodustades dihüdrodiooli, mis oksüdeeritakse ensüümide poolt katalüüsitud reaktsioonide seerias 4-hüdroksümetüülkatehhooliks ja siseneb meta-tsükli lõhustumise raja kaudu tsentraalsesse süsiniku rada. Samamoodi on teatatud, et S. paucimobilis 2322 kasutab NDO-d 2-metüülnaftaleeni hüdroksüülimiseks, mis oksüdeeritakse edasi metüülsalitsülaadiks ja metüülkatehhooliks (Dutta et al., 1998).
Naftoehapped (asendatud/asendamata) on detoksifitseerimise/biotransformatsiooni kõrvalsaadused, mis tekivad metüülnaftaleeni, fenantreeni ja antratseeni lagunemisel ning vabanevad kasutatud söötmesse. On teatatud, et mulla isolaat Stenotrophomonas maltophilia CSV89 on võimeline metaboliseerima 1-naftoehapet süsinikuallikana (Phale jt, 1995). Metabolism algab aromaatse tsükli dihüdroksüülimisega, moodustades 1,2-dihüdroksü-8-karboksünaftaleeni. Saadud diool oksüdeeritakse katehooliks 2-hüdroksü-3-karboksübensülideenpüruvaadi, 3-formüülsalitsüülhappe, 2-hüdroksüisoftaalhappe ja salitsüülhappe kaudu ning siseneb tsentraalsesse süsiniku rada meta-tsükli lõhustumise raja kaudu (joonis 3).
Karbarüül on naftüülkarbamaatpestitsiid. Alates 1970. aastate rohelisest revolutsioonist Indias on keemiliste väetiste ja pestitsiidide kasutamine suurendanud polütsükliliste aromaatsete süsivesinike (PAH) heitkoguseid põllumajanduslikest hajusallikatest (Pingali, 2012; Duttagupta jt, 2020). Hinnanguliselt 55% (85 722 000 hektarit) India kogu põllumaast töödeldakse keemiliste pestitsiididega. Viimase viie aasta jooksul (2015–2020) on India põllumajandussektor aastas kasutanud keskmiselt 55 000–60 000 tonni pestitsiide (India valitsuse põllumajandusministeeriumi ühistute ja põllumeeste heaolu osakond, august 2020). Gangesi põhja- ja keskosas (kõrgeima rahvaarvu ja rahvastikutihedusega osariigid) on pestitsiidide kasutamine põllukultuuridel laialt levinud, kusjuures valdavad on insektitsiidid. Karbarüül (1-naftüül-N-metüülkarbamaat) on laia toimespektriga, mõõdukalt kuni väga mürgine karbamaat-insektitsiid, mida kasutatakse India põllumajanduses keskmiselt 100–110 tonni. Seda müüakse tavaliselt kaubanime Sevin all ja seda kasutatakse putukate (lehetäide, tulesipelgate, kirpude, lestade, ämblike ja paljude teiste õuekahjurite) tõrjeks, mis mõjutavad mitmesuguseid põllukultuure (mais, sojauba, puuvill, puu- ja köögiviljad). Mõningaid mikroorganisme, nagu Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus ja Arthrobacter, saab kasutada ka teiste kahjurite tõrjeks. On teatatud, et RC100 suudab lagundada karbarüüli (Larkin ja Day, 1986; Chapalamadugu ja Chaudhry, 1991; Hayatsu jt, 1999; Swetha ja Phale, 2005; Trivedi jt, 2017). Karbarüüli lagunemisrada on põhjalikult uuritud biokeemilisel, ensümaatilisel ja geneetilisel tasemel Pseudomonas sp. tüvede C4, C5 ja C6 mullaisolaatides (Swetha ja Phale, 2005; Trivedi jt, 2016) (joonis 3). Ainevahetusrada algab estersideme hüdrolüüsiga karbarüülhüdrolaasi (CH) abil, moodustades 1-naftooli, metüülamiini ja süsinikdioksiidi. Seejärel muundatakse 1-naftool 1-naftolhüdroksülaasi (1-NH) abil 1,2-dihüdroksünaftaleeniks, mis metaboliseeritakse edasi tsentraalse süsiniku raja kaudu salitsülaadi ja gentisaadi kaudu. On teatatud, et mõned karbarüüli lagundavad bakterid metaboliseerivad selle salitsüülhappeks katehooli orto-tsükli lõhustamise teel (Larkin ja Day, 1986; Chapalamadugu ja Chaudhry, 1991). Tähelepanuväärne on, et naftaleeni lagundavad bakterid metaboliseerivad salitsüülhapet peamiselt katehooli kaudu, samas kui karbarüüli lagundavad bakterid eelistavad metaboliseerida salitsüülhapet gentisaadi raja kaudu.
Naftaleensulfoonhappe/disulfoonhappe ja naftüülamiinsulfoonhappe derivaate saab kasutada vaheühenditena asovärvide, märgavate ainete, dispergeerivate ainete jms tootmisel. Kuigi neil ühenditel on inimestele madal toksilisus, on tsütotoksilisuse hindamised näidanud, et need on kaladele, vesikirpudele ja vetikatele surmavad (Greim jt, 1994). Perekonna Pseudomonas esindajate (tüved A3, C22) metabolismi on kirjeldatud sulfoonhapperühma sisaldava aromaatse tsükli kahekordse hüdroksüülimise teel, moodustades dihüdrodiooli, mis muundatakse edasi 1,2-dihüdroksünaftaleeniks sulfiitrühma spontaanse lõhustumise teel (Brilon jt, 1981). Saadud 1,2-dihüdroksünaftaleen kataboliseeritakse klassikalise naftaleeni raja, st katehhooli või gentisaadi raja kaudu (joonis 4). On näidatud, et aminonaftaleensulfoonhape ja hüdroksünaftaleensulfoonhape on täielikult lagundatud segabakterite konsortsiumide poolt, millel on täiendavad kataboolsed rajad (Nortemann jt, 1986). On näidatud, et üks konsortsiumi liige desulfureerib aminonaftaleensulfoonhappe või hüdroksünaftaleensulfoonhappe 1,2-dioksügenatsiooni teel, samas kui aminosalitsülaat või hüdroksüsalitsülaat vabaneb kultuurikeskkonda ummikmetaboliidina ja seejärel omastatakse selle konsortsiumi teiste liikmete poolt. Naftaleendisulfoonhape on suhteliselt polaarne, kuid halvasti biolagunev ja seetõttu saab seda metaboliseerida erinevate radade kaudu. Esimene desulfureerimine toimub aromaatse tsükli ja sulfoonhapperühma regioselektiivse dihüdroksüülimise ajal; teine ​​desulfureerimine toimub 5-sulfosalitsüülhappe hüdroksüülimise ajal salitsüülhappe 5-hüdroksülaasi abil, moodustades gentishappe, mis siseneb tsentraalsesse süsiniku rada (Brilon jt, 1981) (joonis 4). Naftaleeni lagundamise eest vastutavad ensüümid vastutavad ka naftaleensulfonaadi metabolismi eest (Brilon jt, 1981; Keck jt, 2006).
Joonis 4. Naftaleensulfonaadi lagundamise metaboolsed rajad. Ringides olevad numbrid tähistavad naftüülsulfonaadi metabolismi eest vastutavaid ensüüme, mis on sarnased/identsed joonisel 3 kirjeldatud ensüümidega.
Madala molekulmassiga PAH-id (LMW-PAH-id) on redutseeritavad, hüdrofoobsed ja halvasti lahustuvad ning seetõttu ei ole nad vastuvõtlikud looduslikule lagunemisele/degradatsioonile. Aeroobsed mikroorganismid on aga võimelised neid oksüdeerima, absorbeerides molekulaarset hapnikku (O2). Need ensüümid kuuluvad peamiselt oksüdoreduktaaside klassi ja võivad läbi viia mitmesuguseid reaktsioone, nagu aromaatse tsükli hüdroksüülimine (mono- või dihüdroksüülimine), dehüdrogeenimine ja aromaatse tsükli lõhustamine. Nendest reaktsioonidest saadud produktid on kõrgemas oksüdatsiooniastmes ja metaboliseeruvad kergemini läbi tsentraalse süsiniku raja (Phale jt, 2020). On teatatud, et lagunemisraja ensüümid on indutseeritavad. Nende ensüümide aktiivsus on väga madal või tühine, kui rakke kasvatatakse lihtsatel süsinikuallikatel, nagu glükoos või orgaanilised happed. Tabel 3 võtab kokku naftaleeni ja selle derivaatide metabolismis osalevad erinevad ensüümid (oksügenaasid, hüdrolaasid, dehüdrogenaasid, oksüdaasid jne).
Tabel 3. Naftaleeni ja selle derivaatide lagundamist põhjustavate ensüümide biokeemilised omadused.
Radioisotoopuuringud (18O2) on näidanud, et molekulaarse O2 lisamine aromaatsetesse tsüklitesse oksügenaaside abil on ühendi edasise biolagundamise aktiveerimise kõige olulisem samm (Hayaishi jt, 1955; Mason jt, 1955). Ühe hapnikuaatomi (O) lisamine molekulaarsest hapnikust (O2) substraadile algatatakse kas endogeensete või eksogeensete monooksügenaaside (nimetatakse ka hüdroksülaasideks) poolt. Teine hapnikuaatom redutseeritakse veeks. Eksogeensed monooksügenaasid redutseerivad flaviini NADH või NADPH-ga, samas kui endomonooksügenaasides redutseerib flaviini substraadi toimel. Hüdroksüülimise asend põhjustab produktide moodustumise mitmekesisust. Näiteks salitsülaat-1-hüdroksülaas hüdroksüülib salitsüülhapet C1-positsioonil, moodustades katehhooli. Teisest küljest hüdroksüülib mitmekomponendiline salitsülaat-5-hüdroksülaas (mis sisaldab reduktaasi, ferredoksiini ja oksügenaasi subühikuid) salitsüülhapet C5 positsioonis, moodustades gentishappe (Yamamoto jt, 1965).
Dioksigenaasid inkorporeerivad substraadile kaks O2 aatomit. Sõltuvalt moodustunud produktidest jagunevad nad tsüklit hüdroksüülivateks dioksigenaasideks ja tsüklit lõhustavateks dioksigenaasideks. Tsüklit hüdroksüülivad dioksigenaasid muudavad aromaatsed substraadid cis-dihüdrodioolideks (nt naftaleen) ja on bakterite seas laialt levinud. Praeguseks on näidatud, et tsüklit hüdroksüülivaid dioksigenaase sisaldavad organismid on võimelised kasvama erinevatel aromaatsetel süsinikuallikatel ning need ensüümid klassifitseeritakse NDO-ks (naftaleen), tolueeni dioksigenaasiks (TDO, tolueen) ja bifenüül dioksigenaasiks (BPDO, bifenüül). Nii NDO kui ka BPDO suudavad katalüüsida erinevate polütsükliliste aromaatsete süsivesinike (tolueen, nitrotolueen, ksüleen, etüülbenseen, naftaleen, bifenüül, fluoreen, indool, metüülnaftaleen, naftaleensulfonaat, fenantreen, antratseen, atsetofenoon jne) topeltoksüdatsiooni ja külgahela hüdroksüülimist (Boyd ja Sheldrake, 1998; Phale jt, 2020). NDO on mitmekomponendiline süsteem, mis koosneb oksüdoreduktaasist, ferredoksiinist ja aktiivset kohta sisaldavast oksügenaasi komponendist (Gibson ja Subramanian, 1984; Resnick jt, 1996). NDO katalüütiline üksus koosneb suurest α-alamüksusest ja väikesest β-alamüksusest, mis on paigutatud α3β3 konfiguratsiooni. NDO kuulub suurde oksügenaaside perekonda ja selle α-subühik sisaldab Rieske saiti [2Fe-2S] ja mononukleaarset mitteheemset rauda, ​​mis määrab NDO substraadi spetsiifilisuse (Parales jt, 1998). Tavaliselt kandub ühes katalüütilises tsüklis püridiinnukleotiidi redutseerimisest saadud kaks elektroni aktiivses tsentris olevale Fe(II) ioonile reduktaasi, ferredoksiini ja Rieske saidi kaudu. Redutseerivad ekvivalendid aktiveerivad molekulaarset hapnikku, mis on substraadi dihüdroksüülimise eeltingimus (Ferraro jt, 2005). Praeguseks on erinevatest tüvedest puhastatud ja üksikasjalikult iseloomustatud vaid mõned NDO-d ning naftaleeni lagundamisega seotud radade geneetilist kontrolli on üksikasjalikult uuritud (Resnick jt, 1996; Parales jt, 1998; Karlsson jt, 2003). Ringi lõhustavad dioksügenaasid (endo- või orto-tsükli lõhustavad ensüümid ja eksodiool- või meta-tsükli lõhustavad ensüümid) toimivad hüdroksüülitud aromaatsetele ühenditele. Näiteks orto-tsükli lõhustav dioksügenaas on katehhool-1,2-dioksügenaas, samas kui meta-tsükli lõhustav dioksügenaas on katehhool-2,3-dioksügenaas (Kojima jt, 1961; Nozaki jt, 1968). Lisaks erinevatele oksügenaasidele on olemas ka mitmesugused dehüdrogenaasid, mis vastutavad aromaatsete dihüdrodioolide, alkoholide ja aldehüüdide dehüdrogeenimise eest ning kasutavad elektronaktseptoritena NAD+/NADP+ ioone, mis on mõned olulised metabolismis osalevad ensüümid (Gibson ja Subramanian, 1984; Shaw ja Harayama, 1990; Fahle jt, 2020).
Ensüümid nagu hüdrolaasid (esteraasid, amidaasid) on teine ​​oluline ensüümide klass, mis kasutavad vett kovalentsete sidemete lõhustamiseks ja omavad laia substraadispetsiifilisust. Karbarüülhüdrolaasi ja teisi hüdrolaase peetakse gramnegatiivsete bakterite periplasma (transmembraani) komponentideks (Kamini jt, 2018). Karbarüülil on nii amiid- kui ka esterside; seetõttu saab seda hüdrolüüsida kas esteraasi või amidaasiga, moodustades 1-naftooli. On teatatud, et karbarüül Rhizobium rhizobium tüves AC10023 ja Arthrobacteri tüves RC100 toimib vastavalt esteraasi ja amidaasina. Karbarüül Arthrobacteri tüves RC100 toimib samuti amidaasina. On näidatud, et RC100 hüdrolüüsib nelja N-metüülkarbamaadi klassi insektitsiidi, nagu karbarüül, metomüül, mefenaamhape ja XMC (Hayaatsu jt, 2001). On teatatud, et CH Pseudomonas sp. C5pp võib toimida karbarüülile (100% aktiivsus) ja 1-naftüülatsetaadile (36% aktiivsus), kuid mitte 1-naftüülatseetamiidile, mis näitab, et tegemist on esteraasiga (Trivedi jt, 2016).
Biokeemilised uuringud, ensüümide regulatsioonimustrid ja geneetiline analüüs on näidanud, et naftaleeni lagundamise geenid koosnevad kahest indutseeritavast regulatiivsest ühikust ehk "operonist": nah ("ülesvoolu rada", mis muundab naftaleeni salitsüülhappeks) ja sal ("allavoolu rada", mis muundab salitsüülhappe katehooli kaudu tsentraalseks süsiniku rajaks). Salitsüülhape ja selle analoogid võivad toimida indutseerijatena (Shamsuzzaman ja Barnsley, 1974). Glükoosi või orgaaniliste hapete juuresolekul operon represseeritakse. Joonis 5 näitab naftaleeni lagundamise täielikku geneetilist korraldust (operoni kujul). On kirjeldatud mitmeid nah geeni variante/vorme (ndo/pah/dox), millel on leitud olevat kõrge järjestuse homoloogia (90%) kõigi Pseudomonas liikide seas (Abbasian et al., 2016). Naftaleeni ülesvoolu raja geenid olid üldiselt paigutatud konsensusjärjekorda, nagu on näidatud joonisel 5A. Teine geen, nahQ, osaleb samuti naftaleeni metabolismis ja paikneb tavaliselt nahC ja nahE vahel, kuid selle tegelik funktsioon vajab veel selgitamist. Samamoodi leiti mõnedel liikmetel nah-operoni distaalsest otsast nahY geen, mis vastutab naftaleeni suhtes tundliku kemotaksise eest. Ralstonia sp. puhul leiti, et glutatiooni S-transferaasi (gsh) kodeeriv U2 geen paikneb nahAa ja nahAb vahel, kuid see ei mõjutanud naftaleeni kasutamise omadusi (Zylstra et al., 1997).
Joonis 5. Naftaleeni lagundamise ajal bakteriliikide seas täheldatud geneetiline organisatsioon ja mitmekesisus; (A) Naftaleeni ülemine rada, naftaleeni metabolism salitsüülhappeks; (B) Naftaleeni alumine rada, salitsüülhape katehooli kaudu tsentraalsele süsiniku rajale; (C) salitsüülhape gentisaadi kaudu tsentraalsele süsiniku rajale.
„Alumine rada“ (sal-operon) koosneb tavaliselt nahGTHINLMOKJ-st ja muundab salitsülaadi püruvaadiks ja atseetaldehüüdiks katehooli metaringi lõhustumisraja kaudu. Leiti, et nahG geen (mis kodeerib salitsülaadi hüdroksülaasi) on operoni proksimaalses otsas konserveerunud (joonis 5B). Võrreldes teiste naftaleeni lagundavate tüvedega on P. putida CSV86-s nah- ja sal-operonid tandemid ja väga lähedalt seotud (umbes 7,5 kb). Mõnedes gramnegatiivsetes bakterites, näiteks Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 ja P. putida AK5, metaboliseerub naftaleen tsentraalse süsiniku metaboliidina gentisaadi raja kaudu (sgp/nag-operoni kujul). Geenikassetti esindab tavaliselt kuju nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, kus nagR (kodeerib LysR-tüüpi regulaatorit) asub ülemises otsas (joonis 5C).
Karbarüül siseneb tsentraalsesse süsinikutsüklisse 1-naftooli, 1,2-dihüdroksünaftaleeni, salitsüülhappe ja gentisiinhappe metabolismi kaudu (joonis 3). Geneetiliste ja metaboolsete uuringute põhjal on pakutud jagada see rada „ülesvooluks“ (karbarüüli muundamine salitsüülhappeks), „keskmiseks“ (salitsüülhappe muundamine gentisiinhappeks) ja „allavoolu“ (gentisiinhappe muundamine tsentraalse süsiniku raja vaheühenditeks) (Singh jt, 2013). C5pp (superkontig A, 76,3 kb) genoomne analüüs näitas, et mcbACBDEF geen osaleb karbarüüli muundamisel salitsüülhappeks, millele järgneb mcbIJKL salitsüülhappe muundamisel gentisiinhappeks ja mcbOQP gentisiinhappe muundamisel tsentraalseteks süsiniku vaheühenditeks (fumaraat ja püruvaat, Trivedi jt, 2016) (joonis 6).
On teatatud, et aromaatsete süsivesinike (sealhulgas naftaleeni ja salitsüülhappe) lagundamisega seotud ensüüme saab indutseerida vastavate ühendite poolt ja pärssida lihtsate süsinikuallikatega, nagu glükoos või orgaanilised happed (Shingler, 2003; Phale jt, 2019, 2020). Naftaleeni ja selle derivaatide erinevate ainevahetusradade hulgas on teatud määral uuritud naftaleeni ja karbarüüli regulatiivseid omadusi. Naftaleeni puhul reguleerib nii üles- kui ka allavoolu radade geene NahR, mis on LysR-tüüpi trans-toimega positiivne regulaator. See on vajalik nah-geeni indutseerimiseks salitsüülhappe poolt ja selle järgnevaks kõrgetasemeliseks ekspressiooniks (Yen ja Gunsalus, 1982). Lisaks on uuringud näidanud, et integreeriv peremeesfaktor (IHF) ja XylR (sigma 54-sõltuv transkriptsiooniregulaator) on samuti olulised naftaleeni metabolismi geenide transkriptsioonilise aktiveerimise jaoks (Ramos jt, 1997). Uuringud on näidanud, et naftaleeni ja/või salitsüülhappe juuresolekul indutseeritakse katehhooli meta-tsükli avanemise raja ensüüme, nimelt katehhooli 2,3-dioksügenaasi (Basu jt, 2006). Uuringud on näidanud, et bensoehappe ja cis,cis-mukonaadi juuresolekul indutseeritakse katehhooli orto-tsükli avanemise raja ensüüme, nimelt katehhooli 1,2-dioksügenaasi (Parsek jt, 1994; Tover jt, 2001).
Tüves C5pp kodeerivad viis geeni – mcbG, mcbH, mcbN, mcbR ja mcbS – regulaatoreid, mis kuuluvad LysR/TetR perekonda – transkriptsiooniregulaatorid, mis vastutavad karbarüüli lagunemise kontrollimise eest. Homoloogne geen mcbG osutus kõige tihedamalt seotud LysR-tüüpi regulaatoriga PhnS (58% aminohappe identsus), mis osaleb fenantreeni metabolismis Burkholderia RP00725-s (Trivedi jt, 2016). Leiti, et mcbH geen osaleb vaherajas (salitsüülhappe muundamine gentishappeks) ja kuulub LysR-tüüpi transkriptsiooniregulaatorisse NagR/DntR/NahR nii Pseudomonas'es kui ka Burkholderia's. Selle perekonna liikmetel on teatatud salitsüülhappe äratundmisest spetsiifilise efektormolekulina lagunemisgeenide indutseerimiseks. Teisest küljest identifitseeriti allavoolu rajas (gentisaat-tsentraalse süsiniku raja metaboliidid) kolm geeni, mcbN, mcbR ja mcbS, mis kuuluvad LysR ja TetR tüüpi transkriptsiooniregulaatoritesse.
Prokarüootides on horisontaalsed geeniülekande protsessid (omandamine, vahetamine või ülekanne) plasmiidide, transposoonide, profaagide, genoomsete saarte ja integratiivsete konjugatiivsete elementide (ICE) kaudu bakterite genoomide plastilisuse peamised põhjused, mis viivad spetsiifiliste funktsioonide/omaduste omandamiseni või kadumiseni. See võimaldab bakteritel kiiresti kohaneda erinevate keskkonnatingimustega, pakkudes peremeesorganismile potentsiaalseid adaptiivseid metaboolseid eeliseid, näiteks aromaatsete ühendite lagundamine. Ainevahetuslikke muutusi saavutatakse sageli lagundusoperonite, nende regulatiivsete mehhanismide ja ensüümide spetsiifilisuse peenhäälestamise kaudu, mis hõlbustab laiema valiku aromaatsete ühendite lagundamist (Nojiri jt, 2004; Phale jt, 2019, 2020). Naftaleeni lagundamise geenikassetid on leitud paiknevat mitmesugustel mobiilsetel elementidel, nagu plasmiidid (konjugatiivsed ja mittekonjugatiivsed), transposoonid, genoomid, ICE-d ja erinevate bakteriliikide kombinatsioonid (joonis 5). Pseudomonas G7-s transkribeeritakse plasmiidi NAH7 nah- ja sal-operonid samas orientatsioonis ning need on osa defektsest transposoonist, mis vajab mobiliseerimiseks transposaasi Tn4653 (Sota jt, 2006). Pseudomonas tüves NCIB9816-4 leiti geen konjugatiivsel plasmiidil pDTG1 kahe operonina (umbes 15 kb kaugusel teineteisest), mis transkribeeriti vastassuundades (Dennis ja Zylstra, 2004). Pseudomonas putida tüves AK5 kodeerib mittekonjugatiivne plasmiid pAK5 ensüümi, mis vastutab naftaleeni lagundamise eest gentisaadi raja kaudu (Izmalkova jt, 2013). Pseudomonas tüves PMD-1 asub nah-operon kromosoomis, samas kui sal-operon asub konjugatiivsel plasmiidil pMWD-1 (Zuniga jt, 1981). Pseudomonas stutzeri AN10 puhul paiknevad aga kõik naftaleeni lagundamise geenid (nah- ja sal-operonid) kromosoomis ja neid värvatakse arvatavasti transpositsiooni, rekombinatsiooni ja ümberkorralduste kaudu (Bosch jt, 2000). Pseudomonas sp. CSV86 puhul paiknevad nah- ja sal-operonid genoomis ICE (ICECSV86) kujul. Struktuuri kaitseb tRNAGly, millele järgnevad otsesed kordused, mis näitavad rekombinatsiooni-/kinnituskohti (attR ja attL) ning faagilaadne integraas, mis paikneb tRNAGly mõlemas otsas, seega struktuurilt sarnane ICEclc elemendiga (ICEclcB13 Pseudomonas knackmusiis klorokatehhooli lagundamiseks). On teatatud, et ICE-l olevaid geene saab konjugeerimise teel üle kanda äärmiselt madala ülekandesagedusega (10-8), kandes seeläbi lagunemisomadused retsipienti (Basu ja Phale, 2008; Phale jt, 2019).
Enamik karbarüüli lagundamise eest vastutavaid geene paikneb plasmiididel. Arthrobacter sp. RC100 sisaldab kolme plasmiidi (pRC1, pRC2 ja pRC300), millest kaks konjugatiivset plasmiidi, pRC1 ja pRC2, kodeerivad ensüüme, mis muundavad karbarüüli gentisaadiks. Teisest küljest paiknevad ensüümid, mis osalevad gentisaadi muundamisel tsentraalseteks süsiniku metaboliitideks, kromosoomis (Hayaatsu et al., 1999). Perekonna Rhizobium bakterid. Tüvi AC100, mida kasutatakse karbarüüli muundamiseks 1-naftooliks, sisaldab plasmiidi pAC200, mis kannab cehA geeni, mis kodeerib CH-d Tnceh transposooni osana, mida ümbritsevad insertsioonielemendi sarnased järjestused (istA ja istB) (Hashimoto et al., 2002). Sphingomonas tüves CF06 arvatakse, et karbarüüli degradatsiooni geen esineb viies plasmiidis: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 ja pCF05. Nende plasmiidide DNA homoloogia on kõrge, mis viitab geeni dubleerimise olemasolule (Feng jt, 1997). Kahest Pseudomonas liigist koosnevas karbarüüli lagundavas sümbiontis sisaldab tüvi 50581 konjugatiivset plasmiidi pCD1 (50 kb), mis kodeerib mcd karbarüüli hüdrolaasi geeni, samas kui tüve 50552 konjugatiivne plasmiid kodeerib 1-naftooli lagundavat ensüümi (Chapalamadugu ja Chaudhry, 1991). Achromobacter tüves WM111 asub mcd furadaani hüdrolaasi geen 100 kb plasmiidil (pPDL11). On näidatud, et see geen esineb erinevatel plasmiididel (100, 105, 115 või 124 kb) erinevates geograafilistes piirkondades asuvates bakterites (Parekh jt, 1995). Pseudomonas sp. C5pp puhul paiknevad kõik karbarüüli lagundamisega seotud geenid genoomis, mis hõlmab 76,3 kb järjestust (Trivedi jt, 2016). Genoomi analüüs (6,15 Mb) näitas 42 MGE ja 36 GEI olemasolu, millest 17 MGE-d paiknesid superkontiigis A (76,3 kb) keskmise asümmeetrilise G+C sisaldusega (54–60 mol%), mis viitab võimalikele horisontaalsetele geeniülekande sündmustele (Trivedi jt, 2016). P. putida XWY-1-l on sarnane karbarüüli lagundavate geenide paigutus, kuid need geenid paiknevad plasmiidil (Zhu jt, 2019).
Lisaks metaboolsele efektiivsusele biokeemilisel ja genoomsel tasandil on mikroorganismidel ka muid omadusi või reaktsioone, nagu kemotaksis, rakupinna modifitseerimise omadused, kompartmentaliseerumine, eelistuslik kasutamine, biopindaktiivsete ainete tootmine jne, mis aitavad neil saastunud keskkonnas aromaatseid saasteaineid tõhusamalt metaboliseerida (joonis 7).
Joonis 7. Ideaalsete aromaatseid süsivesinikke lagundavate bakterite erinevad rakulised reageerimisstrateegiad võõraste saasteainete tõhusaks biolagundamiseks.
Kemotaktilisi reaktsioone peetakse teguriteks, mis soodustavad orgaaniliste saasteainete lagunemist heterogeenselt saastunud ökosüsteemides. (2002) näitas, et Pseudomonas sp. G7 kemotaksis naftaleenile suurendas naftaleeni lagunemise kiirust veesüsteemides. Metsiktüüpi tüvi G7 lagundas naftaleeni palju kiiremini kui kemotaksise-defitsiitse mutanttüvi. Leiti, et NahY valk (538 aminohapet membraantopoloogiaga) transkribeeriti koos metakleevatsiooni raja geenidega NAH7 plasmiidil ja sarnaselt kemotaksise muunduritele näib see valk toimivat naftaleeni lagunemise kemoretseptorina (Grimm ja Harwood 1997). Teine Hansel jt (2009) uuring näitas, et valk on kemotaktiline, kuid selle lagunemiskiirus on kõrge. (2011) näitas Pseudomonas (P. putida) kemotaktilist vastust gaasilisele naftaleenile, kusjuures gaasifaasi difusioon põhjustas naftaleeni püsiva voolu rakkudesse, mis kontrollis rakkude kemotaktilist vastust. Teadlased kasutasid seda kemotaktilist käitumist ära, et luua mikroobe, mis kiirendaksid lagunemist. Uuringud on näidanud, et kemosensoorsed rajad reguleerivad ka teisi rakulisi funktsioone, nagu rakkude jagunemine, rakutsükli regulatsioon ja biokile moodustumine, aidates seeläbi kontrollida lagunemise kiirust. Selle omaduse (kemotaksise) rakendamist tõhusaks lagunemiseks takistavad aga mitmed kitsaskohad. Peamised takistused on: (a) erinevad paraloogsed retseptorid tunnevad ära samu ühendeid/ligande; (b) alternatiivsete retseptorite olemasolu, st energeetiline tropism; (c) olulised järjestuse erinevused sama retseptoriperekonna sensoorsetes domeenides; ja (d) teabe puudumine peamiste bakteriaalsete sensorvalkude kohta (Ortega jt, 2017; Martin-Mora jt, 2018). Mõnikord tekitab aromaatsete süsivesinike biolagundamine mitu metaboliiti/vaheühendit, mis võivad olla ühe bakterirühma jaoks kemotaktilised, kuid teiste jaoks eemaletõukavad, mis muudab protsessi veelgi keerulisemaks. Ligandide (aromaatsete süsivesinike) ja keemiliste retseptorite interaktsioonide tuvastamiseks konstrueerisime hübriidsed sensorvalgud (PcaY, McfR ja NahY), ühendades Pseudomonas putida ja Escherichia coli sensor- ja signaalidomeenid, mis on suunatud vastavalt aromaatsete hapete, TCA vaheühendite ja naftaleeni retseptoritele (Luu jt, 2019).
Naftaleeni ja teiste polütsükliliste aromaatsete süsivesinike (PAH-ide) mõjul muutuvad bakterimembraani struktuur ja mikroorganismide terviklikkus märkimisväärselt. Uuringud on näidanud, et naftaleen häirib atsüülahela interaktsiooni hüdrofoobsete interaktsioonide kaudu, suurendades seeläbi membraani turset ja voolavust (Sikkema jt, 1995). Selle kahjuliku mõju neutraliseerimiseks reguleerivad bakterid membraani voolavust, muutes iso/anteiso hargnenud ahelaga rasvhapete suhet ja rasvhapete koostist ning isomeriseerides cis-küllastumata rasvhappeid vastavateks trans-isomeerideks (Heipieper ja de Bont, 1994). Naftaleenil kasvatatud Pseudomonas stutzeri puhul suurenes küllastunud ja küllastumata rasvhapete suhe 1,1-lt 2,1-le, samas kui Pseudomonas JS150 puhul suurenes see suhe 7,5-lt 12,0-le (Mrozik jt, 2004). Naftaleenil kasvatatuna ilmnes Achromobacter KAs 3–5 rakkude agregatsioon naftaleenikristallide ümber ja raku pinnalaengu vähenemine (-22,5 mV-lt -2,5 mV-ni), millega kaasnes tsütoplasmaatiline kondensatsioon ja vakuolisatsioon, mis viitab muutustele raku struktuuris ja raku pinna omadustes (Mohapatra jt, 2019). Kuigi raku/pinna muutused on otseselt seotud aromaatsete saasteainete parema omastamisega, pole asjakohaseid bioinseneri strateegiaid põhjalikult optimeeritud. Rakkude kuju manipuleerimist on bioloogiliste protsesside optimeerimiseks harva kasutatud (Volke ja Nikel, 2018). Rakkude jagunemist mõjutavate geenide deletsioon põhjustab muutusi raku morfoloogias. Rakkude jagunemist mõjutavate geenide deletsioon põhjustab muutusi raku morfoloogias. Bacillus subtilis'es on näidatud, et raku vaheseina valk SepF osaleb vaheseina moodustumisel ja on vajalik rakkude jagunemise järgnevate etappide jaoks, kuid see ei ole oluline geen. Peptiidglükaani hüdrolaase kodeerivate geenide deletsioon Bacillus subtilis'es põhjustas rakkude pikenemist, suurenenud erikasvukiirust ja paranenud ensüümide tootmisvõimet (Cui et al., 2018).
Pseudomonas tüvede C5pp ja C7 tõhusa lagundamise saavutamiseks on pakutud välja karbarüüli lagunemisraja kompartmentaliseerimine (Kamini jt, 2018). On oletatud, et karbarüül transporditakse periplasmaatilisse ruumi läbi välismembraani vaheseina ja/või difundeeruvate poriinide. CH on periplasmaatiline ensüüm, mis katalüüsib karbarüüli hüdrolüüsi 1-naftooliks, mis on stabiilsem, hüdrofoobsem ja toksilisem. CH lokaliseerub periplasmas ja omab karbarüüli suhtes madalat afiinsust, kontrollides seega 1-naftooli moodustumist, takistades seeläbi selle akumuleerumist rakkudes ja vähendades selle toksilisust rakkudele (Kamini jt, 2018). Saadud 1-naftool transporditakse tsütoplasmasse läbi sisemembraani jaotumise ja/või difusiooni teel ning seejärel hüdroksüülitakse see kõrge afiinsusega ensüümi 1NH abil 1,2-dihüdroksünaftaleeniks edasiseks metabolismiks tsentraalses süsiniku rajas.
Kuigi mikroorganismidel on geneetilised ja metaboolsed võimed lagundada ksenobiootilisi süsinikuallikaid, on nende kasutamise hierarhiline struktuur (st lihtsate süsinikuallikate eelistamine keeruliste süsinikuallikate ees) biolagundamise peamiseks takistuseks. Lihtsate süsinikuallikate olemasolu ja kasutamine reguleerib alla geene, mis kodeerivad ensüüme, mis lagundavad keerulisi/mitte-eelistatud süsinikuallikaid, näiteks PAH-e. Hästi uuritud näide on see, et kui Escherichia colile antakse koos glükoosi ja laktoosi, siis glükoosi kasutatakse efektiivsemalt kui laktoosi (Jacob ja Monod, 1965). On teatatud, et Pseudomonas lagundab süsinikuallikatena mitmesuguseid PAH-e ja ksenobiootilisi ühendeid. Pseudomonas'e süsinikuallika kasutamise hierarhia on orgaanilised happed > glükoos > aromaatsed ühendid (Hylemon ja Phibbs, 1972; Collier jt, 1996). Siiski on ka erand. Huvitaval kombel lagundab Pseudomonas sp. CSV86-l on ainulaadne hierarhiline struktuur, mis eelistatavalt kasutab aromaatseid süsivesinikke (bensoehape, naftaleen jne) glükoosi asemel ja metaboliseerib aromaatseid süsivesinikke koos orgaaniliste hapetega (Basu jt, 2006). Selles bakteris ei ole aromaatsete süsivesinike lagundamise ja transpordi geenid allareguleeritud isegi teise süsinikuallika, näiteks glükoosi või orgaaniliste hapete juuresolekul. Glükoosi ja aromaatsete süsivesinike keskkonnas kasvatamisel täheldati, et glükoosi transpordi ja metabolismi geenid olid allareguleeritud, aromaatseid süsivesinikke kasutati esimeses logaritmilises faasis ja glükoosi teises logaritmilises faasis (Basu jt, 2006; Choudhary jt, 2017). Teisest küljest ei mõjutanud orgaaniliste hapete olemasolu aromaatsete süsivesinike metabolismi ekspressiooni, seega eeldatakse, et see bakter on biolagundamise uuringute kandidaattüvi (Phale jt, 2020).
On hästi teada, et süsivesinike biotransformatsioon võib mikroorganismides põhjustada oksüdatiivset stressi ja antioksüdantsete ensüümide ülesreguleerimist. Naftaleeni ebaefektiivne biolagundamine nii statsionaarse faasi rakkudes kui ka toksiliste ühendite juuresolekul viib reaktiivsete hapnikuühendite (ROS) moodustumiseni (Kang jt 2006). Kuna naftaleeni lagundavad ensüümid sisaldavad raua-väävli klastreid, siis oksüdatiivse stressi all oksüdeerub heemis ja raua-väävli valkudes olev raud, mis viib valkude inaktiveerimiseni. Ferredoksiin-NADP+ reduktaas (Fpr) koos superoksiiddismutaasiga (SOD) vahendab pöörduvat redoksreaktsiooni NADP+/NADPH ja kahe ferredoksiini või flavodoksiini molekuli vahel, püüdes seeläbi ROS-i ja taastades raua-väävli keskuse oksüdatiivse stressi all (Li jt 2006). On teatatud, et nii Fpr kui ka SodA (SOD) Pseudomonas'es võivad olla indutseeritavad oksüdatiivse stressi poolt ning neljas Pseudomonas'e tüves (O1, W1, As1 ja G1) täheldati naftaleeni lisatud tingimustes kasvatamise ajal suurenenud SOD ja katalaasi aktiivsust (Kang jt, 2006). Uuringud on näidanud, et antioksüdantide, näiteks askorbiinhappe või raud(II)ioonide (Fe2+) lisamine võib suurendada naftaleeni kasvukiirust. Kui Rhodococcus erythropolis kasvas naftaleenikeskkonnas, suurenes oksüdatiivse stressiga seotud tsütokroom P450 geenide, sealhulgas sodA (Fe/Mn superoksiiddismutaas), sodC (Cu/Zn superoksiiddismutaas) ja recA transkriptsioon (Sazykin jt, 2019). Naftaleenis kultiveeritud Pseudomonas'e rakkude võrdlev kvantitatiivne proteoomiline analüüs näitas, et oksüdatiivse stressivastusega seotud erinevate valkude ülesreguleerimine on stressiga toimetuleku strateegia (Herbst jt, 2013).
On teatatud, et mikroorganismid toodavad biopindaktiivseid aineid hüdrofoobsete süsinikuallikate toimel. Need pindaktiivsed ained on amfifiilsed pindaktiivsed ühendid, mis võivad moodustada agregaate õli-vee või õhu-vee piirpindadel. See soodustab pseudo-lahustumist ja hõlbustab aromaatsete süsivesinike adsorptsiooni, mille tulemuseks on tõhus biolagundamine (Rahman et al., 2002). Nende omaduste tõttu kasutatakse biopindaktiivseid aineid laialdaselt erinevates tööstusharudes. Keemiliste pindaktiivsete ainete või biopindaktiivsete ainete lisamine bakterikultuuridele võib suurendada süsivesinike lagunemise efektiivsust ja kiirust. Biopindaktiivsete ainete hulgas on Pseudomonas aeruginosa poolt toodetud ramnolipiide põhjalikult uuritud ja iseloomustatud (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). Lisaks kuuluvad teist tüüpi biosurfaktantide hulka lipopeptiidid (mutsiinid bakterist Pseudomonas fluorescens), emulgaator 378 (bakterist Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg ja Ron, 1999), trehaloosdisahhariidi lipiidid bakterist Rhodococcus (Ramdahl, 1985), lihheniin bakterist Bacillus (Saraswathy ja Hallberg, 2002) ning pindaktiivsed ained bakteritest Bacillus subtilis (Siegmund ja Wagner, 1991) ja Bacillus amyloliquefaciens (Zhi jt, 2017). On näidatud, et need tugevad pindaktiivsed ained vähendavad pindpinevust 72 düünilt/cm vähem kui 30 düüni/cm-ni, võimaldades paremat süsivesinike imendumist. On teatatud, et Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia ja teised bakteriliigid suudavad naftaleeni- ja metüülnaftaleenikeskkonnas kasvatades toota mitmesuguseid ramnolipiidide ja glükolipiidide baasil biosurfaktante (Kanga jt, 1997; Puntus jt, 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89 suudab aromaatsetel ühenditel, näiteks naftoehappel, kasvatades toota rakuvälist biosurfaktanti Biosur-Pm (Phale jt, 1995). Biosur-Pm moodustumise kineetika näitas, et selle süntees on kasvust ja pH-st sõltuv protsess. Leiti, et rakkude poolt neutraalse pH juures toodetud Biosur-Pm kogus oli suurem kui pH 8,5 juures. pH 8,5 juures kasvatatud rakud olid hüdrofoobsemad ja neil oli suurem afiinsus aromaatsete ja alifaatsete ühendite suhtes kui pH 7,0 juures kasvatatud rakkudel. Rhodococcus spp. N6, kõrgem süsiniku ja lämmastiku (C:N) suhe ning raua piiratus on optimaalsed tingimused rakuväliste biosurfaktantide tootmiseks (Mutalik jt, 2008). Biosurfaktantide (surfaktiinide) biosünteesi on püütud parandada tüvede ja fermentatsiooni optimeerimise teel. Pindaktiivse aine tiiter kultuurikeskkonnas on aga madal (1,0 g/l), mis tekitab väljakutse suurtootmisele (Jiao jt, 2017; Wu jt, 2019). Seetõttu on selle biosünteesi parandamiseks kasutatud geenitehnoloogia meetodeid. Selle insenertehniline modifitseerimine on aga keeruline operoni suure suuruse (∼25 kb) ja kvoorumi tuvastamise süsteemi keeruka biosünteesi regulatsiooni tõttu (Jiao jt, 2017; Wu jt, 2019). Bacillus bakterites on läbi viidud mitmeid geenitehnoloogilisi modifikatsioone, mille peamine eesmärk on suurendada surfaktiini tootmist promootori (srfA operoni) asendamise, surfaktiini eksportvalgu YerP ning regulatiivsete faktorite ComX ja PhrC üleekspresseerimise teel (Jiao jt, 2017). Need geenitehnoloogilised meetodid on aga saavutanud vaid ühe või mõned geneetilised modifikatsioonid ja pole veel jõudnud kaubandusliku tootmiseni. Seetõttu on vaja teadmistepõhiste optimeerimismeetodite edasist uurimist.
PAH-ide biolagundamise uuringuid viiakse peamiselt läbi standardsetes laboritingimustes. Saastunud kohtades või keskkonnas on aga näidatud, et paljud abiootilised ja biootilised tegurid (temperatuur, pH, hapnik, toitainete kättesaadavus, substraadi biosaadavus, muud ksenobiootikumid, lõppsaaduste inhibeerimine jne) muudavad ja mõjutavad mikroorganismide lagundamisvõimet.
Temperatuuril on PAH-ide biolagundamise seisukohalt oluline mõju. Temperatuuri tõustes väheneb lahustunud hapniku kontsentratsioon, mis mõjutab aeroobsete mikroorganismide ainevahetust, kuna nad vajavad molekulaarset hapnikku ühe substraadina oksügenaasidele, mis viivad läbi hüdroksüülimise või tsükli lõhustumise reaktsioone. Sageli on märgitud, et kõrgem temperatuur muudab lähte-PAH-id toksilisemateks ühenditeks, pärssides seeläbi biolagunemist (Muller jt, 1998).
On täheldatud, et paljudel PAH-idega saastunud aladel on äärmuslikud pH väärtused, näiteks happelise kaevandusdrenaažiga saastunud aladel (pH 1–4) ja aluselise nõrgveega saastunud maagaasi/kivisöe gaasistamisaladel (pH 8–12). Need tingimused võivad biolagundamise protsessi tõsiselt mõjutada. Seetõttu on enne mikroorganismide kasutamist biopuhastuseks soovitatav pH-d reguleerida, lisades sobivaid kemikaale (mõõduka kuni väga madala oksüdatsiooni-redutseerimise potentsiaaliga), näiteks ammooniumsulfaati või ammooniumnitraati aluseliste muldade puhul või lupjamist kaltsiumkarbonaadi või magneesiumkarbonaadiga happeliste alade puhul (Bowlen jt 1995; Gupta ja Sar 2020).
Hapnikuga varustamine kahjustatud piirkonda on PAH-ide biolagundamise kiirust piirav tegur. Keskkonna redokstingimuste tõttu vajavad kohapealsed biopuhastusprotsessid tavaliselt hapniku lisamist välistest allikatest (harimine, õhuga läbipuhumine ja kemikaalide lisamine) (Pardieck jt, 1992). Odenkranz jt (1996) näitasid, et magneesiumperoksiidi (hapnikku vabastav ühend) lisamine saastunud põhjaveekihti võib BTEX-ühendeid tõhusalt biopuhastada. Teises uuringus uuriti fenooli ja BTEX-i kohapealset lagunemist saastunud põhjaveekihis naatriumnitraadi süstimise ja ekstraheerimiskaevude rajamise abil tõhusa biopuhastuse saavutamiseks (Bewley ja Webb, 2001).