Praegune asukoht†Praegune aadress: OX11 0DE, Ühendkuningriik, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Ühendkuningriik, Diamond Light Source Co., Ltd., Elektroonilise Bioloogilise Kujundamise Keskus.
Reaktsioonikeskuse valgust koguv kompleks 1 (RC-LH1) on lillade fototroofsete bakterite põhifotosünteesi komponent. Tutvustasime Rhodopseudomonas palustris'e RC-LH1 kompleksi kahte krüoelektronmikroskoopia struktuuri. RC-LH114-W kompleksi 2,65 Å resolutsiooniga struktuur koosneb 14 alaühiku LH1 silmusest, mis ümbritsevad RC-d ja mille katkestab valk W, samas kui kompleks ilma valku-W-ta on täielikult RC koostisega, mida ümbritseb RC. Suletud 16 alaühiku LH1 silmus. Nende struktuuride võrdlus annab ülevaate kinooni dünaamikast RC-LH1 kompleksis, sealhulgas varem määramata konformatsioonilistest muutustest kinooni sidumisel RC QB saidile, samuti kinooni abisidumiskohtade asukohast, mis aitavad neil RC-le edasi liikuda. W-valgu ainulaadne struktuur hoiab ära LH1 silmuse sulgumise, luues seeläbi kanali kinooni/kinolooni vahetuse kiirendamiseks.
Fotosünteesi abil saadav energia suudab säilitada peaaegu kogu elu Maal ning sellel on suur potentsiaal päikese biotehnoloogia jaoks. Lisaks globaalse fotosünteesi edendamisele on lilladel fototroofsetel bakteritel ka mitmesuguseid energiavorme ja ainevahetusvõimeid. Nad suudavad fotosünteesi vältida ja kasvada pimedas heterotroofsete bakteritena, siduda lämmastikku ja süsinikdioksiidi, toota vesinikku ja lagundada aromaatseid ühendeid (1-3). Nende protsesside jaoks energia tagamiseks tuleb valgus kiiresti ja tõhusalt keemiliseks energiaks muuta. See protsess algab siis, kui valgust püüdev antennikompleks neelab valgust ja kannab püütud energia üle reaktsioonikeskusesse (RC), alustades seeläbi laengu eraldumist (4-7). Lillade fototroofsete bakterite fotosünteesi põhiüksus koosneb 2. tüüpi RC-st, mida ümbritseb valgust koguv kompleks 1 (LH1), moodustades RC-LH1 tuumkompleksi. LH1 moodustub kõverate αβ heterodimeeride massiivist, millest igaüks seob kaks bakteriaalset klorofülli (BChl) α molekuli ja ühe või kaks karotenoidi (8-12). Lihtsaim LH1 antenn koosneb 16 või 17 αβ heterodimeerist, mis ümbritsevad RC-d (9-13) suletud ahelas, kuid teistes tuumkompleksides katkestavad transmembraansed peptiidid ümbritseva LH1 pidevuse, soodustades seeläbi kinooli/kinooni difusiooni RC ja tsütokroom bc1 kompleksi vahel (11, 13-15). Lilla fototroofne taim Rhodopseudomonas (Rps.) on mudelorganism, mis suudab mõista fotosünteesi toetavat energia- ja elektronülekannet. Rps-i esimene kristallstruktuur. Palustrise RC-LH1 kompleksi mudel on RC, mida ümbritsevad 15 heterodimeerset LH1 silmust, mida katkestab tundmatu valk nimega "Valk W" (14). Valk-W identifitseeriti hiljem kui RPA4402, mis on iseloomustamata 10,5 kDa valk kolme ennustatud transmembraanse heeliksiga (TMH) (16). Me pakume välja nimetada valku W kodeeriva rpa4402 geeni ümber pufW-ks, et see oleks kooskõlas RC-L, M (pufL, pufM) ja LH1α, β (pufA, pufB) subühikuid kodeerivate geenide nomenklatuuriga. Huvitaval kombel esineb valk-W ainult umbes 10% RC-LH1-s, mis näitab, et Rps. palustris toodab kahte erinevat RC-LH1 kompleksi. Siin kirjeldame kahe tuumkompleksi kõrglahutusega krüo-EM (cryo-EM) struktuure, millest üks sisaldab valku W ja 14 αβ heterodimeeri, teine ​​ilma valku W ja suletud 16 heterodimeerist koosneva LH1 ahelata. Meie struktuur kujutab endast sammmuutust Rps. palustris RC-LH1 kompleksi mõistmises, sest oleme analüüsinud iga variandi homogeenset populatsiooni ja meil on piisav lahutusvõime, et selgelt määrata iga peptiid ja seotud pigmendid ning seotud lipiidid ja kinoonid. Nende struktuuride võrdlus näitab, et kolm TMH valku-W, mida seni pole üheski teises RC-LH1 kompleksis leitud, genereerivad kinoonikanali, mis kiirendab kinooni/kinolooni vahetust. On tuvastatud mitmeid konserveerunud lipiidide ja kinooni sidumissaite ning oleme avastanud uue konformatsioonilise muutuse pärast kinooni ja RC kombinatsiooni, mis võib sobida hapnikuga rikastatud fototroofsete organismide fotosüsteem II (PSII) RC jaoks. Meie leiud pakuvad uut teavet kinooni/kinolooni sidumise ja vahetuse kineetika kohta lillade fototroofsete bakterite RC-LH1 tuumikkompleksis.
Rps. palustris'es leiduvate kahe kompleksi üksikasjaliku uurimise hõlbustamiseks isoleerime iga RC-LH1 biokeemiliste meetoditega. Valgu W-defitsiitne kompleks (edaspidi ΔpufW) puhastati pufW geeni puuduvast tüvest (16) ja toota saab ainult ühte RC-LH1 kompleksi. Valku W sisaldavat kompleksi toodab tüvi. Selle tüve valk W on modifitseeritud 10x His-märgisega oma C-otsas, nii et valku W sisaldavat kompleksi saab metalli immobiliseerimise teel tõhusalt kombineerida enamiku puuduva valguga W. Kompleks eraldatakse tõhusalt (16) afiinsuskromatograafia (IMAC) abil.
Nagu joonisel 1 näidatud, sisaldavad mõlemad kompleksid kolme alamühikut RC-d (RC-L, RC-M ja RC-H), mida ümbritseb LH1 antenn. Valgu-W puudumisel kompleksi 2,80-A struktuuril on 16 αβ heterodimeeri, mis moodustavad RC-d täielikult ümbritseva suletud LH1 ahela, edaspidi nimetatakse seda RC-LH116 kompleksiks. Valku-W sisaldava kompleksi 2,65Å struktuuril on 14-heterodimeer LH1, mida katkestab valk-W, edaspidi nimetatakse seda RC-LH114-W-ks.
(A ja B) Ühendi pinnakujutis. (C ja D) Seotud pigmendid, mis on väljendatud varrastena. (E ja F) Tsütoplasmaatiliselt pinnalt vaadeldavatel kompleksidel on peptiidid ja LH1 subühikud kujutatud karikatuuridena ning nummerdatud päripäeva alates valgu-W pilust [kooskõlas Rba numeratsiooniga. sphaeroides kompleks (13)]. LH1-α puhul on valgu subühiku värvus kollane; LH1-β puhul on valgu subühiku värvus sinine; valgu-W puhul on valk punane; RC-H puhul on see tsüaan; RC-L puhul on see oranž; RC-M puhul magenta. Kofaktoreid esindavad vardad, roheline tähistab BChl ja BPh a molekule, lilla tähistab karotenoide ja kollane tähistab UQ10 molekule. (G ja H) Valgu-W pilu suurendatud vaade RC-LH114-W kompleksi (G) ja RC-LH116 kompleksi (H) ekvivalentses piirkonnas. Kofaktorid on näidatud tühimiku täitena, kelaatkinoon on näidatud sinisena. Valgu ja W vaheline tühik on (G)-s esile tõstetud sinise katkendjoonega ja väikesed augud, kuhu kinoon/kinolool difundeerub LH116 tsüklil, on (H)-s esile tõstetud musta katkendjoonega.
Joonis 1 (A ja B) näitab RC-d, mida ümbritsevad avatud või suletud LH1αβ heterodimeeride massiivid, millest igaüks seob kahte BChl-i ja ühte karotenoidi (joonis 1, C ja D). Varasemad uuringud on näidanud, et Rps on LH1 kompleks. Spirulina ksantiini biosünteesi rajas sisaldavad need liigid karotenoidide segapopulatsioone (17). Spiropürroksantiin on aga domineeriv karotenoid ja selle tihedus on rahuldav. Seetõttu otsustasime modelleerida spiroksantiini kõigis LH1 seondumiskohtades. Alfa- ja beeta-polüpeptiidid on üksikud TMH-d lühikeste membraani välispiirkondadega (joonis 1, A, B, E ja F). Kuigi C-otsas 17 jäägi tihedust ei täheldatud, lõhustati alfa-polüpeptiid mõlemas kompleksis Met1-st Ala46-ks. β-polüpeptiid redutseeriti RC-LH116-s Gly4-st Tyr52-ks ja RC-LH114-W-s Ser5-st Tyr52-ks. 3 või 4 N-terminaalse ega 13 C-terminaalse jäägi tihedust ei täheldatud (joonis S1). Metsiktüüpi tüvest valmistatud segatud RC-LH1 kompleksi massispektromeetriline analüüs näitas, et puuduv piirkond oli nende peptiidide heteroloogse lõhustumise tulemus (joonis S1 ja S2). Täheldati ka α-Met1 N-terminaalset formüülimist (f). Analüüs näitas, et α-peptiid koosneb jääkidest fMet1 kuni Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 ja β-peptiid koosneb jääkidest Ser2 kuni Ala53, mis on madala temperatuuriga EM-tiheduskaardiga heas kooskõlas.
α-His29 ja β-His36 koordinatsioon moodustab BChl-id vastamisi; iga αβ heterodimeer koondub oma naabritega, moodustades avatud ahela (RC-LH114-W) või suletud ahela (RC-LH116) RC ümber. Eksitonidega seotud pigmendi massiiv (joonis 1, C ja D). Võrreldes RC-LH114-W 877 nm ribaga on RC-LH116 880 nm neeldumise punanihe 3 nm (joonis 2A). Ringdikroismi spekter on aga peaaegu sama (joonis 2B), mis näitab, et kuigi avatud ja suletud ahelate vahel on selge erinevus, on BChl-ide lokaalne keskkond väga sarnane. Neeldumise punanihe võib olla tingitud vähenenud termilisest liikumisest ja suurenenud stabiilsusest suletud ahelas (18, 19), suletud ahela põhjustatud pigmendi sidestuse muutusest (20, 21) või nende kahe efekti kombinatsioonist (11).
(A) Ultraviolett-/nähtava/lähiinfrapunakiirguse neeldumisspekter, mille piigid on tähistatud vastavate pigmentidega ja normaliseeritud BPh piigi suhtes lainepikkusel 775 nm. (B) Ringdikroismi spekter, mis on normaliseeritud BChl neeldumise suhtes lainepikkusel 805 nm. (C ja D) Valitud ΔA spektrid RC-LH114-W kompleksi (C) ja RC-LH116 kompleksi (D) ajaliselt lahutatud neeldumisspektritest. Parema võrreldavuse huvides on kõik spektrid normaliseeritud −A ∆A suhtes 0,2 ps juures. (E) Tsütokroom c2 oksüdatsiooni kiirus pärast kiiritamist erinevate UQ2 kontsentratsioonide juuresolekul (vt joonis S8 algandmete kohta). (F) Madala, keskmise või suure intensiivsusega valguse (vastavalt 10, 30 või 300 μMm-2 s-1) käes kasvatatud rakkudes puhastatud kompleksis olevad W ja RC-L subühikud ning eraldatud membraanide suhe. Määrake valgu tase SDS-polüakrüülamiidgeelelektroforeesi ja immunoanalüüsi abil (vt joonis S9 algandmete kohta). Määrake suhe puhastatud RC-LH114-W kompleksi suhtes. Kompleksi RC-L ja valk-W stöhhiomeetriline suhe on 1:1.
RC-LH114-W deformeerunud αβ14 ahela 1. positsioonil olevad BChl-id (joonis 1, A, C ja E) on RC primaarsele doonorile (P) 6,8 Å võrra lähemal kui samaväärsed BChl-id RC-LH116-s (joonis 1, B, D ja F ning joonis S3); kahe kompleksi mööduva neeldumise kineetika näitab aga, et RC-LH114-W ja RC-LH116 puhul on ergastusenergia ülekande ajakonstandid LH1-lt RC-le 40 ±4 ja 44 ±3 ps (joonis 2). , C ja D, joonis S4 ja tabel S2). Samuti ei ole RC-s elektronülekandes olulist erinevust (joonis S5 ja sellega seotud lisatekst). Kahtlustame, et LH1 ja RC-P vahelise energiaülekande aja tihe vastavus tuleneb enamiku BChl-ide sarnasest kaugusest, nurgast ja potentsiaalsest energiast kahes LH1 ahelas. Näib, et LH1 energiamustri uurimine minimaalse kauguse saavutamiseks ei ole kiirem kui otsene energiaülekanne suboptimaalsetest kohtadest RC-sse. Avatud ahelaga LH1 silmus RC-LH114-W-s võib struktuurianalüüsi seisukohast madalatel temperatuuridel läbida ka ebaolulise termilise liikumise ning toatemperatuuril on βBChls-i pigmentatsioonikaugusest RC 1 positsioonis pikem αβ14 tsükli konformatsioon.
RC-LH116 kompleks sisaldab 32 BChl-i ja 16 karotenoidi ning selle üldine paigutus on sama, mis saadi Thermochromatium (Tch.) pidpidum'ilt [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 tüvelt (PDB ID 7C9R) (12) ja rohevetikatelt (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Pärast joondumist täheldati αβ heterodimeeride positsioonides vaid väikeseid kõrvalekaldeid, eriti 1-5, 15 ja 16 (joonis S6). Valgu-W olemasolul on LH1 struktuurile oluline mõju. Selle kolm TMH-d on ühendatud lühikeste silmustega, kusjuures N-terminaal asub kompleksi valendiku poolel ja C-terminaal tsütoplasmaatilisel poolel (joonised 1A ja 3, A kuni D). Valk-W on suures osas hüdrofoobne (joonis 3B) ning TMH2 ja TMH3 interakteeruvad LH1αβ-14-ga, moodustades transmembraanse pinna (joonis 3, B ja E kuni G). Liides koosneb peamiselt Phe, Leu ja Val jääkidest transmembraanses piirkonnas. Need jäägid on virnastatud hüdrofoobsete aminohapete ja αβ-14 pigmentidega. Interaktsioonile aitavad kaasa ka mõned polaarsed jäägid, sealhulgas vesinikside W-Thr68 ja β-Trp42 vahel kompleksi õõnsuse pinnal (joonis 3, F ja G). Tsütoplasma pinnal asub Gln34 αβ-14 karotenoidide ketorühma kõrval. Lisaks eraldati n-dodetsüül-β-d-maltosiidi (β-DDM) molekul ja selle hüdrofoobne saba laienes valk-W ja αβ-14 vahelisele liidesele ning lipiidsaba võib paikneda kehas. Samuti märkasime, et valkude W ja RCH C-terminaalsed lahutuspiirkonnad on väga lähedased, kuid mitte spetsiifiliste interaktsioonide moodustamise ulatuses (joonis 1, A ja E). Siiski võivad nende kahe valgu lahutusmata C-terminaalsetes aminohapetes esineda interaktsioonid, mis võivad pakkuda mehhanismi valgu-W värbamiseks RC-LH114-W kompleksi kokkupaneku ajal.
(A) Valk-W, mis on koomiksikujuliselt LH1αβ14-ga piirpinna vastas, omab vardakujulist külgahelat (punane), mis on kujutatud elektrostaatilise potentsiaali diagrammi osas (läbipaistev hall pind kontuuritasemega 0,13). (B) Valk-W on kujutatud hüdrofoobse värvilise pinnaga. Polaarsed ja laetud alad on kujutatud tsüaanina, hüdrofoobsed alad on kujutatud valgena ja tugevalt hüdrofoobsed alad on kujutatud oranžina. (C ja D) Valk-W on kujutatud koomiksikujuliselt, selle orientatsioon on sama mis (A) (C) ja pööratud 180° (D). Vastavalt positsioonile järjestuses on eristatavad jäägid vikerkaarevärvides, kus N-ots on sinine ja C-ots on punane. (E) Valk-W samas vaates nagu (A) ja valgu-W:LH1 piirpinnal olevad jäägid on kujutatud kinnitatud märkidega varrastega. (F) Valk-W on koomiksikujuliselt pööratud 90° (E) ja LH1αβ14 suhtes ning tulbakujuliselt piirpinna jääkide suhtes. Beeta-polüpeptiidi üleulatuvad jäägid on märgistatud. Kofaktor on näidatud joonisel 1 kujutatud värviga sobiva tulbana, lagunenud β-DDM on näidatud hallina ja hapnik on näidatud punasena. (G) Vaade (F) on pööratud 180°, kus on näha märgistatud alfa-polüpeptiidi silmapaistvamad jäägid.
Valk-W asendab αβ heterodimeeri (15. joonisel 1F), takistades seeläbi silmuse sulgumist ja kallutades esimest kolme αβ heterodimeeri. Täheldati, et esimese αβ-1 heterodimeeri maksimaalne kaldenurk kile normaali suhtes oli 25° kuni 29° (joonis 1, A ja E), mis tekkis αβ-1 2° kuni 8° kalde tõttu RC A teravas kontrastis-LH116 (joonis 1, B ja F). Teine ja kolmas heterodimeer on kaldu vastavalt 12° kuni 22° ja 5° kuni 10°. RC steerilise takistuse tõttu ei hõlma αβ-1 kalle teist αβ paari (mis vastab 16. αβ-le joonisel 1F), moodustades seega selge tühiku LH1 tsüklis (joonis 1, A ja E). Kahe αβ heterodimeeri puudumise tõttu, millega kaasneb nelja BChl ja kahe karotenoidi kadu, ei seondu ükski karotenoididest keerdunud αβ-1 subühikuga, mille tulemuseks on LH114-W ring, mis sisaldab 13 karotenoidi (vegetarian) ja 28 BChl. Kahe kompleksi lokaalse lahutusvõime hinnangud αβ1 kuni 7 piirkondades on madalamad kui ülejäänud LH1 ahela omad, mis võib peegeldada RC QB saidiga külgneva LH1 subühiku loomupärast plastilisust (joonis 4).
RC-LH114-W (A ja B) ja RC-LH116 (C ja D) pildid on näidatud samast pealtvaatest/külgvaatest (A ja B) (A ja C) ja joonisel 1 kujutatud õõnsuse pinnalt (B ja D). Värvilised klahvid on näidatud paremal.
Ainus teine ​​iseloomulik tuumkompleks stöhhiomeetrilise suhtega 1:14 on Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimeer (13). Valgul W ja PufX-il aga ilmset homoloogiat ei ole ning neil on oluline mõju vastavatele LH1 struktuuridele. PufX on üksik TMH N-terminaalse tsütoplasmaatilise domeeniga, mis interakteerub RC-H subühiku tsütoplasmaatilise poolega (13) positsioonis, mis vastab Rps. palustris LH116αβ-16-le. PufX loob kanali kinooni/kinolooni vahetuseks RC-LH1 ja tsütokroom bcl kompleksi vahel ning esineb kogu Rba. sphaeroides tuumkompleksis (13). Kuigi monomeeri-monomeeri piirpind asub Rba-s, asub sphaeroides RC-LH1-PufX dimeer valgu W sidumispositsioonil RC-LH114-W-s ja PufX-i ja valgu-W poolt indutseeritud vahe on samaväärses positsioonis (joonis S7A). RC-LH114-W tühimik on samuti kooskõlas Pseudomonas rosea LH1 hüpoteetilise kinoonikanaliga (8), mis moodustub peptiididest, mis ei ole seotud valgu W ega PufX-iga (joonis S7B). Lisaks on Blc kinoonikanal. Ühe γ-alaühiku väljajätmisel moodustunud smaragdroheline LH1 (7) asub sarnases asendis (joonis S7C). Kuigi neid vahendavad erinevad valgud, näib nende kinooni/kinolooli kanalite ilmumine RC-LH1 kompleksis ühises asendis olevat näide konvergentsest evolutsioonist, mis viitab sellele, et valgu W loodud tühimik võib toimida kinoonikanalina.
LH114-W ahela tühimik võimaldab moodustuda pideval membraanipiirkonnal RC-LH114-W kompleksi siseruumi ja põhimembraani vahel (joonis 1G), selle asemel, et ühendada kahte domeeni valgupooride kaudu nagu valkudes. RC-LH116 kompleks sarnaneb suletud Tch nõelataolise kompleksiga (22) (joonis 1H). Kuna kinooni difusioon läbi membraani on kiirem kui difusioon läbi kitsa valgukanali, võimaldab avatud LH114-W silmus kiiremat RC ringlust kui suletud LH116 silmus ning kinooni difusioon RC-sse võib olla piiratum. Selleks, et testida, kas valk W mõjutab kinoonide muundumist RC kaudu, viisime läbi tsütokroomi oksüdatsiooni testi teatud kontsentratsioonil ubikinoon 2 (UQ2) (loodusliku UQ10 analoog lühema isopreenist sabaga) (joonis 2E). Kuigi kelaatkinooni olemasolu takistab Michaeli konstanti täpset määramist (RC-LH114-W ja RC-LH116 sobivad vastavalt 0,2±0,1μM ja 0,5±0,2μM jaoks), on RC-LH114-W maksimaalne kiirus (4,6±0,2 e-RC-1 s-1) 28±5% suurem kui RC-LH116-l (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
Algselt hindasime, et valk-W esineb umbes 10% tuumikkompleksist (16); siin on nõrga, keskmise ja tugeva valgusega kasvurakkude hõivatusmäärad vastavalt 15 ± 0,6%, 11 ± 1% ja 0,9 ± 0,5% (joonis 2F). Massispektromeetria kvantitatiivne võrdlus näitas, et histidiinmärgise lisamine ei vähendanud valk-W suhtelist arvukust võrreldes metsiktüüpi tüvedega (P = 0,59), seega ei ole need tasemed modifitseeritud valk-W artefakt (joonis S10). Valgu-W madal hõivatus RC-LH1 kompleksis võib aga võimaldada mõnedel RC-del kiirendatud kiirusega ümber pöörata, leevendades seeläbi aeglasemat kinoon/kinolooni vahetust RC-LH116 kompleksis. Märkasime, et kõrge valguse hõivatusmäär on vastuolus hiljutiste transkriptoomika andmetega, mis näitavad, et pufW geeni ekspressioon suureneb tugeva valguse käes (joonis S11) (23). Erinevus pufW transkriptsiooni ja valgu-W inkorporeerimise vahel RC-LH1 kompleksi on segadusttekitav ja võib peegeldada valgu keerulist regulatsiooni.
RC-LH114-W kompleksis on eraldatud ja modelleeritud 6 kardiolipiini (CDL), 7 fosfatidüülkoliini (POPC), 1 fosfatidüülglütserooli (POPG) ja 29 β-DDM molekuli: 6 CDL-i, 24 POPC-d, 2 POPG-d ja 12 βDDM-i. RC-LH116 (joonis 5, A ja B). Nendes kahes struktuuris paikneb CDL peaaegu kompleksi tsütoplasmaatilisel poolel, samas kui POPC, POPG ja β-DDM paiknevad enamasti luminaalsel poolel. RC-LH114-W kompleksi αβ-1 kuni αβ-6 piirkonnas eraldati kaks lipiidi- ja detergendimolekuli (joonis 5A) ja viis RC-LH116 ekvivalentses piirkonnas (joonis 5B). Kompleksi teisel poolel leiti rohkem lipiide, peamiselt CDL-i, mis akumuleerus RC ja αβ-7 kuni αβ-13 vahele (joonis 5, A ja B). Teised struktuurilt lahutatud lipiidid ja detergendid paiknevad väljaspool LH1 tsüklit ning hästi lahutatud atsüülahelad ulatuvad LH1 subühikute vahele, mida RC-LH114-W-s esialgu nimetatakse β-DDM-iks ja RC-A β-DDM-i ja POPC-LH116 segus defineeritakse kui β-DDM. Kelaativate lipiidide ja detergentide sarnased positsioonid meie struktuuris näitavad, et need on füsioloogiliselt olulised seondumiskohad (joonis S12A). Samaväärsete molekulide positsioonid Tch-s on samuti hea järjepidevusega. Gentle ja Trv. Tüvi 970 RC-LH1-d (joonis S12, B kuni E) (9, 12) ja lipiidi peagrupi vesiniksideme jäägid näitasid järjestuse joondamisel üsna head konserveerumist (joonis S13), mis näitab, et konserveerunud CDL, mis seondub RC-ga (24), võivad need kohad olla konserveerunud RC-LH1 kompleksis.
(A ja B) RC-LH114-W (A) ja RC-LH116 (B) peptiide kujutavad koomiksid ja pigmente vardad, kasutades joonisel 1 kujutatud värviskeemi. Lipiidid on näidatud punasega ja detergendid halliga. RC QA ja QB saitidega seotud UQ on kollane, samas kui isoleeritud UQ on sinine. (C ja D) Samad vaated nagu (A) ja (B), lipiidid on välja jäetud. (E kuni G) RC-LH116 Q1(E), Q2(F) ja Q3(G) suurendatud vaade koos üksteist mõjutavate külgahelatega. Vesiniksidemed on näidatud mustade katkendjoontega.
RC-LH116 struktuuris lagunevad nii RC QA kui ka QB UQ, mis osalevad elektronide ülekandes laengu eraldumise protsessis, oma seondumiskohtades. RC-LH114-W struktuuris aga QB kinooni ei ole lahutatud ja seda käsitletakse allpool üksikasjalikumalt. Lisaks QA ja QB kinoonidele on RC-LH114-W struktuuris kaks kelaatset UQ molekuli (mis paiknevad RC ja LH1 tsüklite vahel) jaotatud vastavalt nende hästi lahutatud pearühmadele (asuvad vastavalt Q1 ja Q2 ruumis). Joonis 5C). Q1-le on määratud kaks isopreeni ühikut ja tiheduskaart lahutab Q2 kõik 10 isopreeni saba. RC-LH116 struktuuris lahutati kolm kelaatset UQ10 molekuli (Q1 kuni Q3, joonis 5D) ja kõigil molekulidel on saba ulatuses selge tihedus (joonis 5, D kuni G). Kahes struktuuris on Q1 ja Q2 kinooni pearühmade positsioonid suurepärase järjepidevusega (joonis S12F) ja nad interakteeruvad ainult RC-ga. Q1 asub RC-LH114-W W-vahe sissepääsu juures (joonis 1G ja 5, C, D ja E) ning Q2 asub QB sidumissaidi lähedal (joonis 5, C, D ja F). Konserveerunud L-Trp143 ja L-Trp269 jäägid on Q1 ja Q2-le väga lähedal ning pakuvad potentsiaalseid π-virnastusinteraktsioone (joonis 5, E ja F ning joonis S12). L-Gln88, mis asub Q1 distaalsest hapnikust 3,0 Å kaugusel, annab tugeva vesiniksideme (joonis 5E); see jääk on konserveerunud kõigis RC-des, välja arvatud kõige kaugemal suguluses (joonis S13). Enamikus teistes RC-des on L-Ser91 konservatiivselt asendatud Thr-iga (joonis S13), asub Q1 metüülhapnikust 3,8 Å kaugusel ja võib pakkuda nõrku vesiniksidemeid (joonis 5E). Q3-l ei paista olevat spetsiifilist interaktsiooni, kuid see asub hüdrofoobses piirkonnas RC-M subühiku ja LH1-α subühikute 5 kuni 6 vahel (joonis 5, D ja G). Q1, Q2 ja Q3 või nende lähedal asuvad kelaatkinoonid on lahutatud ka Tch. Gentle'is, Trv. tüves 970 ja Blc-s. Iirise struktuur (9, 10, 12) viitab konserveerunud abikinooni sidumissaidile RC-LH1 kompleksis (joonis S12G). RC-LH116 viis lagunenud UQ-d on heas kooskõlas iga kompleksi 5,8 ± 0,7-ga, mis määrati kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) abil, samas kui kolm lagunenud UQ-d RC-LH114-W-s on madalamad kui Mõõdetud väärtus 6,2 ± 0,3 (joonis S14) näitab, et struktuuris on lahendamata UQ molekule.
Pseudosümmeetrilised L- ja M-polüpeptiidid sisaldavad kumbki viit TMH-d ja moodustavad heterodimeeri, mis ühendab ühe BChl dimeeri, kaks BChl monomeeri, kaks bakteriofaagi (BPh) monomeeri, ühe mitteheemse raua ja ühe või kaks UQ10 molekuli. Tänu vesiniksidemete olemasolule terminaalsel ketoonirühmal ja selle teadaolevale akumuleerumisele Rps-is inkorporeeritakse karotenoidid M-subühikusse, mida nimetatakse cis-3,4-dehüdroorodopiiniks. Liik (25). RC-H välismembraani domeen on membraanile ankurdatud ühe TMH abil. Üldine RC struktuur on sarnane seotud liikide (näiteks Rba) kolme subühikuga RC-ga. sphaeroides (PDB ID: 3I4D). BChl ja BPh makrotsüklid, karotenoidne selgroog ja mitteheemne raud kattuvad nende struktuuride lahutusvõime vahemikus, nagu ka UQ10 pearühm QA saidil ja QB kinoon RC-LH116 juures (joonis S15).
Kahe erineva QB sidumiskoha hõivatusmääraga RC-struktuuri olemasolu annab uue võimaluse uurida QB-kinooni sidumisega kaasnevaid järjepidevaid konformatsioonilisi muutusi. RC-LH116 kompleksis asub QB-kinoon täielikult seotud "proksimaalses" positsioonis (26), kuid RC-LH114-W eraldusel QB-kinooni ei ole. RC-LH114-W-s QB-kinooni ei ole, mis on üllatav, kuna kompleks on aktiivne, aktiivne rohkem kui struktuurilt lahutatud QB-kinooniga RC-LH116 kompleks. Kuigi kaks LH1 tsüklit kelaativad umbes kuut kinooni, on viis struktuurilt lahutatud suletud RC-LH116 tsüklis, samas kui ainult kolm on struktuurilt piiratud avatud RC-LH114-W tsüklis. See suurenenud struktuuriline korrastatus võib peegeldada RC-LH114-W QB sidumiskohtade kiiremat asendamist, kiiremat kinooni kineetikat kompleksis ja suurenenud tõenäosust LH1 ahela läbimiseks. Pakume välja, et UQ puudumine RC-LH114-W RC QB saidil võib olla keerulisema ja aktiivsema kompleksi tulemus ning RC-LH114-W QB sait on UQ ringluses koheselt külmunud. Spetsiifiline etapp (QB saidi sissepääs on suletud) peegeldab selle aktiivsuse konformatsiooni.
Ilma QB-ta kaasneks L-Phe217 pöörlemine asendisse, mis ei sobi UQ10 sidumisega, kuna see põhjustab ruumilise kokkupõrke saba esimese isopreeniüksusega (joonis 6A). Lisaks on ilmsed peamised konformatsioonilised muutused, eriti heeliks de (lühike heeliks TMH D ja E vahelises silmuses), kus L-Phe217 nihkub QB sidumistaskusse, ja L-Tyr223 pöörlemine (joonis 6A), et katkestada vesinikside M-Asp45 raamistikuga ja sulgeda QB sidumissaidi sissepääs (joonis 6B). Heeliks de pöördub oma aluses, L-Ser209 Cα nihkub 0,33 Å võrra, samas kui L-Val221Cα nihkub 3,52 Å võrra. TMH D ja E puhul ei ole täheldatavaid muutusi, mis on mõlemas struktuuris kattuvad (joonis 6A). Meie teada on see esimene struktuur looduslikus RC-s, mis sulgeb QB saidi. Võrdlus täieliku (QB-seotud) struktuuriga näitab, et enne kinooni redutseerimist on vaja konformatsioonilist muutust, et see kinooni siseneks. L-Phe217 pöörleb, moodustades π-virnastumisinteraktsiooni kinooni peagrupiga, ja heeliks nihkub väljapoole, võimaldades L-Gly222 skeletil ja L-Tyr223 külgahelal moodustada vesiniksidemete võrgustiku stabiilse vesiniksideme struktuuriga (joonis 6, A ja C).
(A) Kattuv hologrammi (L-ahel, oranž/M-ahel, magenta) ja apo (hall) struktuuri koomiks, kus võtmejäägid on kujutatud vardakujuliselt. UQ10 on tähistatud kollase ribaga. Katkendlik joon näitab kogu struktuuris moodustunud vesiniksidemeid. (B ja C) Apolipoproteiini ja kogu ringstruktuuri pinnakujutis, kus L-Phe217 külgahela hapnik on esile tõstetud sinisega ja L-Tyr223 punasega. L-alaühik on oranž; M- ja H-alaühikud pole värvitud. (D ja E) Apolipoproteiin (D) ja terve (E) RC QB saidid [värvitud vastavalt (A) järgi] ja Thermophilus thermophilus PSII (roheline, sinine plastkinooniga; PDB ID: 3WU2) Joonda (58).
Ootamatult, kuigi on olemas mitu QB-defitsiitsete RC-de struktuuri ilma LH1-ta, pole selles uuringus täheldatud konformatsioonilisi muutusi varem kirjeldatud. Nende hulka kuuluvad QB ammendumise struktuur Blc. viridis'el (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum'il (PDB ID: 1EYS) (28) ja Rba. sphaeroides'el (PDB ID: 1OGV) (29), mis kõik on peaaegu samad, mis nende üldine QB struktuur. 3PRC lähemal uurimisel selgus, et LDAO (laurüüldimetüülamiinoksiid) detergendi molekulid seonduvad QB positsiooni sissepääsuga, mis võib takistada ümberpaigutust suletud konformatsiooni. Kuigi LDAO ei lagune 1EYS-is ega 1OGV-s samas positsioonis, valmistatakse need RC-d sama detergendi abil ja seetõttu võivad need anda sama efekti. Tsütokroom c2-ga kaaskristalliseerunud Rba. Sphaeroides RC (PDB ID: 1L9B) kristallstruktuuril näib samuti olevat suletud QB sait. Kuid antud juhul võtab RC-M polüpeptiidi N-terminaalne piirkond (mis interakteerub QB sidumissaidiga Q heeliksi Tyr jäägi H-sideme kaudu) ebaloomuliku konformatsiooni ja QB konformatsioonilist muutust ei ole lähemalt uuritud (30). Rahustav on see, et me ei ole näinud sellist M polüpeptiidi deformatsiooni RC-LH114-W struktuuris, mis on peaaegu sama mis RC-LH116 RC N-terminaalne piirkond. Samuti tuleb märkida, et pärast detergendipõhise LH1 antenni likvideerimist lagunesid PDB-s olevad apolipoproteiini RC-d, mis elimineeris sisemised kinoonivarud ja lipiidid RC ja ümbritseva LH1 tsükli sisepinna vahelises tühimikus (31, 32). RC jääb funktsionaalseks, kuna see säilitab kõik kofaktorid, välja arvatud lagunev QB kinoon, mis on vähem stabiilne ja sageli kaob valmistusprotsessi käigus (33). Lisaks on teada, et LH1 ja looduslike tsükliliste lipiidide eemaldamine RC-st võib mõjutada funktsioone, näiteks lühenenud eluiga laenguga eraldatud P+QB-olekus (31, 34, 35). Seetõttu oletame, et RC-d ümbritseva lokaalse LH1 tsükli olemasolu võib säilitada „suletud“ QB saidi, säilitades seeläbi lokaalse keskkonna QB lähedal.
Kuigi apolipoproteiin (ilma QB-kinoonita) ja täielik struktuur esindavad vaid kahte hetkepilti QB-saidi käibest, mitte sündmuste jada, on märke, et seondumist saab väravastada, et vältida hüdrokinooni poolt uuesti seondumist, mis pärsib substraadi inhibeerimist. Kinolooli ja kinooni interaktsioon apolipoproteiini QB-saidi lähedal võib olla erinev, mis viib selle hülgamiseni RC poolt. On juba ammu oletatud, et konformatsioonilised muutused mängivad rolli kinoonide sidumisel ja redutseerimisel. Külmunud RC-de võime redutseerida kinoone pärast pimedaga kohanemist on halvenenud (36); röntgenkristallograafia näitab, et see kahjustus on tingitud QB-kinoonide lõksu jäämisest "distaalsesse" konformatsiooni umbes 4,5 Å kaugusel aktiivsest proksimaalsest positsioonist (26), 37). Pakume välja, et see distaalne seondumiskonformatsioon on hetkepilt apolipoproteiini ja täieliku ringstruktuuri vahelisest vahepealsest olekust, mis järgneb esialgsele interaktsioonile kinooniga ja QB-saidi avanemisele.
Teatud fototroofsete bakterite ja tsüanobakterite, vetikate ja taimede PSII kompleksis leiduval II tüüpi RC-l on struktuuriline ja funktsionaalne konserveerumine (38). Joonisel 6 (D ja E) näidatud struktuuriline joondus rõhutab PSII RC-de ja bakteriaalse RC kompleksi QB saidi sarnasust. See võrdlus on pikka aega olnud mudeliks kinoonide sidumise ja redutseerimise tihedalt seotud süsteemide uurimiseks. Varasemad publikatsioonid on väitnud, et konformatsiooniliste muutustega kaasneb kinoonide PSII redutseerimine (39, 40). Seega, arvestades RC evolutsioonilist konserveerumist, võib see varem täheldamata sidumismehhanism olla rakendatav ka PSII RC QB saidi suhtes hapnikuga rikastatud fototroofsetes taimedes.
Rps ΔpufW (märgistamata pufW deletsioon) ja PufW-His (C-terminaalne 10x His-märgistatud valk-W, mida ekspresseeritakse looduslikust pufW lookusest) tüved. palustris CGA009 on kirjeldatud meie eelmises töös (16). Need tüved ja isogeenne metsiktüüpi vanem eraldati sügavkülmast, külvates väikese arvu rakke PYE söötmele (igaüks 5 g liiter -1) (säilitatud LB söötmes temperatuuril -80 °C, mis sisaldas 50% (massiprotsent/mahtprotsent) glütserooli), valku, pärmiekstrakti ja suktsinaati) agarit [1,5% (massiprotsent/mahtprotsent)]. Plaati inkubeeriti üleöö pimedas toatemperatuuril anaeroobsetes tingimustes ja seejärel valgustati OSRAM 116-W halogeenlampide (RS Components, Ühendkuningriik) valge valgusega (~50 μmolm-2 s-1) 3 kuni 5 päeva, kuni ilmus üks koloonia. Üksikut kolooniat kasutati 10 ml M22+ söötme (41), millele oli lisatud 0,1% (massiprotsent/mahtprotsent) kasaminohappeid (edaspidi M22), inokuleerimiseks. Kultuuri kasvatati madala hapnikusisaldusega pimedas temperatuuril 34 °C loksutades kiirusel 180 p/min 48 tundi ja seejärel inokuleeriti 70 ml kultuuri samades tingimustes 24 tundi. 1 ml mahuga poolaeroobset kultuuri kasutati 30 ml M22 söötme inokuleerimiseks 30 ml universaalses keeratava korgiga läbipaistvas klaaspudelis ja kiiritati loksutamisega (~50 μmolm-2 s-1) 48 tundi steriilse magnetsegamisvarda abil. Seejärel inokuleeriti 30 ml kultuuri umbes 1 liitri kultuuriga samades tingimustes, mida seejärel kasutati umbes 9 liitri kultuuri inokuleerimiseks, mida valgustati kiirusel ~200 μmolm-2 s-1 72 tunni jooksul. Rakud koguti tsentrifuugimisega kiirusel 7132 RCF 30 minutit, resuspendeeriti ~10 ml 20 mM tris-HCl-is (pH 8,0) ja säilitati temperatuuril -20 °C kuni vajaduseni.
Pärast sulatamist lisage resuspendeeritud rakkudele mõned deoksüribonukleaas I kristallid (Merck, Ühendkuningriik), lüsosüüm (Merck, Ühendkuningriik) ja kaks Roche'i holoensüümproteaasi inhibiitori tabletti (Merck, Ühendkuningriik). 20 000 psi Prantsuse rõhukambris (Aminco, USA) lõhuti rakke 8–12 korda. Pärast purunemata rakkude ja lahustumatute prahiosakeste eemaldamist tsentrifuugimisega kiirusel 18 500 RCF 15 minutit temperatuuril 4 °C sadestati membraan pigmenteeritud lüsaadist tsentrifuugimisega kiirusel 113 000 RCF 2 tundi temperatuuril 43 000 °C. Lahustuv fraktsioon visake ära ja resuspendeerige värviline membraan 100–200 ml 20 mM tris-HCl-is (pH 8,0) ning homogeniseerige, kuni nähtavaid agregaate enam ei ole. Suspensioonitud membraani inkubeeriti 20 mM tris-HCl-is (pH 8,0) (Anatrace, USA), mis sisaldas 2% (massiprotsent/mahtprotsent) β-DDM-i, 1 tund pimedas temperatuuril 4 °C õrnalt segades. Seejärel tsentrifuugiti temperatuuril 70 °C, et lahustada 150 000 RCF-i 4 °C juures 1 tund ja eemaldada lahustumatud ained.
ΔpufW tüve solubiliseeriv membraan kanti 50 ml DEAE Sepharose ioonvahetuskolonnile, kasutades kolmekordset kolonnimahtu (CV) sidumispuhvrit [20 mM tris-HCl (pH 8,0), mis sisaldab 0,03% (massiprotsent/mahtprotsent) β-DDM]. Kolonni pesti kahe CV sidumispuhvriga ja seejärel kahe 50 mM NaCl sisaldava sidumispuhvriga. RC-LH116 kompleks elueeriti lineaarse gradiendiga 150 kuni 300 mM NaCl (sidumispuhvris) 1,75 CV juures ja ülejäänud sidumiskompleks elueeriti sidumispuhvriga, mis sisaldas 300 mM NaCl, 0,5 CV juures. Koguti neeldumisspekter vahemikus 250 kuni 1000 nm, fraktsioon, mille neeldumissuhe (A880/A280) on suurem kui 1, säilitati 880 kuni 280 nm juures, lahjendati seda kaks korda sidumispuhvris ja korrati sama protseduuri uuesti DEAE kolonni puhastamisel. Lahjendage fraktsioonid, mille A880/A280 suhe on suurem kui 1,7 ja A880/A805 suhe on suurem kui 3,0, tehke kolmas ioonvahetusvoor ja hoidke fraktsioonid, mille A880/A280 suhe on suurem kui 2,2 ja A880/A805 suhe on suurem kui 5,0. Osaliselt puhastatud kompleks kontsentreeriti Amicon 100 000 molekulmassi piirväärtusega (MWCO) tsentrifugaalfiltris (Merck, Ühendkuningriik) umbes 2 ml-ni ja laaditi Superdex 200 16/600 suuruseralduskolonni (GE Healthcare, USA), mis sisaldas 200 mM NaCl puhvrit, ning seejärel elueeriti samas puhvris 1,5 CV juures. Koguge suuruseraldusfraktsiooni neeldumisspektrid ja kontsentreerige neeldumisspektrid A880/A280 suhetega üle 2,4 ja A880/A805 suhetega üle 5,8 kuni 100 A880-ni ning kasutage neid kohe krüo-TEM-võre ettevalmistamiseks või säilitamiseks. Hoida temperatuuril -80 °C kuni vajaduseni.
PufW-His tüve solubiliseeriv membraan kanti 20 ml HisPrep FF Ni-NTA sefaroosikolonnile (20 mM tris-HCl (pH 8,0), mis sisaldas 200 mM NaCl ja 0,03% (massiprotsent)) IMAC-puhvris (GE Healthcare). v) β-DDM]. Kolonni pesti viie kromatograafiaühikuga IMAC-puhvriga ja seejärel viie kromatograafiaühikuga IMAC-puhvriga, mis sisaldas 10 mM histidiini. Tuumakompleks elueeriti kolonnist viie IMAC-puhvriga, mis sisaldasid 100 mM histidiini. RC-LH114-W kompleksi sisaldav fraktsioon kontsentreeriti Amicon 100 000 MWCO filtriga (Merck, Ühendkuningriik) varustatud segamispaagis ~10 ml-ni, lahjendati 20 korda sidumispuhvriga ja seejärel lisati 25 ml-ni. DEAE sefaroosikolonnis kasutatakse eelnevalt nelja puhvriga seotud kromatograafiaühikut. Peske kolonn nelja CV sidumispuhvriga, seejärel elueerige kompleks kaheksal CV-l lineaarse gradiendiga 0 kuni 100 mM NaCl (sidumispuhvris) ja ülejäänud neli CV-d, mis sisaldavad 100 mM sidumispuhvrit. Naatriumkloriidil elueeritud jääkkompleksid, mille A880/A280 suhe on suurem kui 2,4 ja A880/A805 suhe on suurem kui 4,6, kontsentreeriti Amicon 100 000 MWCO tsentrifugaalfiltris ~2 ml-ni ja täideti eelnevalt puhvriga tasakaalustatud Superdex 200 16/600 suuruseralduskolonniga 1,5 CV IMAC-iga ning seejärel elueeriti samas puhvris 1,5 CV-l. Koguge suuruseraldusfraktsioonide neeldumisspektrid ja kontsentreerige neeldumisspektrid A880/A280 suhetega üle 2,1 ja A880/A805 suhetega üle 4,6 kuni 100 A880-ni, mida kasutatakse kohe külmutatud TEM-võre ettevalmistamiseks või säilitatakse temperatuuril -80 °C kuni vajaduseni.
Madala temperatuuriga TEM-võrede valmistamiseks kasutati Leica EM GP immersioonsügavkülmikut. Kompleks lahjendati IMAC-puhvris A880-ni 50 ja seejärel laaditi 5 μl äsja helenduslahendusega töödeldud QUANTIFOIL 1.2/1.3 süsinikkattega vaskvõrgule (Agar Scientific, Ühendkuningriik). Inkubeerige võre temperatuuril 20 °C ja 60% suhtelise õhuniiskuse juures 30 sekundit, seejärel kuivatage 3 sekundit ja seejärel kustutage vedelas etaanis temperatuuril -176 °C.
RC-LH114-W kompleksi andmed salvestati eBIC-il (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) Titan Krios mikroskoobiga, mis töötab kiirenduspingel 300 kV, nominaalse suurendusega 130 000× ja energiaga 20 eV. Andmete kogumiseks kasutati kujutiste salvestamiseks loendusrežiimis Gatan 968 GIF Quantum mikroskoobi K2 piigi detektoriga. Kalibreeritud piksli suurus on 1,048 Å ja doosikiirus on 3,83 e-Å-2s-1. Film koguti 11 sekundiga ja jagati 40 osaks. Mikroskoobi fokuseerimiseks kasutati süsinikuga kaetud ala ja seejärel koguti iga augu kohta kolm filmi. Kokku koguti 3130 filmi, mille defokuseerimisväärtused olid vahemikus -1 kuni -3 μm.
RC-LH116 kompleksi andmed koguti sama mikroskoobi abil Asterbury biostruktuuri laboris (Leedsi ülikool, Ühendkuningriik). Andmed koguti loendusrežiimis 130 k suurendusega ja piksli suurus kalibreeriti 1,065 Å-ni annusega 4,6 e-Å-2s-1. Film salvestati 12 sekundiga ja jagati 48 osaks. Kokku koguti 3359 filmi, mille defokuseerimisväärtused olid vahemikus -1 kuni -3 μm.
Kogu andmetöötlus toimub Relion 3.0 konveieris (42). Kasutage Motioncorr 2 (43), et korrigeerida kiire liikumist doosi kaalumise abil, ja seejärel kasutage CTFFIND 4.1 (44), et määrata CTF (kontrasti ülekandefunktsioon) parameeter. Tüüpilised mikrofotod pärast neid esialgseid töötlemisetappe on näidatud joonisel 2. S16. Automaatse valiku mall genereeritakse, valides käsitsi umbes 250 pikslit 1000 osakesega 250 pikslises kaadris ja ilma võrdluskahemõõtmelise (2D) klassifikatsioonita, lükates tagasi need klassifikatsioonid, mis vastavad proovi saastumisele või millel puuduvad eristatavad omadused. Seejärel teostati automaatne valik kõigil mikrofotodel ning RC-LH114-W oli 849 359 osakest ja RC-LH116 kompleks oli 476 547 osakest. Kõik valitud osakesed on läbinud kaks mitte-referents-2D klassifitseerimise vooru ja pärast iga tsüklit lükatakse tagasi osakesed, mis vastavad süsinikualale, proovi saastumisele, ilma ilmsete tunnusteta või tugevalt kattuvatele osakestele, mille tulemuseks on vastavalt 772 033 (90,9%) ja 359 678 (75,5%) osakest. Osakesi kasutatakse vastavalt RC-LH114-W ja RC-LH116 3D klassifitseerimiseks. Esialgne 3D-referentsmudel genereeriti stohhastilise gradiendi laskumise meetodi abil. Kasutades esialgset mudelit võrdlusena, liigitatakse valitud osakesed 3D-s nelja kategooriasse. Kasutades selle kategooria mudelit võrdlusena, teostage suurima kategooria osakeste 3D-täpsustus, seejärel kasutage esialgset 15Å madalpääsfiltrit lahusti ala katmiseks, lisage 6 pikslit pehmeid servi ja töödelge piksleid järeltöödeldes, et korrigeerida ülemise detektori Gatani K2 piigi modulatsiooni ülekandefunktsiooni. RC-LH114-W andmestiku puhul muudeti seda algmudelit, eemaldades maski servadest tugeva tiheduse (mis on UCSF Chimera puhul lahutatud tuumkompleksi tihedusest). Saadud mudeleid (RC-LH114-W ja RC-LH116 resolutsioonid on vastavalt 3,91 ja 4,16 Å) kasutatakse võrdlusena 3D-klassifitseerimise teises voorus. Kasutatud osakesed on rühmitatud esialgsesse 3D-klassi ega sisalda tugevat korrelatsiooni naabruskonnaga. Kattumine või ilmsete struktuuriliste tunnuste puudumine. Pärast teist 3D-klassifitseerimise vooru valiti kõrgeima resolutsiooniga kategooria [RC-LH114-W puhul on üks kategooria 377 703 osakest (44,5%), RC-LH116 puhul on kaks kategooriat, kokku 260 752 osakest (54,7%), kus need on samad ainult väikese erinevusega pärast esialgset pööramist joondatud]. Valitud osakesed ekstraheeritakse uuesti 400-pikslisse kasti ja täpsustatakse 3D-täpsustamisega. Solvendi mask genereeritakse esialgse 15Å madalpääsfiltri, 3-pikslise kaardi laiendamise ja 3-pikslise pehme maski abil. Kasutades osakesepõhist CTF-täpsustust, osakesepõhist liikumise korrektsiooni ja teist osakesepõhise CTF-täpsustusvooru, teostatakse pärast iga sammu 3D-täpsustus, solvendi maskeerimine ja järeltöötlus, et saadud tekstuuri veelgi täpsustada. Kasutades FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) piirväärtust 0,143, on RC-LH114-W ja RC-LH116 lõppmudelite lahutusvõimed vastavalt 2,65 ja 2,80Å. Lõppmudeli FSC-kõver on näidatud joonisel 2. S17.
Kõik valgujärjestused on alla laaditud UniProtKB-st: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProt ID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). RC homoloogiamudeli konstrueerimiseks kasutati SWISS-MODEL (45), mis sisaldab RC-L, RC-M ja RC-H valgujärjestusi ning Rba kristallstruktuuri. Mallina kasutati sphaeroides RC-d (PDB ID: 5LSE) (46). Kasutage UCSF Chimera „sobita kaart” tööriista, et sobitada genereeritud mudel kaardile (47), parandada valgu struktuuri ja kofaktorit [4×BChl a (monomeeride teegi jäägi nimi = BCL), 2×BPh a (BPH), ühte või kahte tüüpi UQ10 (U10), ühte mitteheemset rauda (Fe) ja ühte 3,4-dihüdroheksakarbonüülkoliini (QAK)], lisamiseks kasutage Coot'i (48). Kuna QAK-d monomeeride teegis pole, parameetriseeriti see PHENIX-i (49) eLBOW tööriista abil.
Järgmisena konstrueeriti LH1 allüksus. Esialgu kasutati PHENIX-i (49) automaatse konstrueerimise tööriista, et automaatselt konstrueerida osa LH1 järjestusest, kasutades kaarti ja sisendina LH1-α ja LH1-β valgujärjestusi. Valige kõige täielikum LH1 allüksus, eraldage see ja laadige see Coot'i, lisage käsitsi puuduv järjestus ja täpsustage käsitsi kogu struktuuri enne kahe BCls a (BCL) ja spirilloksantiini (CRT) lisamist [vastavalt asjakohastele Rps-idele (17)]. LH1 kompleksi tihedus ja teadaolev karotenoidide sisaldus. Kopeerige täielik LH1 allüksus ja kasutage UCSF Chimera „Docking Map Tool” tööriista, et dokkida külgnev LH1 tihedusega mittemudeli ala ja seejärel täpsustage seda Coot'is; korrake protsessi, kuni kõik LH1 allüksused on modelleeritud. RC-LH114-W struktuuri puhul segmenteeritakse valk USCF kimäärikaardi ülejäänud mittevalgulistest komponentidest, ekstraheerides Cootist jaotamata tiheduse, ning algmudeli loomiseks ja ülejäänud subühikute (valk-W) modelleerimiseks kasutatakse tööriista Autobuild. PHENIXis (49). Lisage saadud mudelile Cootis (48) kõik puuduvad järjestused ja seejärel täpsustage kogu subühikut käsitsi. Ülejäänud jaotamata tihedus sobib lipiidide (CDL = CDL, POPC = 6PL ja POPG = PGT, β-DDM detergendi (LMT) ja UQ10 molekulide (U10) kombinatsiooniga. Kasutage PHENIXi optimeerimist (49) ja käsitsi optimeerimist Cootis (48), et täiustada kogu algmudelit, kuni mudeli statistikat ja sobivuse visuaalset kvaliteeti ei saa enam parandada. Lõpuks kasutage LocScale'i (50), et teravdada kohalikku kaarti, ja seejärel teostage mitu muud jaotamata tiheduse modelleerimise ning automaatse ja käsitsi optimeerimise tsüklit.
Vastavad peptiidid, kofaktorid ja muud lipiidid ja kinoonid, mis on dokitud oma vastavatesse tihedustesse, on näidatud joonistel 1 ja 2. S18 kuni S23. Lõpliku mudeli statistiline teave on esitatud tabelis S1.
Kui ei ole teisiti täpsustatud, koguti UV/Vis/NIR neeldumisspektrid Cary60 spektrofotomeetril (Agilent, USA) 1 nm intervallidega vahemikus 250 nm kuni 1000 nm ja integreerimisajaga 0,1 sekundit.
Lahjendage proovi kvartsküvetis 2 mm teepikkusega kuni A880 väärtuseni 1 ja koguge neeldumisspekter vahemikus 400 kuni 1000 nm. Ringdikroilised spektrid koguti Jasco 810 spektropolarimeetril (Jasco, Jaapan) 1 nm intervallidega vahemikus 400 nm kuni 950 nm skaneerimiskiirusega 20 nm min-1.
Molaarne ekstinktsioonikoefitsient määratakse, lahjendades tuumkompleksi A880-ni ligikaudu 50-ni. Lahjendage 10 μl mahtu 990 μl sidumispuhvris või metanoolis ja koguge kohe neeldumisspekter, et minimeerida BChl lagunemist. Iga metanooliproovi BChl sisaldus arvutati ekstinktsioonikoefitsiendi 54,8 mM-1 cm-1 abil lainepikkusel 771 nm ja määrati ekstinktsioonikoefitsient (51). Tuumkompleksi kontsentratsiooni määramiseks jagage mõõdetud BChl kontsentratsioon 32-ga (RC-LH114-W) või 36-ga (RC-LH116), mida seejärel kasutatakse sama puhvrisse kogutud proovi neeldumisspektri määramiseks. Ekstinktsioonikoefitsient. Iga proovi kohta tehti kolm korduvat mõõtmist ja arvutamiseks kasutati BChl Qy maksimumi keskmist neeldumist. RC-LH114-W ekstinktsioonitegur, mõõdetuna lainepikkusel 878 nm, on 3280±140 mM-1 cm-1, samas kui RC-LH116 ekstinktsioonitegur, mõõdetuna lainepikkusel 880 nm, on 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 kvantifitseeriti vastavalt meetodile (52). Lühidalt, pöördfaasi HPLC (RP-HPLC) viidi läbi Agilent 1200 HPLC süsteemi abil. Lahustage umbes 0,02 nmol RC-LH116 või RC-LH114-W 50 μl 50:50 metanooli ja kloroformi segus, mis sisaldab 0,02% (massiprotsent/mahtprotsent) raud(III)kloriidi, ja süstige eelnevalt tasakaalustatud Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm lahusesse kiirusega 1 ml-1 min-1 temperatuuril 40 °C HPLC lahustis (80:20 metanool:2-propanool) ×25 cm kolonni. Tehke isokraatlik elueerimine HPLC lahustis, et jälgida neeldumist lainepikkustel 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoidid) ja 780 nm (BChl) 1 tunni jooksul. 275 nm kromatogrammil 25,5 minuti juures olev piik integreeriti ja see ei sisaldanud muid tuvastatavaid ühendeid. Integreeritud pindala abil arvutati ekstraheeritud UQ10 molaarne kogus, võttes aluseks kalibreerimiskõvera, mis on arvutatud puhaste standardite süstimise teel vahemikus 0 kuni 5,8 nmol (joonis S14). Iga proovi analüüsiti kolmes korduses ja esitatud viga vastab keskmise standardhälbele.
Valmistati RC-LH1 kompleksi sisaldav lahus, mille maksimaalne Qy neeldumine oli 0,1, lisades 30 μM redutseeritud hobuse südame tsütokroom c2 (Merck, Ühendkuningriik) ja 0 kuni 50 μMUQ2 (Merck, Ühendkuningriik). Iga UQ2 kontsentratsiooni jaoks valmistati kolm 1 ml proovi ja inkubeeriti üleöö pimedas temperatuuril 4 °C, et tagada täielik kohanemine pimedusega enne mõõtmist. Lahus laaditi OLIS RSM1000 modulaarsesse spektrofotomeetrisse, mis oli varustatud 300 nm leegi/500 joone võrega, 1,24 mm sisselaskeava, 0,12 mm keskmise ja 0,6 mm väljalaskeavaga. Proovi fototoru ja võrdlusfotokordisti sissepääsu juurde paigutati 600 nm pikkune läbilaskefilter ergastusvalguse välistamiseks. Neeldumist jälgiti lainepikkusel 550 nm integreerimisajaga 0,15 sekundit. Ergastav valgus kiirgatakse 880 nm M880F2 LED-ist (valgusdiood) (Thorlabs Ltd., Ühendkuningriik) läbi fiiberoptilise kaabli 90% intensiivsusega läbi DC2200 kontrolleri (Thorlabs Ltd., Ühendkuningriik) ja suunatakse valgusallikale 90° nurga all. Mõõtekiir on peegli vastas, et peegeldada tagasi valgus, mida proov algselt ei neeldanud. Jälgige neeldumist 10 sekundit enne 50 sekundilist valgustatust. Seejärel jälgiti neeldumist veel 60 sekundi jooksul pimedas, et hinnata, mil määral kinolool spontaanselt tsütokroom c23+ redutseerib (vt töötlemata andmeid joonisel S8).
Andmeid töödeldi lineaarse algkiiruse sobitamise teel vahemikus 0,5 kuni 10 sekundit (sõltuvalt UQ2 kontsentratsioonist) ja kõigi kolme proovi kiiruste keskmistamise teel igal UQ2 kontsentratsioonil. RC-LH1 kontsentratsiooni, mis arvutati vastava ekstinktsioonikordaja abil, kasutati kiiruse teisendamiseks katalüütiliseks efektiivsuseks, mis joonistati graafikule Origin Pro 2019-s (OriginLab, USA) ja sobitati Michaelis-Menteni mudeliga, et määrata näivad Km ja Kcat väärtused.
Mööduva neeldumise mõõtmiseks lahjendati RC-LH1 proovi ~2 μM-ni IMAC puhvris, mis sisaldas 50 mM naatriumaskorbaati (Merck, USA) ja 0,4 mM terbutiini (Merck, USA). Askorbiinhapet kasutatakse ohverduselektrondidoonorina ja tert-butaklofeeni QB inhibiitorina, et tagada peamise RC doonori redutseerimine (st mitte fotooksüdeerumine) kogu mõõtmisprotsessi vältel. Ligikaudu 3 ml proovi lisatakse spetsiaalselt valmistatud pöörlevasse rakku (läbimõõduga umbes 0,1 m, kiirusega 350 p/min) optilise tee pikkusega 2 mm, et tagada laseriteel oleva proovi piisav aeg pimedaks kohanemiseks ergastusimpulsside vahel. Kasutage ~100 fs laserimpulsse Ti:Safiirlaserisüsteemi (Spectra Physics, USA) võimendamiseks, et ergastada proovi lainepikkusel 880 nm ja kordussagedusel 1 kHz (20 nJ lähiinfrapunakiirguse või 100 nJ nähtava valguse jaoks). Enne andmete kogumist ergastage proovi umbes 30 minutit ergastusvalgusega. Kokkupuude põhjustab QA inaktiveerimise (võimalik, et vähendab QA-d üks või kaks korda). Kuid pidage meeles, et see protsess on pöörduv, sest pärast pikka pimedas kohanemise perioodi naaseb RC aeglaselt QA aktiivsusele. Mõõdeti siirdespektreid Helios spektromeetriga (Ultrafast Systems, USA) viivitusajaga -10 kuni 7000 ps. Andmekogumite grupeerimise lahtivõtmiseks, seejärel ühendamiseks ja standardiseerimiseks kasutati Surface Xplorer tarkvara (Ultrafast Systems, USA). Kombineeritud andmekogumi kasutamiseks lagunemisega seotud diferentsiaalspektrite saamiseks kasutage CarpetView tarkvarapaketti (Light Conversion Ltd., Leedu) või kasutage funktsiooni, mis konvolueerib mitu eksponenti instrumendi vastusega, et sobitada ühe lainepikkusega spektraalne evolutsioon Originis (OriginLab, USA).
Nagu eespool mainitud (53), valmistati fotosünteetiline kile, mis sisaldas LH1 kompleksi, milles puudusid nii RC kui ka perifeerne LH2 antenn. Membraan lahjendati 20 mM Tris-iga (pH 8,0) ja laaditi seejärel kvartsküvetti, mille optiline tee oli 2 mm. Proovi ergastamiseks lainepikkusel 540 nm kasutati 30 nJ laserimpulssi, viivitusajaga -10 kuni 7000 ps. Töödelge andmekogumit nagu on kirjeldatud Rps.pal proovi puhul.
Membraan pelletiseeriti tsentrifuugimisega kiirusel 150 000 RCF 2 tunni jooksul temperatuuril 4 °C ja seejärel suspendeeriti selle neeldumine lainepikkusel 880 nm uuesti 20 mM tris-HCl-is (pH 8,0) ja 200 mM NaCl-is. Lahustage membraan aeglaselt segades 2% (massiprotsent/mahtprotsent) β-DDM-is 1 tund pimedas temperatuuril 4 °C. Proovi lahjendati 100 mM trietüülammooniumkarbonaadis (pH 8,0) (TEAB; Merck, Ühendkuningriik) valgu kontsentratsioonini 2,5 mg ml-1 (Bio-Radi analüüs). Edasine töötlemine viidi läbi varem avaldatud meetodi (54) abil, alustades 50 μg valgu lahjendamisest kokku 50 μl TEAB-ga, mis sisaldas 1% (massiprotsent/mahtprotsent) naatriumlauraati (Merck, Ühendkuningriik). Pärast 60 sekundilist ultraheliga töötlemist redutseeriti see 5 mM tris(2-karboksüetüül)fosfiiniga (Merck, Ühendkuningriik) temperatuuril 37 °C 30 minutit. S-alküülimiseks inkubeeriti proovi 10 mM metüül-S-metüültiometaansulfonaadiga (Merck, Ühendkuningriik) ja lisati see 200 mM isopropanooli lahusest 10 minutiks toatemperatuuril. Proteolüütiline lagundamine viidi läbi, lisades 2 μg trüpsiini/endoproteinaasi Lys-C segu (Promega UK) ja inkubeeriti temperatuuril 37 °C 3 tundi. Lauraadi pindaktiivne aine ekstraheeriti, lisades 50 μl etüülatsetaati ja 10 μl 10% (v/v) LC-kvaliteediga trifluoroäädikhapet (TFA; Thermo Fisher Scientific, Ühendkuningriik) ning segades 60 sekundit vorteksil. Faaside eraldumist soodustati tsentrifuugimisega kiirusel 15 700 RCF 5 minutit. Tootja protokolli kohaselt kasutati peptiidi sisaldava alumise faasi ettevaatlikuks aspireerimiseks ja soolatutamiseks C18 tsentrifuugikolonni (Thermo Fisher Scientific, Ühendkuningriik). Pärast vaakumtsentrifuugimisega kuivatamist lahustati proov 0,5% TFA-s ja 3% atsetonitriilis ning 500 ng analüüsiti nanoflow RP-kromatograafia ja massispektromeetria abil, kasutades eelnevalt üksikasjalikult kirjeldatud süsteemiparameetreid.
Kasutage valkude identifitseerimiseks ja kvantifitseerimiseks MaxQuant v.1.5.3.30 (56), et otsida Rps. palustris proteoomide andmebaasist (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Massispektromeetria proteoomika andmed on deponeeritud ProteomeXchange Alliance'is PRIDE partnerrepositooriumi (http://proteomecentral.proteomexchange.org) kaudu andmestiku identifikaatori PXD020402 all.
RPLC ja elektropihustus-ionisatsiooni-massispektromeetria analüüsiks valmistati RC-LH1 kompleks metsiktüüpi Rps-ist. Varem avaldatud meetodit (16) kasutades oli palustrise rakkudes toodetud valgu kontsentratsioon 2 mg ml-1 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl ja 0,03% (massi/mahu) β- (Bio-Radi analüüs) DDM-is. Tootja protokolli kohaselt kasutati 2D puhastuskomplekti (GE Healthcare, USA), et ekstraheerida sadestamismeetodil 10 μg valku ja lahustada sade 20 μl 60% (v/v) sipelghappes (FA), 20% (v/v) atsetonitriilis ja 20% (v/v) vees. Viit mikroliitrit analüüsiti RPLC (Dionex RSLC) ja massispektromeetria abil (Maxis UHR-TOF, Bruker). Eraldamiseks temperatuuril 60 °C ja kiirusel 100 μlmin -1 kasutage MabPac 1,2 × 100 mm kolonni (Thermo Fisher Scientific, Ühendkuningriik), gradientelueerimisega 85% (v/v) lahustit A [0,1% (v/v) FA ja 0,02% (V/v) TFA vesilahus] kuni 85% (v/v) lahustit B [0,1% (v/v) FA ja 0,02% (v/v) 90% (v/v) atsetonitriili TFA-s]. Kasutades standardset elektropihustus-ionisatsiooniallikat ja vaikeparameetreid enam kui 60 minuti jooksul, saavutab massispektromeeter laiusvahemiku 100 kuni 2750 m/z (massi ja laengu suhe). ExPASy bioinformaatika ressursiportaali FindPept tööriista (https://web.expasy.org/findpept/) abil kaardistage massispekter kompleksi allüksusteks.
Rakke kasvatati 72 tundi 100 ml NF-madala (10 μMm-2 s-1), keskmise (30 μMm-2 s-1) või kõrge (300 μMm-2 s-1) valguse käes. M22 söötmes (M22 söötmes, milles ammooniumsulfaat on välja jäetud ja naatriumsuktsinaat on asendatud naatriumatsetaadiga) kasutati 100 ml keeratava korgiga pudelit (23). Viie 30-sekundilise tsükli jooksul lüüsiti rakke 0,1 mikroni suuruste klaashelmetega mahuvahekorras 1:1 ja jahutati jääl 5 minutit. Lahustumatu aine, purunemata rakud ja klaashelmed eemaldati tsentrifuugimisega lauamikrotsentrifuugis kiirusel 16 000 RCF 10 minutit. Membraan eraldati Ti 70.1 rootoris 100 000 RCF-ga 20 mM tris-HCl-is (pH 8,0) 40/15% (massiprotsent) sahharoosi gradiendiga 10 tunni jooksul.
Nagu meie eelmises töös kirjeldatud, viidi PufW-l His-märgise immunodetektsioon (16). Lühidalt, puhastatud tuumkompleks (11,8 nM) või sama kontsentratsiooniga RC-d sisaldav membraan (määratud oksüdeerimise teel, lahutades redutseeritud diferentsiaalspektri ja sobitades koormuse värvitud geelil) 2x SDS-i laadimispuhvris (Merck, Ühendkuningriik) kaks korda lahjendatult. Valgud eraldati replika 12% bis-tris NuPage geelil (Thermo Fisher Scientific, Ühendkuningriik). Geeli värviti Coomassie Brilliant Blue'ga (Bio-Rad, Ühendkuningriik), et laadida ja visualiseerida RC-L subühik. Teisel geelil olev valk viidi immunoanalüüsiks metanooliga aktiveeritud polüvinülideenfluoriidi (PVDF) membraanile (Thermo Fisher Scientific, Ühendkuningriik). PVDF membraan blokeeriti 50 mM tris-HCl-is (pH 7,6), 150 mM NaCl-is, 0,2% (v/v) Tween-20-s ja 5% (w/v) lõssipulbris ning inkubeeriti seejärel 4 tundi His-vastase primaarse antikehaga (lahjendatud antikeha puhvris [50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl ja 0,05% (v/v) Tween-20] 1:1000 A190-114A-s, Bethyl Laboratories, USA). Pärast 3-kordset 5-minutilist pesemist antikehapuhvris ühendati membraan mädarõikaperoksidaasi (Sigma-Aldrich, Ühendkuningriik) hiirevastase sekundaarse antikehaga (lahjendatud antikehapuhvris vahekorras 1:10 000). Inkubeeriti detekteerimise võimaldamiseks (5 minutit pärast 3 pesu antikehapuhvris), kasutades WESTAR ETA C 2.0 kemoluminestsentssubstraati (Cyanagen, Itaalia) ja Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Ühendkuningriik).
Joonistades iga värvitud geeli või immunoanalüüsi raja intensiivsusjaotuse, integreerides piigi aluse pindala ja arvutades RC-L (värvitud geel) ja valgu-W (immunoanalüüs) intensiivsussuhet ImageJ (57) abil, töödelge pilti. Need suhted teisendati molaarsuheteks, eeldades, et RC-L ja valgu-W suhe puhtas RC-LH114-W proovis oli 1:1, ja normaliseerides kogu andmekogumi vastavalt.
Selle artikli lisamaterjalide saamiseks külastage palun veebilehte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1.
See on avatud juurdepääsuga artikkel, mis levitatakse Creative Commonsi omistuslitsentsi tingimuste kohaselt. Artiklit lubatakse piiramatult kasutada, levitada ja reprodutseerida mis tahes meediumis tingimusel, et algsele teosele viidatakse nõuetekohaselt.
Märkus: Palume teil oma e-posti aadressi esitada ainult selleks, et lehele soovitatud inimene teaks, et soovite talle e-kirja näidata ja et see pole rämpspost. Me ei salvesta ühtegi e-posti aadressi.
Selle küsimuse abil kontrollitakse, kas olete külastaja, ja takistatakse automaatset rämpsposti saatmist.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Reaktsioonikeskuses asuva valguslõksu 1 kompleksi kõrge eraldusvõimega struktuur annab uusi teadmisi kinooni dünaamikast.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Reaktsioonikeskuses asuva valguslõksu 1 kompleksi kõrge eraldusvõimega struktuur annab uusi teadmisi kinooni dünaamikast.
©2021 American Association for the Advanced of Science of Science. kõik õigused kaitstud. AAAS on HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ja COUNTER partner. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.